莫莊非/編譯

借助定向演化的力量，科學(xué)家距離開發(fā)能穿越

人類血腦屏障以提供基因治療的病毒載體又近了一步。

血腦屏障（BBB）是調(diào)控物質(zhì)進(jìn)出大腦的細(xì)胞堡壘。它確保大腦能夠獲取關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)保護(hù)其免受病原體和毒素侵害。另一方面，血腦屏障卻也阻礙了許多有潛力的治療方法。不過眼下，基因遞送載體系統(tǒng)升級(jí)換代，有望很快帶來高效療法。

科學(xué)家正在研究脂質(zhì)納米顆粒和其他遞送載體，但腺相關(guān)病毒（AAV）載體因其靶向能力超強(qiáng)，能在非分裂細(xì)胞內(nèi)持久表達(dá)而對(duì)人類無致病性，仍是較好的體內(nèi)基因治療遞送平臺(tái)。

美國賓夕法尼亞大學(xué)基因和細(xì)胞療法研究員貝弗利 · 戴維森（Beverly Davidson）表示：“可以肯定地說，如果我們能將AAV送達(dá)目的地，那么這就是種一勞永逸的療法?！?/p>

越來越多基于AAV的基因療法獲批，還有數(shù)百種正在臨床研發(fā)中。然而，許多為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而開發(fā)的療法需要侵入性措施，包括直接注射大腦或腰椎穿刺，這也會(huì)限制療法作用的范圍。

美國加州理工學(xué)院神經(jīng)科學(xué)家維維安娜 · 格拉迪納魯（Viviana Gradinaru）表示：“理論上，脈管系統(tǒng)將是最適合療法輸送的‘高速公路，原因很簡(jiǎn)單，人腦有600多公里長的脈管系統(tǒng)。”這個(gè)廣泛分布的動(dòng)脈網(wǎng)絡(luò)為大腦近1000億個(gè)神經(jīng)元提供服務(wù)，但要沿著大腦的脈管高速公路行進(jìn)，靜脈注射的AAV必須穿過血腦屏障的邊界管制。我們?nèi)绻私膺@個(gè)高度選擇性門戶的規(guī)律，就能從該基本生物學(xué)原理中獲益，讓療法進(jìn)入大腦。

過去十年間，在規(guī)律還沒有揭示的情況下，格拉迪納魯領(lǐng)銜的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了以驅(qū)動(dòng)基因療法傳遞至大腦的AAV工程策略。

載體選擇

腺相關(guān)病毒的兩大基本組成是病毒DNA及其蛋白質(zhì)外殼（又稱衣殼）。為將病毒轉(zhuǎn)化為基因療法，科學(xué)家用需要遞送的基因替換病毒的DNA，并控制基因表達(dá)?？茖W(xué)家已經(jīng)確定許多遺傳性疾病的遺傳原因，不過明確所需基因是一方面，安全遞送基因貨物是另一方面——這方面工作難度很大，其關(guān)鍵在于病毒衣殼。除了保護(hù)病毒攜帶的基因組，這種二十面體結(jié)構(gòu)的籠形蛋白還決定著病毒通過與細(xì)胞表面受體的相互作用進(jìn)入哪些組織和細(xì)胞?？茖W(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種天然存在的AAV血清型，許多血清型都能以不同效率感染腦細(xì)胞，不過只有AAV9和AAVrh.10（較少被研究）能穿過血腦屏障。

脊髓性肌萎縮基因療法Zolgensma由諾華制藥研發(fā)——一種在兩歲以下兒童中取得巨大成功、已獲美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的AAV9療法——能從根本上治療脊髓性肌萎縮癥。然而，AAV9并非科學(xué)家理想中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向基因治療的萬能平臺(tái)。大腦發(fā)育的變化伴隨病毒對(duì)不同細(xì)胞類型傾向性的變化。一項(xiàng)非臨床研究表明，雖然該病毒能穿過血腦屏障，但它優(yōu)先靶向新生小鼠的神經(jīng)元和成年小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

鑒于上述變化，給兒童用的劑量對(duì)成年人來說就只能影響大腦神經(jīng)元的一小部分，而增加劑量又會(huì)超出安全極限。尤其令人擔(dān)憂的是該病毒對(duì)肝臟的偏愛。

美國博德研究所分子生物學(xué)家本 · 德弗曼（Ben Deverman）指出：“你如果查看以該劑量傳遞給單個(gè)肝細(xì)胞的載體基因組數(shù)量，就會(huì)發(fā)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)數(shù)百個(gè)病毒基因組，但平均而言，給大腦的遞送量遠(yuǎn)少于每個(gè)細(xì)胞攜帶一個(gè)病毒基因組的水平。”

