孫雙雙，李 俊，王文潔，柴文琦，周廣舟

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

熱激蛋白（heat shock proteins, HSPs）是一類高度同源的分子伴侶蛋白，可在細(xì)胞應(yīng)對溫度變化、紫外線輻射、藥物處理和病原侵染等多種生理和壓力誘導(dǎo)下起到保護(hù)作用。HSPs蛋白一般都含有N末端的ATP結(jié)合區(qū)（nucleotide binding domain,NBD）、底物結(jié)合區(qū)（substrate binding domain,SBD）和C末端區(qū)域。其中分子量為70 kDa左右的HSPs家族成員非常保守，幾乎存在于所有生物中[1-2]。而HSP70的同源蛋白Hsc70（Heat-shock cognate protein 70），結(jié)構(gòu)非常接近HSP70家族成員，同源性也較高，在細(xì)胞內(nèi)多呈組成型表達(dá)模式，并在蛋白質(zhì)的重折疊、轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)泛素化降解等不同的蛋白質(zhì)量控制過程中發(fā)揮重要作用。

近年來越來越多的研究表明，Hsc70還在病原感染特別是在病毒的侵染過程中參與介導(dǎo)吸附、內(nèi)吞、侵入、脫殼、轉(zhuǎn)錄和翻譯、病毒的組裝和出芽等多個復(fù)制循環(huán)進(jìn)程[3-4]，對病毒的基因組復(fù)制、病毒大分子合成和子代病毒裝配等產(chǎn)生重要影響。深入研究Hsc70蛋白在病毒侵染過程中的作用及其分子機制將有利于厘清不同病毒與宿主互作關(guān)系，且對開發(fā)基于Hsc70靶點的抗病毒防控技術(shù)及藥物等方面都具有重要意義。本文將對近年來Hsc70蛋白在病毒復(fù)制循環(huán)不同階段發(fā)揮的作用等研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，以期為未來深入探討Hsc70在病毒侵染過程中的作用機制研究提供更多資料。

1 Hsc70 在病毒感染不同階段的作用分析

病毒侵入宿主細(xì)胞大致分為吸附、侵入、脫殼、病毒大分子合成、裝配及釋放等過程。在感染起始階段，病毒通過與細(xì)胞表面受體的結(jié)合吸附到受染細(xì)胞上，進(jìn)而通過融合、胞飲和內(nèi)吞等多種途徑穿過胞膜進(jìn)入胞漿。病毒還需要通過脫殼釋放出核酸組分，進(jìn)一步完成生物大分子的合成，包括病毒自身基因組復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等，為最終的子代病毒裝配和釋放做好準(zhǔn)備。不同科的病毒完成這些步驟過程各異，有囊膜和無囊膜病毒之間或DNA病毒與RNA病毒之間均存在不同的路徑，其間需要不同的病毒結(jié)構(gòu)（非結(jié)構(gòu)）蛋白、宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白和miRNAs等的參與，展示了極大的復(fù)雜性。而近些年的研究表明，Hsc70蛋白在不同科病毒感染宿主細(xì)胞過程中，在感染的不同階段都有可能發(fā)揮重要作用，對宿主的抗病毒免疫也有一定影響。

1.1 Hsc70參與病毒侵入過程 吸附和侵入是病毒進(jìn)行感染的前端重要步驟，這其中依賴于病毒自身的衣殼蛋白和細(xì)胞表面上的一些受體蛋白等的參與。盡管Hsc70主要分布在胞質(zhì)，并在胞質(zhì)和胞核之間穿梭參與多種生物反應(yīng)過程，但近年來的研究顯示Hsc70也可以被錨定在胞膜并可以作為一些病毒侵入過程中的受體[5]。登革病毒DENV感染C6/36細(xì)胞后，Hsc70會高度表達(dá)在細(xì)胞表面并經(jīng)歷重定位后同病毒包膜糖蛋白E互作，參與病毒的侵入。用Hsc70抗體孵育能有效阻斷DENV的吸附進(jìn)而抑制病毒的感染[6]。

