郭宇坤　張燕飛　野金花　李佳擎　金智慧　苗宇航　呂艷東　郭曉紅

摘要：為探究不同用量氮對香稻苗期生長和生理指標(biāo)的影響，本試驗在砂培條件下以香粳稻品種稻花香2號為試材，設(shè)置N20（20mg/L）、N30（30mg/L）、N40（40mg/L）、N50（50mg/L）、N60（60mg/L）共5個氮濃度處理，研究其對香稻苗期生長和葉片氮代謝關(guān)鍵酶活性、抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量等的影響，并對與氮素水平顯著相關(guān)的指標(biāo)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行Z分綜合評價。結(jié)果表明，隨著外源氮濃度的升高，葉片硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NIR）、谷氨酰胺合成酶（Gs）、谷氨酸脫氫酶（CDH）和谷氨酸合成酶（G（）GAT）活性和可溶性蛋白含量均呈先上升后下降的變化趨勢，且均于N50處理下最高。隨著氮濃度升高，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，SOD活性在N40處理下最低，POD活性在N30處理下最低。丙二醛（MDA）含量低氮（30mg/L以下）處理顯著高于高氮（40mg/L以上）處理。N40-N60處理的相關(guān)指標(biāo)綜合評價的總和（∑Zi）為正值，其中，N50處理水平的∑Zi值最高，為10.201。綜合來看，40-60mg/L氮素可以保證稻花香2號苗期生長發(fā)育的正常進(jìn)行，但低于或者高于50mg/L均會對氮代謝相關(guān)酶活性產(chǎn)生一定抑制，并且低于40mg/L會顯著增加幼苗葉片MDA的積累，故50mg/L的氮最有益于稻花香2號幼苗的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：香稻；氮用量；生長發(fā)育；氮代謝關(guān)鍵酶；抗氧化指標(biāo)；苗期

中圖分類號：S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0078-08

水稻（Oryza sativa L.）是全球一半以上人口的主糧，其生產(chǎn)水平對于保障全球糧食安全至關(guān)重要。隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，主流消費市場對于具有良好口感的稻米越來越關(guān)注，因此發(fā)展優(yōu)質(zhì)水稻成為提升水稻質(zhì)量和效益轉(zhuǎn)型的重要舉措。香稻是一種特殊類型的栽培稻，具有獨特的香味和優(yōu)良品質(zhì)。市場上售價高、米質(zhì)好的品牌米都摻有不同比例的香米。盡管香米的銷售價格是常規(guī)優(yōu)質(zhì)米的兩倍多，但仍然備受廣大消費者的青睞。

我國香稻品種眾多，但主要集中在南方地區(qū)，北方地區(qū)的品種較少，并且傳統(tǒng)香稻品種大多具有地域性強(qiáng)的特點。香味的形成不僅受遺傳基因控制，還受栽培地的氣候、土壤因素及栽培管理方式等的影響，這使得南北方引種工作變得極為困難，極大程度上限制了北方香稻品種的相關(guān)研究。黑龍江省五常市位于東北中部北緯40°-45°的世界黃金水稻帶上，培育的香稻品種稻花香2號（五優(yōu)稻4號）米粒飽滿、飯粒油亮、香味濃郁，是中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，更是享譽(yù)全國。由于市場上稻花香2號的供求關(guān)系嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致生產(chǎn)上一味追求產(chǎn)量，過度施用氮肥，使得其香味近年來有所減弱，品質(zhì)逐年下降，銷量也受到一定影響。因此，改善栽培方法、合理施用氮肥，對于提高黑龍江省香米的市場競爭力、保障公眾的膳食質(zhì)量和增加農(nóng)民收入具有重要意義。

氮肥的合理施用對香稻生產(chǎn)有重要意義。前人在水稻施肥方式和施肥量上進(jìn)行的大量研究發(fā)現(xiàn)，合理的氮肥運籌可以有效提高稻米蛋白質(zhì)含量，改善蛋白質(zhì)組分，提高稻米品質(zhì)。有關(guān)不同氮素水平對水稻苗期生長及生理指標(biāo)的影響已有相關(guān)研究，但對于香稻的研究尚有不足。故而，本研究采用營養(yǎng)液砂培法探究氮濃度梯度下香稻苗期的生長發(fā)育情況，以期為香稻優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香粳稻品種稻花香2號由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)提供，種衣劑為喜盾的精甲·咯·嘧菌。所用砂均過孔徑為0.5cm的篩網(wǎng)后清水清洗，砂培盒為長、寬、高分別為22.5、18.5、7.5cm的白色塑料盒。營養(yǎng)液的配制參考肖德順等121的方法并進(jìn)行調(diào)整：將氮素形態(tài)改為1：1的NH4-NH4Cl：NO3-NaNO3，其中Fe2+用Fe（EDTA-Na2）代替，加入Na，SiO3以調(diào)節(jié)和保持營養(yǎng)液中SiO2的濃度為120mg/kg。試驗時每隔兩天補(bǔ)加一次營養(yǎng)液。此外，用1mg/L的雙氰胺作為硝化抑制劑，營養(yǎng)液pH值調(diào)至5.5。

