姚春馨　梁明泰　劉家迅　王暉　陳霞　田果廷

摘要：采用田間覆土栽培試驗，設(shè)置6個Se濃度（0、50、100、200、300、400μg/g）處理，分別記為CK、Se50、Se100、Se200、Se300、Se400，研究外源硒對云南白靈芝生長發(fā)育、重金屬積累、生物活性成分含量及其DNA甲基化特征的影響。結(jié)果表明，與CK相比，外源Se對子實體柄長和菌蓋大?。M徑、縱徑）無顯著影響，但能顯著降低菌蓋厚度：隨著Se施用水平提高，菌絲生長速率和子實體硒含量均呈先增后降的趨勢，生物量呈先降后增再降的趨勢。子實體重金屬含量（As、Cd、Ph、Hg）隨Se濃度增加呈持續(xù)降低趨勢，線性分析也表明，重金屬含量與Se施用濃度均呈顯著負(fù)相關(guān)。施Se增加了子實體多糖、粗蛋白、黃酮及總氨基酸含量，其中，多糖、黃酮含量在Se400處理下最高，總氨基酸、粗蛋白含量分別在Se200、Se300處理下最高。HPLC測定分析表明，與CK相比，Se300提高了靈芝酸A、靈芝酸DM、靈芝酸F及靈芝酮三醇為主的三萜酸組分，其總?cè)扑岷枯^其他處理提高2.93%-25.54%。敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析（MSAP）結(jié)果顯示，Se300較CK、Se400相比具有較高的未甲基化位點比例和較低的甲基化位點比例。綜上，施用外源硒可促進(jìn)早期菌絲生長，提高子實體生物量累積，改善子實體重金屬安全性能和生物活性成分品質(zhì)，改變DNA甲基化比例，且以300μg/g施用濃度的整體效果最佳，其子實體產(chǎn)量較對照顯著提高11.36%。

關(guān)鍵詞：白靈芝；硒；農(nóng)藝性狀：重金屬含量；品質(zhì)；DNA甲基化

中圖分類號：S567.31 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0106-09

靈芝（Ganoderma sp.）是擔(dān)子菌門的一種食藥用真菌，其子實體和孢子具有豐富的多糖、氨基酸及三萜類物質(zhì)，市場開發(fā)前景廣闊。研究表明，靈芝在降血脂、抗氧化、除風(fēng)濕等方面均具有顯著療效，同時也是抗癌和抗病毒藥物的重要成分之一，目前已被廣泛應(yīng)用于藥膳、保健品及飼料添加劑，表現(xiàn)出可觀的經(jīng)濟(jì)和藥理價值。白靈芝（Ganoderma leucocontextum）又稱為白肉靈芝、藏白靈芝、藏靈芝，其菌落絨毛狀蓬松、菌肉潔白，是稀缺的靈芝種類，主要分布于我國西南的高海拔地區(qū)，為典型的區(qū)域性靈芝種類之一。在云南省，白靈芝主要生長在海拔2500m以上區(qū)域，是獨特的低溫型靈芝種類，已成為云南食藥用菌的重要銘牌之一。近年來，市場需求使得白靈芝價格連年攀高，野生資源無序采摘導(dǎo)致野生白靈芝日益枯絕，人工栽培成為解決白靈芝資源短缺的重要途徑。目前，白靈芝主要采用段木覆土或袋栽覆土栽培，但覆土引起的重金屬累積嚴(yán)重影響著食藥安全性。

硒（Se）是生物體所必需的多功能生物營養(yǎng)元素，同時也是谷胱甘肽過氧化物酶、硒蛋白質(zhì)和一些揮發(fā)性硒化合物的核心樞紐物質(zhì)，在抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等方面具有重要作用。自然系統(tǒng)中，硒同時以負(fù)Ⅱ價[Se（-Ⅱ）]、正Ⅳ價[Se（Ⅳ）]、正Ⅵ價[Se（Ⅵ）]和零價[Se（0）]的無機(jī)、有機(jī)形態(tài)存在：Se在土壤中的存在形態(tài)與土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、氧化還原電位、酸堿度、氣候等因素密切相關(guān)，不同價態(tài)的硒其有效性亦存在較大差異。最常見的無機(jī)硒化合物為亞硒酸鈉（Na2SeO3）、硒酸鈉（Na2SeO4）和硒化氫（H2Se）。對生物體而言，有機(jī)硒低毒性但其生物促生效果較弱。與有機(jī)態(tài)相比，無機(jī)態(tài)硒具有較高的生理毒性，難以快速吸收，但其生物利用度往往較好。因此，目前以Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）為主的外源硒已逐漸應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，并且在重金屬修復(fù)、鹽脅迫、干旱脅迫及作物品質(zhì)提升等方面表現(xiàn)出，優(yōu)良效果。