此外，Hsc70蛋白也參與輪狀病毒的侵入過程[7-8]。研究表明輪狀病毒感染上皮細(xì)胞為一個多步驟過程，需要至少唾液酸、神經(jīng)節(jié)苷脂、整合素和Hsc70等的參與[9]。盡管其不同分離株通過不同的內(nèi)吞途徑侵入細(xì)胞，但該過程均需Hsc70的參與，如感染MA104細(xì)胞時預(yù)先用抗Hsc70抗體處理能抑制輪狀病毒的感染，輪狀病毒刺突蛋白VP4被切割為VP5和VP8亞片段并促進(jìn)病毒的侵入過程，這其中細(xì)胞內(nèi)Hsc70能結(jié)合到VP5片段上，作為病毒吸附后的細(xì)胞受體參與輪狀病毒感染。但進(jìn)一步地研究顯示，Hsc70蛋白的ATP結(jié)合區(qū)對輪狀病毒的感染卻起著負(fù)調(diào)控作用，與作為細(xì)胞受體的功能一起協(xié)同影響著病毒的侵入。在ATP存在的情況下，可溶性Hsc70能降低純化輪狀病毒的侵染性60%以上，提示Hsc70的ATP酶活性會部分抑制該病毒侵染力[10]。未來更多這方面的研究可能會有助于理解Hsc70在病毒侵入過程中的作用。

1.2 Hsc70參與病毒胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和解聚 病毒完成吸附之后會通過多種方式跨過細(xì)胞膜并脫殼實現(xiàn)基因組的內(nèi)化過程。研究發(fā)現(xiàn)Hsc70會參與到網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的病毒核酸內(nèi)吞過程中，其水解ATP的活性有助于網(wǎng)格蛋白的組裝和解聚循環(huán)[11]，進(jìn)而影響到多種包膜病毒的核衣殼解聚，如日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）[12]。該病毒是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用起始侵染的。當(dāng)使用敲除Hsc70后的JEV感染C6/36細(xì)胞時，該病毒只能吸附到細(xì)胞表面而不能進(jìn)一步被內(nèi)吞形成酸化的內(nèi)體，也不能釋放病毒RNA以便在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上翻譯，該過程提示Hsc70通過影響細(xì)胞內(nèi)吞參與到JEV的感染[13]。

除了包膜病毒之外，Hsc70還會影響一些無包膜病毒粒子的轉(zhuǎn)運。猴病毒SV40通過小窩蛋白內(nèi)化并聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，SV40病毒進(jìn)一步利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白招募小四肽重復(fù)序列蛋白α（small glutaminerich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha,SGTA）、Hsc70、Hsp105和Bag2等蛋白形成一個胞質(zhì)復(fù)合體，介導(dǎo)病毒由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運[14]。其中SGTA蛋白調(diào)節(jié)Hsc70同SV40的直接相互作用，而HSP105和Bag2激發(fā)SV40和Hsc70的解聚，從而完成病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)位。除了協(xié)助SV40病毒的轉(zhuǎn)運之外，對流感病毒的研究也顯示，Hsc70能與病毒NS2競爭結(jié)合到M1蛋白上，參與病毒核衣殼蛋白復(fù)合體（viral ribonucleprotein, vRNP）的核輸出，并在其復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用[15]。

除了參與病毒細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運外，Hsc70還參與一些病毒的脫殼過程。如對動物呼腸孤病毒的研究顯示，病毒內(nèi)化入內(nèi)體后會逐步解聚暴露出核心組件為后續(xù)轉(zhuǎn)錄做準(zhǔn)備，這其中Hsc70會協(xié)助病毒衣殼蛋白μ1的δ片段的清除，進(jìn)而釋放具有轉(zhuǎn)錄活性的核心入胞質(zhì)，特異性Hsc70抗體會阻斷這一過程[16]。近年來，在一些植物病毒中也有類似的研究發(fā)現(xiàn)[17]。對黃瓜壞死病病毒（Cucumber necrosis virus, CNV）的研究表明，用重組Hsc70-2蛋白同CNV顆粒共孵育后會導(dǎo)致病毒衣殼構(gòu)象變化或部分解聚，在昆諾藜植株上產(chǎn)生大量病灶，提示Hsc70在該病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。