1.2 試驗設(shè)計

結(jié)合戴含等的研究方法，并參考胡繼杰等研究中采用的國際水稻研究所營養(yǎng)液配方，試驗設(shè)置5個氮素處理水平，氮質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50、60mg/L，分別標(biāo)記為N20、N30、N40、N50、N60。每處理重復(fù)3次。試驗于2023年5月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)的溫室大棚中進(jìn)行，稻花香2號幼苗生長至三葉一心期前用清水培養(yǎng)，當(dāng)80%的幼苗到達(dá)三葉一心期時開始進(jìn)行不同濃度氮素處理，80%的水稻幼苗到達(dá)四葉一心期時結(jié)束處理，取樣進(jìn)行各項指標(biāo)測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植株農(nóng)藝性狀和鮮重測定

從各處理的每個重復(fù)中分別隨機(jī)選取2株生長至四葉一心期的幼苗，測量株高、莖基寬，并稱量地上部鮮重。

1.3.2 葉片氮代謝關(guān)鍵酶活性測定

硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）活性參考李佳男等的方法測定，谷氨酰胺合成酶（GS）活性參考熊淑萍等的方法測定，谷氨酸脫氫酶（CDH）、谷氨酸合成酶（COGAT）活性參考林振武等的方法測定。

1.3.3 葉片抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法，酶活性以抑制NBT光化還原50%所需酶量為一個酶活單位。過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，以470nm下每分鐘OD值升高0.01為一個酶活單位。

1.3.4 葉片丙二醛、游離蛋白含量測定

丙二醛（MDA）含量參考李合生的方法測定，游離蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)0-250法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用Graphpad Prism 9.4.1軟件作圖。采用Z分綜合評價法20分別計算與氮素代謝水平顯著相關(guān)的指標(biāo)及形態(tài)學(xué)指標(biāo)的綜合評價值，公式為Zi=（Xi-Xm）/Si，其中Zi表示某氮素水平下i指標(biāo)的綜合評價值，Xi為該氮素水平下的i指標(biāo)值，Xm為各氮素水平下i指標(biāo)的平均值，Si為各氮素水平i指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氦濃度處理對稻花香2號幼苗生長發(fā)育的影響

由表1可知，隨著氮濃度增加，水稻幼苗的株高、莖基寬以及地上部鮮重均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在N50處理下，水稻植株最高，為11.78cm，較N20、N30、N40、N60處理分別提高26.94%、24.92%、11.66%、5.65%，差異顯著：莖基寬最大，為0.40Cm，較N20、N30、N40、N60處理分別提高42.86%、48.15%、25.00%、2.56%，差異顯著（除N60外）；地上部鮮重最大，為0.0659，較N20、N30、N40、N60處理分別提高51.16%、47.73%、8.33%、10.17%，差異顯著。

2.2 不同氮濃度處理對稻花香2號幼苗氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由表2可知，隨著氮濃度增加，稻花香2號幼苗葉片硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NIR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和谷氨酸合成酶（COGAT）活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且均在N50處理下達(dá)到峰值。N50處理下，葉片NR活性為47.95μg／（gFW·h），較N20、N30、N40處理分別提高50.88%、40.04%、27.39%，N60處理較N50降低29.95%，各處理間差異顯著（除N30和N60外）。

幼苗葉片NIR活性在N50處理下為2.72U/gFW，較N20、N30、N40處理分別提高36.68%、24.77%、12.86%，N60處理下NIR活性較N50處理降低8.82%，各處理間差異顯著（除N40和N60處理外）。

N50處理下，GS活性為12.34μmol/（gFW·h），較N20、N30、N40處理分別提高101.96%、63.44%、46.21%，N60處理較N50降低30.23%，各處理間差異顯著（除N40和N60處理外）。

CDH活性在N50處理下為0.22U/mL，較N20、N30、N40處理分別提高57.14%、37.50%、22.22%，N60處理較N50降低13.64%，處理間差異顯著（除N40和N60外）。

GOCAT活性在N50處理下為57.17U/gFW，較N20、N30、N40處理分別提高137.71%、46.14%、30.67%，隨后下降，N60處理較N50降低27.64%，各處理間差異顯著。

2.3 不同氮濃度處理對稻花香2號幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

如圖1所示，隨著氮素濃度增加，幼苗葉片中游離蛋白含量先升高后降低，N50處理下含量最高，為3.938mg/mL，較N20、N30、N40處理分別提高31.90%、16.64%、6.71%，隨后下降，N60處理較N50降低14.63%。