富硒功能性食品的研究已越來越成為研究的熱點。有研究表明，大型食用菌（如金針菇、平菇、香菇、靈芝等）具有良好的Se積累和轉(zhuǎn)化能力，可發(fā)展為理想的富硒食品。目前，對富硒食用菌的研究主要集中在通過向固體基質(zhì)中添加無機(jī)硒化合物以研究硒代謝物的變化特征和潛在生物活性，而對Se在實際栽培過程中的質(zhì)量安全研究較少。不同的生物體種類對Se的耐受、吸收、轉(zhuǎn)化及利用能力不同，篩選適宜Se用量成為Se施用的必要前提。此外，相比于其他食藥用菌，白靈芝的馴化選育工作開展時間較晚，目前關(guān)于白靈芝高效優(yōu)質(zhì)栽培的探索仍處于起步階段，對外源礦質(zhì)養(yǎng)分吸收與利用的研究更是鮮有涉及?；诖?，本研究以Na2SeO3為硒源，探索Se（Ⅳ）不同用量對白靈芝重金屬安全及生物活性成分品質(zhì)的影響，并結(jié)合胞嘧啶堿基對DNA甲基化的響應(yīng)特征確定最佳的硒施用量，以期為硒應(yīng)用于白靈芝的人工培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗概況及材料

試驗于2021年4月-2022年2月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所科研基地進(jìn)行。白靈芝品種為課題組自主選育的“云白靈芝l號”[鑒（食用菌）2022070號]。栽培基質(zhì)：硬雜木屑86%、麥麩10%、豆粕2%、碳酸鈣1%、石膏粉1%，含水量60%，pH值8.0。亞硒酸鈉（Na2SeO3）購自默克化學(xué)試劑公司。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置硒單因素6水平完全隨機(jī)試驗，Na2SeO3施用水平分別為0、50、100、200、300、400μg/g，分別記為CK、Se50、Sel00、Se200、Se300、Se400。其中上述μg/g為Na2SeO3用量（μg）與栽培基質(zhì)干重（g）之比。

基質(zhì)配料基于常規(guī)常壓滅菌，冷卻后采用聚乙烯菌料袋裝袋，菌料袋規(guī)格17cm×20cm×0.005cm，每袋裝基質(zhì)510g。采用單頭接菌法接入白靈芝菌種，垂直擺放于濕度80%、溫度18-23℃的培菌室黑暗培養(yǎng)。菌絲長滿袋后轉(zhuǎn)移至水簾出菇棚進(jìn)行開袋覆土，每處理設(shè)置3區(qū)，每區(qū)30袋。將Na2SeO溶解于無菌水，配制成400mg/mL水溶液，相應(yīng)Se處理則基于該母液進(jìn)行稀釋處理。后續(xù)白靈芝的培養(yǎng)管理參考姚春馨等研究中所述。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 白靈芝農(nóng)藝性狀測定

采收期每小區(qū)隨機(jī)挑選5-10朵長勢均勻的成熟子實體，用直尺測量菌蓋橫徑和縱徑，用電子游標(biāo)卡尺測量菌蓋厚度，用數(shù)字尺測量菌柄長度。每個小區(qū)隨機(jī)選擇3朵鮮靈芝，測定子實體鮮重，并于65℃下烘干稱取干重，折算每個菌袋子實體鮮重和干重。菌絲生長速率采用定期劃線法測定。

1.3.2 白靈芝子實體硒及重金屬含量測定

白靈芝子實體中的重金屬包含鎘（Cd）、砷（As）、鉛（Pb）、汞（Hg）。準(zhǔn)確稱取子實體200.00mg于微波消解管中，加入濃硝酸5.0mL，微波消解儀（CEM Mars6，Hanson Research Co.，Ltd. USA）消解45min，然后在140℃電熱板上趕酸縮至1mL備用。參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》中的方法，用超純水分別將鎘（Cd）、砷（As）、鉛（Pb）、汞（Hg）標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行質(zhì)控處理，平行誤差＜5%，重金屬回收率>95%。采用電感耦合等離子體光譜儀（ICP-MS，ICAPQc，ThermoFisher Scientific，USA）測定子實體中Cd、As、Pb、Hg和Se含量。