1.3 Hsc70調(diào)節(jié)病毒基因組復(fù)制 病毒需要依賴宿主細(xì)胞機器完成自身的基因組復(fù)制，目前已有研究顯示Hsc70蛋白可與病毒蛋白或基因組相互作用并幫助病毒在胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。如在MHV68鼠γ皰疹病毒感染的成纖維細(xì)胞系3T12上，鼠潛伏期相關(guān)核抗原蛋白（latency-associated nuclear antigen, LANA）能直接與Hsc70互作并招募后者到胞核，幫助形成病毒復(fù)制復(fù)合體進(jìn)而促進(jìn)病毒DNA復(fù)制和病毒晚期蛋白表達(dá)[18]。對人乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染HepG2.2.15細(xì)胞的研究也顯示，下調(diào)細(xì)胞Hsc70蛋白表達(dá)會顯著降低病毒DNA復(fù)制水平超60%[19]，因此很多研究將Hsc70作為開發(fā)潛在的抗HBV病毒藥物的理論靶點[20]。此外，在鴨肝病毒（Duck hepatitis B virus, DHBV）和腸病毒EV-71等感染宿主過程中，Hsc70也被發(fā)現(xiàn)參與病毒復(fù)制和組裝過程中[21-22]。最近，Mao等[23]對1株家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的研究也顯示，HSP/Hsc70在病毒的基因組復(fù)制、病毒擴(kuò)增和出芽等多個早期侵染時段發(fā)揮關(guān)鍵作用，也會對病毒蛋白的豐度產(chǎn)生一定影響，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其脫乙?；芡ㄟ^蛋白酶體介導(dǎo)的核輸入方式促進(jìn)BmNPV病毒的擴(kuò)增[24]。

除了同其他蛋白的互作之外，研究顯示Hsc70還可以與非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）結(jié)合正向調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，目前已在人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）和西尼羅河病毒（West Nile virus, WNV）等病毒的復(fù)制過程中得到證實[25-27]。近來對狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）的研究也顯示，該病毒轉(zhuǎn)錄的一個稱為前導(dǎo)（leader RNA, leRNA）的小ncRNA能在病毒感染SK-N-SH細(xì)胞時干擾病毒基因組RNA和核衣殼的相互作用，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的，而Hsc70通過下調(diào)leRNA來逆轉(zhuǎn)這一過程[28]。此外，對埃博拉病毒（Ebola virus, EBOV）研究也表明，當(dāng)病毒感染HEK293T細(xì)胞時，其基因組非編碼區(qū)部分motif能同Hsc70相互作用，形成類似“鍋柄”樣結(jié)構(gòu)并利于病毒復(fù)制[29]。

除了上述正向調(diào)節(jié)之外，Hsc70對一些病毒的復(fù)制也會有負(fù)向效應(yīng)。Hsc70/HSP70能通過提供ATP裝載小RNA雙鏈體進(jìn)入精氨酸蛋白的方式參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC）組裝。在DENV感染的Huh7細(xì)胞里，下調(diào)Hsc70抑制了miRNA介導(dǎo)的宿主RNA誘導(dǎo)的反應(yīng)，促進(jìn)了病毒基因組RNA的富集，展示了Hsc70蛋白在限制病毒復(fù)制方面的能力[30]。然而，DENV病毒編碼的一個RNA誘導(dǎo)抑制因子蛋白NS3，能同Hsc70蛋白互作后抑制miRNAs裝載到Ⅰ型精氨酸蛋白Ago1中，進(jìn)而利于病毒的復(fù)制。而最近，Li等[31]對鯉春彈狀病毒（spring viremia of carp virus, SVCV）的感染實驗發(fā)現(xiàn)，其糖蛋白G會在E3泛素連接酶MARCH8介導(dǎo)下進(jìn)行泛素化，而該過程需要Hsc70的參與，與G蛋白和MARCH8形成復(fù)合體，并最終引發(fā)G蛋白的溶酶體降解，進(jìn)而導(dǎo)致病毒復(fù)制的下降。這其中Hsc70起到類似“腳手架”的作用，從而參與病毒的復(fù)制過程。