為提高遞送水平，同時(shí)使AAV遠(yuǎn)離脆弱區(qū)域而直指目標(biāo)器官或細(xì)胞，德弗曼、格拉迪納魯和戴維森等科學(xué)家開發(fā)了病毒衣殼工程策略，促使新的AAV模型投入生產(chǎn)線。

創(chuàng)建衣殼

衣殼工程有兩種主要方法。格拉迪納魯表示：“如果了解規(guī)律，就可以根據(jù)規(guī)律進(jìn)行設(shè)計(jì)?！睂?duì)血腦屏障上特定受體的了解，令科學(xué)家能通過合理設(shè)計(jì)編輯衣殼，但科學(xué)家只識(shí)別出了其中的幾個(gè)。

十多年前，格拉迪納魯認(rèn)為，在不了解規(guī)律的情況下，設(shè)計(jì)AAV的最佳方式是利用一種機(jī)制未知的方法。這一工程解決方案的靈感來自她與同事弗朗西斯 · 阿諾德（Frances Arnold）的交流，后者曾憑借在酶的定向演化方面的工作而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。

格拉迪納魯說道：“我們意識(shí)到，定向演化可以解決衣殼方面的問題，因?yàn)槟銦o須理解其生物學(xué)規(guī)律即能取得進(jìn)展?！钡@方面工作離不開一個(gè)理想的模板和嚴(yán)格的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

格拉迪納魯團(tuán)隊(duì)的第一步就是聚焦AAV9。

當(dāng)病原體與宿主相互作用時(shí)，它通過演化提高自身毒力、靶向能力和生存能力。宿主數(shù)量越多，病原體就有更多演化機(jī)會(huì)，不斷出現(xiàn)的SARS-CoV-2變體就證明了這一點(diǎn)。格拉迪納魯指出：“這正是被我們運(yùn)用于AAV9工作的經(jīng)驗(yàn)。”研究人員發(fā)現(xiàn)，他們可以利用定向演化，通過重復(fù)生成、測(cè)試和選擇表現(xiàn)出特定特征（例如增強(qiáng)的靶向能力）的病毒載體來加快進(jìn)化過程。

2010年代初，德弗曼作為博士后加入了加州理工學(xué)院格拉迪納魯團(tuán)隊(duì)，并在那里開發(fā)出一條用于創(chuàng)建和測(cè)試新型AAV的管線。為創(chuàng)制新衣殼庫，德弗曼編輯了AAV基因組的一部分，其中包含一段7個(gè)氨基酸的序列，他發(fā)現(xiàn)這些氨基酸能在稍作改變后仍形成衣殼。通過編輯這一微小病毒結(jié)構(gòu)，德弗曼和同事產(chǎn)出許多衣殼并進(jìn)行測(cè)試。用德弗曼的話說，借助蛋白質(zhì)工程，“可能創(chuàng)建得到的衣殼數(shù)量多過宇宙中的恒星數(shù)，雖然其中大多數(shù)無法形成衣殼，但最后成功的小部分依然數(shù)量龐大，我們永遠(yuǎn)測(cè)試不完”。

研究團(tuán)隊(duì)選擇了那些能最有效地將基因貨物遞送至大腦的理想衣殼。為針對(duì)性地選出能成功穿過血腦屏障的病毒，德弗曼將衣殼庫注射到Cre轉(zhuǎn)基因小鼠中，從它們腦組織中分離出DNA，接著對(duì)成功感染Cre表達(dá)細(xì)胞的病毒基因組進(jìn)行測(cè)序，然后使用這些序列生成第二個(gè)衣殼庫，用于另一輪測(cè)試。該管線產(chǎn)出了多種病毒變體，但德弗曼和同事決定推進(jìn)其中最成功的AAV-PHP.B，將其與AAV9作直接對(duì)比。在該實(shí)驗(yàn)中，他們將綠色熒光蛋白加載到每種病毒中，再通過靜脈注射施予小鼠，然后比較綠色熒光蛋白分子在大腦中的遞送效率。結(jié)果顯示，AAV-PHP.B的基因轉(zhuǎn)移效益比標(biāo)準(zhǔn)AAV9高至少40倍。

德弗曼表示：“這讓大家對(duì)AAV-PHP.B的潛力充滿興趣?！眻F(tuán)隊(duì)其他研究人員繼續(xù)開發(fā)工程化AAV——其向大腦遞送基因的效率比標(biāo)準(zhǔn)AAV提高400倍。

格拉迪納魯表示：“上述工作是我們?cè)诓涣私鈾C(jī)制的情況下設(shè)計(jì)AAV的第一章?！贝送猓麄冞€完成了AAV工程的另外幾個(gè)章節(jié)。不過難題也隨之而來。