1.3.3 白靈芝子實體生物活性成分含量測定

白靈芝子實體多糖含量測定參考《食用菌中粗多糖含量的測定》中的方法進(jìn)行；粗蛋白含量測定參考《食用菌中粗蛋白含量的測定》中的方法進(jìn)行：總氨基酸含量測定參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》中的方法進(jìn)行；黃酮含量采用亞硝酸鈉浸提、硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定；三萜酸含量測定參考2020版《中國藥典》中靈芝三萜含量測定方法進(jìn)行：靈芝酸組分采用高效液相色譜（HPLC）法測定，具體步驟見吳鴻雪等研究中所述。

1.3.4 白靈芝DNA甲基化測定

子實體雛形期，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對子實體基因組DNA進(jìn)行快速提取，詳細(xì)步驟參考Hua等研究中所述。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，Nanodrop 2000分光光度計（Thermo SCientific，Wilmington，DE）分析其純度和質(zhì)量，純化后的DNA用于后續(xù)甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析（MSAP）。

MSAP分析中酶內(nèi)切、連接、預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)參照李忠愛等研究中所述，即采用EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ/HpaⅡ組合酶作為限制性內(nèi)切酶及接頭，連接接頭和引物序列，采用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物、接頭及擴(kuò)增引物，引物信息見表1。通過PCR儀（CFX96Touch BIO-RAD1，ABI，USA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合液2xPCR masterMix[B639295-0005，生工生物工程（上海）股份有限公司]擴(kuò)增。PCR程序：95℃5min：95℃30s，58℃40 s，72℃90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物采用溴化乙錠染色，然后于50bp分子量標(biāo)記下采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后在Gelscanner軟件中分析MSAP凝膠圖像，并在兩組中識別每個樣品獲得的分子片段。將得到的峰圖轉(zhuǎn)化為條帶，有峰位點“Yes”記為“1”，無峰位點“No”記為“0”，根據(jù)條帶信息進(jìn)行相應(yīng)的甲基化狀態(tài)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2010對相關(guān)試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗，用Microsoft Excel 2010、Origin 2021軟件制圖。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硒對白靈芝生長發(fā)育的影響

由表2可知，除Se400處理外，其他處理菌絲生長速率均高于CK，其中Se100處理最高，顯著高于其他處理。菌柄長表現(xiàn)為Se400＜CK＜Se200＜Se100＜Se300＜Se50，處理問差異不顯著。Se50、Se100處理菌蓋橫徑較大，分別較Se400顯著增加12.80%、12.44%，而CK、Se200、Se300與其他處理均無顯著差異。Se100處理菌蓋縱徑最大，為6.16cm，Se300處理次之，二者均與CK無顯著差異且皆顯著大于Se50、Se200、Se400處理。CK菌蓋厚度最大，施硒處理較其降低7.66%-24.26%，其中Se50處理顯著小于CK。各處理間子實體鮮重表現(xiàn)為Se400＜Se100＜CK＜Se300

2.2 不同濃度硒對白靈芝子實體硒及重金屬含量的影響

由表3可知，成熟期白靈芝子實體中砷（As）、鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）含量表現(xiàn)為Hg＜As＜Pb、Cd，且均以CK含量最高。其中，CK子實體As、Pb、Hg含量顯著高于其他處理，各處理間均表現(xiàn)為CK>Se50>Se100>Se200>Se300>Se400，各施硒相關(guān)處理分別較CK降低15.91%-61.36%、16.90%-64.79%、17.86%-71.43%；CK、Se50處理子實體Cd含量顯著高于Se200、Se300、Se400，各處理間表現(xiàn)為CK>Se50>Se100>Se200>Se400>Se300，各施硒相關(guān)處理較CK降低5.80%-57.97%；與相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB2762-2017）及2020版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）中靈芝子實體As、Cd、Pb、Hg含量參考值相比，僅Se300、Se400處理能同時達(dá)標(biāo)。各處理子實體Se含量表現(xiàn)為CK

2.3 不同濃度硒對白靈芝子實體生物活性成分含量的影響

由圖1A可知，各處理子實體多糖含量表現(xiàn)為CK＜Se100＜Se50＜Se200＜Se300＜Se400，施硒相關(guān)處理較CK增加9.61%-59.81%，其中CK與Se100、Se50與Se200、Se300與Se400均無顯著差異，施硒相關(guān)處理（Se100除外）顯著高于CK。