2.4 不同氮濃度處理對稻花香2號幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖2可知，隨著氮濃度增加，稻花香2號幼苗葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性均呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢。SOD活性在N40處理下最低，為22.23U/gFW，較N20、N30、N50、N60處理分別降低11.46%、6.15%、10.88%、13.74%，除N30處理外，與其他處理間差異均達(dá)顯著水平：在N60處理下最高，但與N20、N50處理間差異不顯著。

幼苗葉片POD活性在N30處理下最低，為3892.21U/（gFW·min），較N20、N40、N50、N60處理分別降低16.77%、6.83%、11.43%、16.95%，且差異均達(dá)顯著水平：在N60處理下達(dá)到最高，但與N20處理間差異不顯著。

N40、N50、N60處理下的幼苗葉片MDA含量顯著低于N20、N30處理：N30處理下含量最高，較N20處理提高3.75%，但差異不顯著，較N40、N50、N60處理分別提高19.23%、26.17%、15.65%，且差異均達(dá)顯著水平：N50處理下含量最低，為2.19μmol/gFW，較N20、N30處理分別降低17.77%、20.74%，差異達(dá)顯著水平，與N40、N60處理相比分別降低5.50%、8.34%，差異不顯著。

2.5 不同氮濃度下香稻幼苗葉片氮代謝及抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表3町知，NIR、GS、GDH和GOGAT活性與氮濃度均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.884、0.884、0.875和0.687，而NR活性與氮濃度相關(guān)不顯著。NIR和GS活性受氮濃度影響較大，其次是GDH和GOGAT。氮濃度與游離蛋白含量及SOD、POD活性問不存在顯著相關(guān)性，但與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.666。游離蛋白含量與NR、NIR、GS、GDH和GOGAT活性均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.924、0.761、0.752、0.774和0.933，與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.676。POD活性和SOD活性之間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.585。MDA含量與NR活性呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.632，與NIR、GS、GDH和GOGAT活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.800、-0.796、-0.800、-0.775。

2.6 不同氮濃度處理下香稻幼苗各指標(biāo)的綜合性評價

為全面評估篩選適宜稻花香2號幼苗生長發(fā)育的氮素水平，對香稻幼苗形態(tài)學(xué)指標(biāo)及與氮濃度存在顯著相關(guān)性的生理指標(biāo)進(jìn)行Z分綜合評價，將利于香稻幼苗生長發(fā)育和氮代謝的指標(biāo)列為“高優(yōu)”指標(biāo)，將反映植物細(xì)胞受損程度的指標(biāo)列為“低優(yōu)”指標(biāo)。結(jié)果如表4所示，N40-N60處理組相關(guān)指標(biāo)綜合評價的總和（∑Zi）為正值。其中，N50處理的∑Zi值最高，達(dá)10.201；N60、N40處理較高，分別為3.181、1.641。

3 討論

3.1 不同氮濃度處理對水稻幼苗氮代謝過程的影響

通常情況下，氮代謝關(guān)鍵酶通過影響植株體內(nèi)氨的同化和氨基酸的合成，進(jìn)而調(diào)控植物代謝和發(fā)育的重要生理過程。NR可以將土壤中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是一種硝酸鹽同化的限速酶，而NIR是一種氧化還原酶，在植物體中可以迅速降解亞硝酸鹽，避免富集毒害植物細(xì)胞，同時NR和NIR均是硝酸根轉(zhuǎn)換過程中一類重要的酶。本試驗條件下，這兩種酶活性隨氮素水平的升高呈現(xiàn)先上升后降低的變化趨勢，這與寧書菊等的研究結(jié)果相一致。NR活性在N20-N50處理間呈上升趨勢，原因一方面可能是因為隨著氮素水平上升，NOO3-的含量也隨之上升，對NR活性有一定的促進(jìn)作用，另外一方面可能是在較低氮濃度水平下，NR的基因表達(dá)受到了正向誘導(dǎo)，促使大量合成NR：N60處理下表現(xiàn)為下降，可能與高氮條件下NR的基因表達(dá)量受到抑制且同時NH4+含量上升導(dǎo)致對NR活性的抑制作用增強(qiáng)有關(guān)。盡管有相關(guān)研究表明NR和NIR的活性受氮素類型影響較大，表現(xiàn)為NH4抑制、NO-3促進(jìn)，但是二者間的作用機(jī)制和影響程度尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