物種特異性

當(dāng)其他科學(xué)家開始使用這種新衣殼時(shí)，一個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)引起關(guān)注。實(shí)驗(yàn)顯示，AAV-PHP.B在狨猴和恒河猴等非人靈長類動(dòng)物體內(nèi)的遞送效率有限，這表明衣殼與血腦屏障相互作用的方式存在潛在物種差異。此外，衣殼的高效率似乎只在C57BL/6J品系實(shí)驗(yàn)小鼠身上展現(xiàn)。

德弗曼團(tuán)隊(duì)和其他學(xué)者利用上述差異探究了工程AAV在C57BL/6J小鼠品系中穿過血腦屏障的機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)一種新受體，即淋巴細(xì)胞抗原6家族成員A（LY6A）。由此可知，缺乏功能性LY6A的物種將表現(xiàn)出有限的AAV-PHP.B表達(dá)（如果有的話）。

非人靈長類動(dòng)物體在演化層面與人類相似，因此是測(cè)試療法的理想模型。然而，實(shí)驗(yàn)用的非人靈長類動(dòng)物供應(yīng)少、成本高，選擇過程需深思熟慮。當(dāng)格拉迪納魯開始在非人靈長類動(dòng)物身上測(cè)試病毒載體時(shí)，她仍需依賴AAV在小鼠中的定向演化。

格拉迪納魯想跳過小鼠這個(gè)中間環(huán)節(jié)，從生成衣殼庫直接邁向測(cè)試非人靈長類動(dòng)物體內(nèi)的工程變體，這就需要運(yùn)用新方法。由于目前無法獲得Cre轉(zhuǎn)基因狨猴，因此無法使用類似的Cre驅(qū)動(dòng)非人靈長類動(dòng)物系統(tǒng)產(chǎn)生選擇壓力。于是她的團(tuán)隊(duì)使用從成功進(jìn)入大腦的病毒變體中收集到的下一代測(cè)序數(shù)據(jù)來構(gòu)建遞送網(wǎng)絡(luò)。他們得到了最高效的衣殼，但并未只選擇它們進(jìn)行第二輪測(cè)試，因?yàn)檫@類衣殼進(jìn)入大腦的機(jī)制可能只適用于狨猴。在第二輪圍繞新生恒河猴（2500萬年前與人類分離）的測(cè)試中，研究團(tuán)隊(duì)選用了多種AAV開展工作。

最后AAV.CAP-Mac脫穎而出。格拉迪納魯?shù)热烁倪M(jìn)此變體，并在多種靈長類動(dòng)物和培養(yǎng)的人類神經(jīng)元中做進(jìn)一步測(cè)試，結(jié)果顯示它在整個(gè)大腦范圍內(nèi)的基因傳遞效率更高。

上述關(guān)于非人靈長類動(dòng)物的研究使AAV測(cè)試離人類更近，也證明可以有傾向性地引導(dǎo)AAV進(jìn)入大腦。格拉迪納魯團(tuán)隊(duì)僅改變肽序列中的一兩個(gè)氨基酸，就使得AAV偏向內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)元而非肝臟。研究人員能通過提高特異性來降低劑量并減少脫靶毒性。

戴維森說道：“在我看來，真正的障礙在于，怎樣使它們完全不會(huì)靶向大腦以外的器官?！?/p>

道路規(guī)則

雖然機(jī)制未知，科學(xué)家已生成數(shù)千種新的AAV，它們?cè)谌矸秶鷥?nèi)表現(xiàn)出不同的基因遞送特征。格拉迪納魯說道：“我們可以利用這些AAV庫來探究作用機(jī)制，這是該領(lǐng)域前所未有的機(jī)會(huì)。”

德弗曼將關(guān)于小鼠大腦中LY6A門戶的發(fā)現(xiàn)稱作自己團(tuán)隊(duì)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。“要知道我們?cè)O(shè)計(jì)的AAV穿越血腦屏障時(shí)的效率比AAV9高100倍以上，但我們不知道為什么?！痹诘玫叫掳l(fā)現(xiàn)之前，德弗曼等人不確定他們?cè)O(shè)計(jì)的衣殼是使用了與AAV9相同的受體而更好，還是能夠結(jié)合一個(gè)完全不同的受體導(dǎo)致。LY6A的發(fā)現(xiàn)表明，在針對(duì)衣殼開展耗時(shí)且燒錢的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)前，他們能測(cè)試工程化AAV結(jié)合特定已知蛋白質(zhì)的能力。