由圖1B可知，各處理子實體粗蛋白含量表現(xiàn)為CK＜Se50＜Se400＜Se100＜Se200＜Se300，其中CK顯著低于其他處理，Se300處理含量最高，Se50、Se100、Se200、Se400處理分別較其顯著降低17.11%、8.73%、6.16%、10.60%。

由圖1C可知，與CK相比，施硒相關(guān)處理子實體黃酮含量變幅為-1.23%-12.27%，其中Se50與Se200差異顯著，二者與CK差異不顯著：Se300與Se400顯著高于其他（Se100除外）處理，二者差異不顯著。

由圖1D可知，施硒相關(guān)處理子實體總氨基酸含量較CK顯著增加17.30%-55.88%：Se200處理含量最高，與Se100、Se300差異不顯著，Se50、Se400處理則分別較其顯著降低24.75%、14.77%。

2.4 不同濃度硒對白靈芝子實體三萜酸組分含量的影響

由圖2可知，白靈芝子實體三萜酸組分含量表現(xiàn)為靈芝酮三醇＜靈芝酸G＜靈芝酸B＜靈芝酸DM＜靈芝烯酸B＜靈芝酸F＜靈芝酸A，其中靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸DM、靈芝酸F、靈芝酸G、靈芝烯酸B及靈芝酮三醇分別占總?cè)扑岷康?4.83％-29.42%、9.57%-11.01%、11.24%-13.06%、21.13%-23.32%、7.64%-9.19%、7.47%-14.84%及7.05%-8.38%。

各處理總?cè)扑岷勘憩F(xiàn)為CK＜Se50＜Se400＜Se100＜Se200＜Se300，Se300處理較其他處理提高2.93%-25.54%。其中，Se300處理靈芝酸A、靈芝酸DM、靈芝酸F及靈芝酮三醇含量均較高：Se200處理靈芝烯酸B、靈芝酸G含量較高，其他處理較其分別降低0.07%-58.74%、10.17%-21.65%；Se400處理靈芝酸B含量最高，CK較其顯著降低12.18%，各處理靈芝酸B組分含量表現(xiàn)為CK＜Se50＜Se100＜Se300＜Se200＜Se400。

2.5 不同濃度硒對白靈芝子實體DNA甲基化的影響

甲基化位點比例越高意味著環(huán)境脅迫程度越大。為檢測不同濃度硒處理下子實體的表觀遺傳多樣性，利用敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析（MSAP）引物分析白靈芝子實體DNA的甲基化特性。由圖3可知，在所有處理中，全甲基化模式表現(xiàn)出最多的重復(fù)條帶，其次是半甲基化模式，而胞嘧啶內(nèi)甲基化水平最低。

由表4可知，Sel00處理子實體未甲基化位點比例最高（25.76%），其次是Se300、Se50，CK、Se400處理未甲基化位點比例較低。甲基化位點特征中，Se200、Se300處理下各位點比例表現(xiàn)為胞嘧啶內(nèi)甲基化<完全甲基化<半甲基化，其他處理表現(xiàn)為胞嘧啶內(nèi)甲基化<半甲基化<完全甲基化。各處理子實體半甲基化位點比例差異較大，Se200處理下最高（43.93%），其次是Se300處理，Se400處理下最低（25.76%）：各處理胞嘧啶內(nèi)甲基化位點比例表現(xiàn)為Se200＜Se300、Se100＜CK＜Se50、Se400：CK、Se400、Se100處理子實體完全甲基化位點比例較高，Se300處理最低（21.82%）。CK、Se400處理總甲基化比例較高，Se100、Se300處理較低。

2.6 硒施用濃度與子實體重金屬組分含量的線性分析

由硒施用水平與子實體重金屬組分含量的線性相關(guān)分析結(jié)果（圖4）可知，Se施用水平與白靈芝子實體中As含量的線性模型為v=-0.0007x+0.4196（R2=0.9799，P=0.0339），與Cd含量的線性模型為y=-0.0011x+0.7（X）5（R2=0.9423.P=0.0491），與Ph含量的線性模型為v=-0.0011x+0.6662（R2=0.9736.P=0.0405），與Hg含量的線性模型為v=-0.0005x+0.2592（R2=0.9534.P=0.0468）。表明施硒水平與成熟子實體中4種重金屬的含量均呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