1.4 Hsc70參與病毒的形態(tài)發(fā)生 病毒通常招募宿主因子和自身的結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白等相互作用，共同參與子代病毒粒子的裝配和出芽等過程，Hsc70蛋白作為分子伴侶家族的成員經(jīng)常涉及其中。如對人丙肝病毒（Hepatitis C virus, HCV）的研究顯示，在感染Huh7.5細(xì)胞后，Hsc70能與HCV病毒核心和結(jié)構(gòu)蛋白E2共定位在細(xì)胞脂滴周圍，而該部位正是HCV組裝和釋放的重要位點。當(dāng)用RNA干擾沉默Hsc70之后能顯著降低病毒RNA的釋放，但對病毒的復(fù)制水平?jīng)]有影響，提示Hsc70是通過參與病毒的組裝或出芽等形式調(diào)控HCV侵染性的[32]。Peng等[33]利用一個Hsc70抑制劑IMB-DM122，干擾了Hsc70的衣殼化達(dá)到降低HCV侵染性的目的。而且，Hsc70別構(gòu)抑制劑能阻斷HCV在胞內(nèi)的裝配，但對侵入、復(fù)制和翻譯等過程沒有影響[34]。

此外，在人HBV和乳頭瘤病毒（Human papilloma virus, HPV）的研究上也取得了類似進(jìn)展[35-36]。如對非包膜病毒HPV的兩個衣殼蛋白L1和L2研究發(fā)現(xiàn)，L2可以通過招募L1蛋白到胞核并形成PML小體參與病毒組裝。而Hsc70可以在胞質(zhì)內(nèi)同L2蛋白C末端相互作用形成復(fù)合體，然后被轉(zhuǎn)位到PML小體內(nèi)。若敲除Hsc70后則阻斷了L2的核定位，進(jìn)而影響病毒的裝配，展示了Hsc70在L2蛋白整合入病毒衣殼過程中的必不可少的作用。

最近，Liang等[37]對感染水稻的呼腸孤病毒——南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)由該病毒非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1構(gòu)成的含病毒小管侵染其宿主白背飛虱過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解因子DNAJB12和它的胞質(zhì)伴侶分子Hsc70能被SRBSDV病毒激活并協(xié)助P7-1小管結(jié)構(gòu)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)輸出。在此過程中，病毒和Hsc70均能直接結(jié)合到DNAJB12蛋白的J結(jié)構(gòu)域上。DNAJB12-Hsc70復(fù)合體被招募到P7-1小管內(nèi)，敲除兩者中的任一個都會顯著抑制P7-1小管結(jié)構(gòu)的組裝，并導(dǎo)致病毒在宿主中的有效傳播。這些結(jié)果再次展示了Hsc70在病毒裝配和傳染過程中的重要作用。

2 Hsc70 參與的宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)

宿主機體可通過一系列精確的免疫應(yīng)答對外界入侵的病毒病原進(jìn)行消滅和清除，這其中涉及細(xì)胞天然免疫和適應(yīng)性免疫等抗病毒反應(yīng)過程，反過來一些病毒又會進(jìn)化出不同的免疫逃逸策略應(yīng)對宿主的免疫應(yīng)答。目前對Hsc70的研究發(fā)現(xiàn)其均能參與這些反應(yīng)過程中，并在宿主的保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要功能。

如目前研究比較多的病毒感染后激起的細(xì)胞凋亡和自噬等程序性反應(yīng)途徑，Hsc70就被鑒定為是細(xì)胞線粒體自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）過程中的決定性組分，其能特異性選擇目標(biāo)蛋白并轉(zhuǎn)運底物給受體—溶酶體相關(guān)蛋白（lysosomal associated membrane protein type 2A,LAMP2A），啟動降解過程[38]。HCV感染誘導(dǎo)細(xì)胞的脂滴聚集，長時間共培養(yǎng)游離脂肪酸和HCV能激活Huh7.5細(xì)胞的（chaperone-mediated autophagy,CMA）過程并下調(diào)Ⅰ型干擾素受體（IFN gamma to the interferon receptor, IFNAR1），破壞IFNα誘導(dǎo)的JAK-STAT抗病毒信號通路途徑[39]。IFNAR1在溶酶體膜上通過Hsc70和LAMP2A的相互作用被選擇性降解，Hsc70通過介導(dǎo)自噬抑制宿主的抗HCV免疫[40]。也有研究顯示HCV的NS5A蛋白能同Hsc70互作并招募Hsc70至肝細(xì)胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor 1alpha, HNF-1α），進(jìn)而激起HNF-α的溶酶體降解，利于病毒的致病過程[41]。最近，對人類腺病毒的研究也顯示，其E1A原癌基因能通過拮抗Hsc70和IRF3的磷酸化抑制宿主的抗病毒反應(yīng)[42]。