GS的主要作用為將銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（Gln）；GDH可以有效防止氨積累對植物的毒害作用，同時可以催化NH4+直接與α-酮戊二酸（α-OG）反應(yīng)生成谷氨酸（Glu）；COGAT可以催化谷氨酰胺與α-酮戊二酸結(jié)合生成谷氨酸。本研究結(jié)果顯示，三者的活性均與氮素水平呈極顯著正相關(guān)，整體上表現(xiàn)為隨施氮量增加活性上升。這與前人的研究結(jié)論相一致，即隨著氮濃度上升，NH4+濃度相應(yīng)提高，其作為GS和GDH催化反應(yīng)的底物，對兩酶活性有一定的促進(jìn)作用。GOGAT可以協(xié)助GS完成對NH4的初級同化，在不同品種中活性存在較大差異，本試驗中表現(xiàn)出與GS相對一致的變化趨勢，均在N50處理下達(dá)到峰值。N60處理下三種酶活性均出現(xiàn)下降。對于GDH而言，雖然高氮條件下NH4+含量較高，但是基因表達(dá)仍會受到抑制，從而導(dǎo)致其活性下降。對于GS和GOGAT而言，兩者活性下降的原因可能有兩個方面：首先是隨著氮濃度的不斷升高，酶活性升高，酶促反應(yīng)過程中釋放的H+濃度升高，根據(jù)前人的研究結(jié)論可知，過高的H+會對GS和GOGAT的循環(huán)產(chǎn)生抑制：另外一方面可能是循環(huán)中的產(chǎn)物谷氨酰胺過量，對循環(huán)過程產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)。同時可以得出，在N20-N50范圍內(nèi)，隨著氮素水平提高GOGAT活性不斷升高，有效促進(jìn)谷氨酸合成。谷氨酸是香稻主要香味物質(zhì)2-AP合成的重要前體物質(zhì)，但由于本試驗未測定谷氨酸轉(zhuǎn)化的相關(guān)指標(biāo)，無法確定谷氨酸與2-AP的轉(zhuǎn)化情況，故無法確定稻花香2號苗期氮素水平是否是影響其香味的因素之一。

3.2 不同氮濃度處理對水稻幼苗抗氧化水平的影響

逆境條件下，水稻在生物代謝過程中普遍會產(chǎn)生一些不穩(wěn)定的、帶有多余電子的、化學(xué)活性很高的基團(tuán)成分（主要以超氧陰離子為主），對其細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。SOD、POD是一類抗氧化酶，用于消除細(xì)胞中的自由基，對于二者活性的評價可以間接反映水稻受到逆境脅迫的情況。SOD主要功能是通過消除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，抑制膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化作用及其產(chǎn)物丙二醛的積累，維持細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性。本試驗中，幼苗葉片的POD、SOD活性均在低、高氮水平下呈現(xiàn)升高趨勢，這與前人的研究結(jié)論相符合：MDA含量在低氮水平下高于高氮，這可能與稻花香2號苗期對氮的耐受性和需求性有關(guān)。

3.3 不同氮濃度處理下水稻生理指標(biāo)的Z分綜合評價

Z分綜合評價法為對比不同氮素水平對稻花香2號幼苗影響程度提供了直觀的方法。該方法是一種直線型無量綱化法，可以將各指標(biāo)的單位消除后進(jìn)行運算，運算結(jié)果∑Zi可以評價多個指標(biāo)的綜合性能，反映樣本的總體情況，給出不同氮素水平對稻花香2號幼苗影響的實際情況比較結(jié)果。但該方法無法顯示各指標(biāo)對稻花香2號幼苗具體影響的比重，同時對指標(biāo)的選擇也會直接影響評價結(jié)果。故而將Z分綜合評價法運用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)問題上時應(yīng)考慮到評價指標(biāo)與評價對象的關(guān)聯(lián)度。本試驗中，氮素水平對稻花香2號幼苗的影響是多方面的，在評價適合稻花香2號幼苗生長發(fā)育的氮素水平時無法通過單一的某幾個指標(biāo)進(jìn)行判定，故選擇Z分綜合評價法對香稻幼苗形態(tài)指標(biāo)及和氮素水平顯著相關(guān)的各指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，得出N50處理的∑Zi值最高，達(dá)10.201，N60和N40處理的∑Zi值較高，分別為3.181和1.641。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗條件下，稻花香2號氮代謝相關(guān)酶活性在一定范圍內(nèi)會隨著氮濃度的增加而升高，進(jìn)而促進(jìn)其苗期的生長發(fā)育和氮素積累。40-60mg/L的氮素可以保證稻花香2號苗期生長發(fā)育的正常進(jìn)行，尤其是50mg/L水平，低于或者高于50mg/L均會對氮代謝相關(guān)酶活性產(chǎn)生顯著抑制，且低于40mg/L水平會顯著增加其幼苗葉片的丙二醛積累。因此，50mg/L的氮有益于稻花香2號幼苗的正常生長。

基金項目：東北粳稻遺傳改良與優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新開放課題（KF2022-02）；黑龍江省高等教育教學(xué)改革工程項目（SJCY20220466）；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202310223156X）