菌絲發(fā)育及農(nóng)藝性狀是食藥用菌菌絲活力和后期收獲的重要表征。本研究結(jié)果表明，外源硒整體促進(jìn)了白靈芝菌絲的生長速率，其最佳的菌絲發(fā)育施用水平為100μg/g，400μg/g施用水平時菌絲生長速率最慢，表明在菌絲發(fā)育前期施用外源Se存在閾值效應(yīng)。Coval等研究表明赤靈芝菌絲發(fā)育對Se敏感，Se可使菌絲變細(xì)、分枝數(shù)增加，但孢子形態(tài)會發(fā)生改變，較高濃度的無機(jī)硒不利于菌絲生長。本研究結(jié)果顯示，外源Se明顯使白靈芝子實體的菌蓋變薄，而對菌柄長度和菌蓋大小影響較小。靈芝產(chǎn)量是決定食用菌效益的重要指標(biāo)，子實體鮮、干重整體以Se300處理較高，其中干重較CK顯著提高11.36%。

Se是生物體功能代謝不可缺少的微量元素，對人體的健康起著重要作。食藥用菌是良好的硒積累體，利用菌類進(jìn)行硒的生物強(qiáng)化是提高人體Se攝入量的有效策略。本研究結(jié)果表明，隨著Se施用水平的提高，白靈芝子實體Se含量呈先升高后降低趨勢。這與前人的研究結(jié)果不一致，Serafin等的研究表明，隨著Se施用水平的提高，赤靈芝子實體硒含量逐漸增加。上述結(jié)論不一致的原因可能是硒施用濃度及靈芝種類對硒的敏感度差異所致。大多數(shù)食用菌（如靈芝）皆具有很強(qiáng)的礦物元素富集能力，目前靈芝主要采用覆土栽培，而覆土易造成靈芝重金屬富集。本研究中，采用袋栽覆土栽培，白靈芝子實體的重金屬含量（As、Cd、Pb、Hg）均較高，隨著外源硒施用水平提高，子實體重金屬含量整體呈顯著降低趨勢。此外，參考GB2762-2017及《中國藥典》中重金屬含量標(biāo)準(zhǔn)，Se300、Se400處理子實體重金屬含量均符合要求。

靈芝子實體多糖、黃酮及靈芝酸等生物活性物質(zhì)含量是決定其藥用價值的重要參數(shù)。本研究結(jié)果表明，白靈芝子實體多糖、粗蛋白、黃酮、總氨基酸及總?cè)扑岷康姆逯嫡w出現(xiàn)在Se200、Se300、S400處理，即較高水平的Se用量更有利于刺激生物活性成分的合成。靈芝三萜酸物質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，子實體中靈芝酸的種類和含量是評價其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。本研究中，對白靈芝子實體中7種三萜酸化合物含量的分析表明，靈芝酸A是白靈芝子實體含量最高的三萜酸組分，其占總?cè)扑岷康?4.83%-29.42%，此結(jié)論與赤靈芝、紫靈芝等靈芝種類的相關(guān)報道結(jié)果一致。有研究表明，靈芝酸A、靈芝酸DM、靈芝酸F及靈芝酮三醇在護(hù)肝、降血脂、抗腫瘤、抗病毒及調(diào)控細(xì)胞凋亡中具有顯著療效。就硒處理而言，整體以Se200、Se300處理三萜酸組分含量較高，其中Se300處理下子實體靈芝酸A、靈芝酸DM、靈芝酸F及靈芝酮三醇含量最高。

植物在面對各種脅迫環(huán)境時會做出多重反應(yīng)以應(yīng)對環(huán)境變化，表觀遺傳狀態(tài)是反映植物應(yīng)對策略的重要表征。DNA甲基化是一種天然的表觀修飾過程，甲基化位點比例越高意味著環(huán)境脅迫程度越大。在植物體中，甲基化發(fā)生在胞嘧啶第5位碳原子上，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，將S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移給DNA胞嘧啶，形成5-甲基胞嘧啶，其可通過敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析技術(shù)檢測。本研究結(jié)果表明，CK與Se400處理具有較為相似的DNA甲基化特征，即具有較低的未甲基化位點比例和較高的完全甲基化位點比例，而Se100、Se300未甲基化位點比例較高、總甲基化位點比例較低。

綜上所述，施用外源硒能夠促進(jìn)白靈芝早期菌絲生長，提高子實體生物量累積和生物活性成分品質(zhì)，降低相關(guān)重金屬含量，改變DNA甲基化比例。但外源硒施用水平存在劑量效應(yīng)，本研究中以Na，Se03 300μg/g用量最佳。

基金項目：云南省重大科技專項計劃項目（202102AE090051-2-02）；云南省鄉(xiāng)村振興科技專項（202204BP090023）