除了上述的宿主抗病毒天然免疫之外，Hsc70還通過抗原呈遞系統(tǒng)參與宿主的適應(yīng)性免疫過程。Hsc70能呈遞抗原到CD4+T細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞活化及后續(xù)的漿細(xì)胞分泌抗體的潛力[43]。對人HSV-2的研究就表明，基于Hsc70的HSV-2多肽疫苗能誘導(dǎo)強烈的CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫，表明Hsc70有助于CD4+T細(xì)胞識別抗原并加強宿主抗病毒免疫的能力，相關(guān)研究結(jié)果已用于臨床Ⅰ期試驗[44]。

3 討論與展望

Hsc70是一個組成型表達(dá)的分子伴侶蛋白，在細(xì)胞內(nèi)參與多種不同的細(xì)胞生物學(xué)過程。而在病毒感染的宿主細(xì)胞內(nèi)，Hsc70能被有包膜或無包膜病毒的DNA或RNA病毒利用，并在感染的不同階段發(fā)揮相應(yīng)功能。反過來，宿主也會利用Hsc70作為一個有效的靶點通過細(xì)胞天然免疫和適應(yīng)性免疫等多種途徑清除外源病毒。因此，深入研究Hsc70蛋白在不同病毒感染宿主過程中的作用及分子機制，將對厘清病毒與宿主相互作用關(guān)系及開發(fā)基于Hsc70的抗病毒藥物及防控技術(shù)都有重要意義。

熱激蛋白及其同源家族成員多在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊及應(yīng)對外界壓力條件下起到修飾和保護(hù)作用。但有趣的是目前的大部分研究表明，在病毒感染時Hsc70蛋白多被病毒征用于不同階段的自身復(fù)制循環(huán)，從而在病毒對宿主細(xì)胞的侵染過程中起到正向調(diào)控作用。鑒于此，科學(xué)家以Hsc70為作用靶點設(shè)計和開發(fā)了多種具有抗病毒潛力的抑制劑或小分子化合物等。HCV感染時，一些酪氨酸類似物如DCB-3503、外消旋亮氨酸等處理后，這些小分子能特異性結(jié)合到Hsc70蛋白N端的NBD結(jié)構(gòu)區(qū)并刺激胞內(nèi)ATP水解，最終能抑制病毒的翻譯過程[45]。傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）屬雙股 RNA 病毒科[46]，目前廣泛商品化使用的Hsc70抑制劑，VER-155008，作為一種ATP結(jié)構(gòu)類似物，將其處理IBDV感染的細(xì)胞后也能較好的抑制病毒的復(fù)制[47]。近來，針對Hsc70靶點的抗豬流行性腹瀉病毒（冠狀病毒科成員）（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）復(fù)制的化學(xué)小分子篩選和鑒定研究也獲得了一定進(jìn)展[48]。當(dāng)然，目前這方面的研究仍然有限，開發(fā)基于Hsc70的具有更高抑制效果、更寬抗病毒譜和具有實際臨床應(yīng)用價值的化合物將是今后的研究重點。

盡管目前人們對Hsc70蛋白的功能有了越來越多的認(rèn)識，但畢竟早期只是把它作為胞內(nèi)的分子伴侶蛋白進(jìn)行研究，對其在病毒侵染過程中的功能探索并不全面。鑒于不同的病毒科成員在感染宿主過程中會有不同的路徑，會涉及不同的細(xì)胞通路途徑，有不同的細(xì)胞因子和病毒結(jié)構(gòu)（非結(jié)構(gòu)）蛋白的參與，深入闡明Hsc70蛋白在各類病毒感染進(jìn)程（吸附、侵入、擴(kuò)增和釋放等）中的作用及分子機制將對開發(fā)針對Hsc70靶點的抗病毒策略至關(guān)重要。