德弗曼和同事最近將這一概念轉(zhuǎn)化為高通量蛋白質(zhì)檢測(cè)。為了選擇與LY6A結(jié)合的衣殼，他們將大型AAV庫與附著于純化蛋白上的磁珠懸浮液混合，并提取黏附于磁珠上的衣殼。結(jié)果如預(yù)期，他們確定了AAV-PHP.B家族的代表。德弗曼預(yù)測(cè)，他們可以使用這種方法從新靶點(diǎn)開發(fā)衣殼。為測(cè)試這一點(diǎn)，他們?yōu)長Y6家族成員C1（LY6C1，所有小鼠品系中一致表達(dá)）開發(fā)了另一種蛋白珠制劑，并發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)結(jié)合LY6C1的序列。當(dāng)他們?cè)谛∈笊砩线M(jìn)行測(cè)試時(shí)，數(shù)百個(gè)衣殼成功進(jìn)入大腦并感染神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。德弗曼表示：“這太棒了，它確實(shí)超出了我們的預(yù)期?！?/p>

這種方法也比較靈敏。通過體內(nèi)篩選，研究人員將數(shù)千個(gè)衣殼變體丟向大腦，然后收回通過血腦屏障的衣殼。但德弗曼也指出，現(xiàn)階段AAV庫過于多樣化，很難收回每個(gè)AAV，而這就會(huì)限制重現(xiàn)性。

德弗曼表示：“如果將相同的AAV庫放入三只小鼠，就可從每只小鼠處獲得10 000個(gè)獨(dú)特序列，且?guī)缀鯖]有重疊，因?yàn)槟闶菑臄?shù)千萬個(gè)衣殼中進(jìn)行采樣和抓取的?！?/p>

通過更新的方法，研究團(tuán)隊(duì)不斷收到具有更大多樣性的衣殼，然后使用這些序列來訓(xùn)練生成機(jī)器學(xué)習(xí)模型，從而預(yù)測(cè)更多具有相同功能的序列。德弗曼表示：“進(jìn)入第二輪篩選后，我們已經(jīng)可以使序列成熟，并探索比第一輪更多的內(nèi)容?！?/p>

格拉迪納魯還使用新的計(jì)算和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具來發(fā)現(xiàn)新型AAV。在探究某些具備增強(qiáng)大腦表達(dá)的AAV變體穿過血腦屏障的機(jī)制時(shí)，兩個(gè)目標(biāo)突然出現(xiàn)：已經(jīng)確定的LY6C1和另一個(gè)更不尋常的蛋白——碳酸酐酶IV（CA-IV）。

格拉迪納魯說道：“碳酸酐酶IV是人體所擁有的一種酶，在血腦屏障處含量豐富，能調(diào)節(jié)血液pH值。此外，它在演化上是保守的——老鼠有它，人類也有?！?/p>

酶上有一些位點(diǎn)是完全保守的，另一些位點(diǎn)則有顯著的序列修飾，因此根據(jù)工程化AAV的具體結(jié)合位置，它可能在不同物種之間產(chǎn)生相似或不同的效應(yīng)。格拉迪納魯團(tuán)隊(duì)想通過更先進(jìn)的方法讓工程化AAV更具靶向性，于是轉(zhuǎn)向AlphaFold——一款基于人工智能的蛋白質(zhì)折疊預(yù)測(cè)工具。為此，他們讓AlphaFold學(xué)習(xí)碳酸酐酶IV結(jié)合袋（binding pocket）以及工程化AAV中發(fā)現(xiàn)的肽。

格拉迪納魯說道：“AlphaFold告訴我們哪些藥物可以在嚙齒類動(dòng)物、獼猴中發(fā)揮作用，而無須在人體中進(jìn)行測(cè)試?！?/p>

考慮到物種特異性的潛力，在非人靈長類動(dòng)物中演化的AAV可能無法在人類中很好地發(fā)揮作用。格拉迪納魯?shù)腁lphaFold預(yù)測(cè)工具和德弗曼的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)等方法可提供信息，幫助我們開發(fā)更多人類特異性基因遞送載體和可穿過大腦的生物制劑。

科學(xué)家正更深入理解健康和病變的腦血管系統(tǒng)，而這可能為新型AAV衣殼的機(jī)制選擇提供新的靶點(diǎn)。此外，進(jìn)入大腦只是一個(gè)障礙?？茖W(xué)家可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)穿越血腦屏障的衣殼以滿足各種靶向需求——只要衣殼在大腦內(nèi)移動(dòng)，就能實(shí)現(xiàn)更大特異性。

德弗曼說道：“在接下來幾年里，該領(lǐng)域?qū)W(xué)到很多關(guān)于何種類型受體能介導(dǎo)AAV胞移作用的知識(shí)。我覺得我們即將取得一些重大進(jìn)展?！?/p>

許多尚無有效療法的腦部疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)肌肉疾病和溶酶體貯積病，皆可受益于載體工程的進(jìn)步。

資料來源 The Scientist

本文作者丹妮爾 · 格哈德（Danielle Gerhard）博士在耶魯大學(xué)獲得心理學(xué)和行為神經(jīng)科學(xué)博士學(xué)位，并在威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院擔(dān)任神經(jīng)科學(xué)和精神病學(xué)博士后研究職位