陳實(shí)銳 陳哲晶 鄭欣然 李佳靈 張貝貝

摘要

昆蟲精子超微結(jié)構(gòu)在不同類群間變異較大，在昆蟲分類、種群進(jìn)化研究及系統(tǒng)發(fā)育分析中具有重要意義。研究葉蟬科昆蟲精子發(fā)生及精子超微結(jié)構(gòu)，可為葉蟬科及頭喙亞目系統(tǒng)發(fā)育分析提供更多特征依據(jù)。本研究采用光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)，觀察了瓊凹大葉蟬Bothrogonia?qiongana?Yang?et?Li的精子發(fā)生和精子超微結(jié)構(gòu)。精子形成時(shí)期，精子細(xì)胞內(nèi)高爾基復(fù)合體形成精子頂體;線粒體融合衍變?yōu)榫€粒體衍生物;中心粒產(chǎn)生軸絲。單層微管結(jié)構(gòu)圍繞精子各組成部分，在精子成熟后消失，對(duì)精子細(xì)胞伸長(zhǎng)起關(guān)鍵作用。成熟精子細(xì)長(zhǎng)、線狀，頭部頂端由繩狀物質(zhì)連接形成梳狀精子束。頂體圓錐狀，具有頂體腔，末端延伸出2條突起插入細(xì)胞核頂端。細(xì)胞核近柱狀，末端平截，側(cè)緣凹陷，通過片層狀中心粒側(cè)體與鞭毛線粒體衍生物連接。尾部鞭毛由1條9+9+2型軸絲，2條對(duì)稱線粒體衍生物，2條較短副體，2條細(xì)小附結(jié)構(gòu)及鞭毛中心物質(zhì)組成。瓊凹大葉蟬副體橫切橢圓形、長(zhǎng)度較短僅出現(xiàn)在鞭毛起始區(qū)，與角頂葉蟬亞科昆蟲差異較大。結(jié)合已報(bào)道頭喙亞目類昆蟲，我們推斷副體結(jié)構(gòu)可為葉蟬科及頭喙亞目系統(tǒng)發(fā)育分析提供有用的特征。

關(guān)鍵詞

頭喙亞目;?大葉蟬亞科;?生殖細(xì)胞;?精子形成;?超微結(jié)構(gòu);?副體

中圖分類號(hào)：

Q?964

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023271

Spermatogenesis?and?sperm?ultrastructure?of?Bothrogonia?qiongana?Yang?et?Li?（Hemiptera：?Cicadellidae）

CHEN?Shirui1，?CHEN?Zhejing1，?ZHENG?Xinran1，?LI?Jialing2，?ZHANG?Beibei1*

（1.?College?of?Forestry，?Hainan?University，?Danzhou?571737，?China;?2.?Wuzhishan?Branch?of?the?Management

Office?of?Hainan?Tropical?Rainforest?National?Park，?Wuzhishan?572200，?China）

Abstract

Sperm?ultrastructure?displays?a?great?variability?among?insect?groups?and?holds?great?significance?in?the?classification，?evolution，?and?phylogenetic?analysis?of?insects.?The?study?of?spermatogenesis?and?sperm?ultrastructure?in?Cicadellidae?can?provide?additional?valuable?characters?for?phylogenetic?analysis?of?both?Cicadellidae?and?Auchenorrhyncha.?Spermatogenesis?and?sperm?ultrastructure?of?the?leafhopper?Bothrogonia?qiongana?Yang?et?Li?were?investigated?using?light?and?electron?microscopy.?During?spermiogenesis，?the?acrosome?originated?from?the?Golgi?apparatus，?while?the?mitochondrial?derivatives?formed?through?the?aggregation?and?fusion?of?numerous?mitochondria?in?the?spermatid?cytoplasm.?The?flagellar?axoneme?was?generated?by?the?centriole.?Spermatid?components?were?surrounded?by?a?single?layer?of?microtubules，?which?played?a?critical?role?in?the?spermatid?elongation?during?spermiogenesis，?which?then?disappeared?in?mature?spermatozoa.?The?spermatozoa?exhibited?an?elongated，?filiform?structure.?The?sperm?heads?were?arranged?in?a?row?with?a?ropelike?structure，?forming?a?pectinate?sperm?bundle.?The?conical?acrosome?possessed?a?subacrosomal?space?and?formed?two?acrosomal?processes?inserting?into?both?sides?of?the?anterior?part?of?nucleus.?The?nucleus?was?cylindrical，?with?a?flattened?base，?and?its?marginal?depression?connected?to?the?two?mitochondrial?derivatives?of?the?flagellum?through?a?lamellate?centriolar?adjunct.?The?flagellum?was?composed?of?a?9+9+2?axoneme，?two?symmetrical?mitochondrial?derivatives，?two?short?accessory?bodies，?two?small?subellipsoidal?structures，?and?a?centerflagellar?material.?Two?ovoid?and?short?accessory?bodies?observed?only?in?the?flagellums?initial?region?of?Bothrogonia?qiongana，?were?quite?different?from?those?of?species?in?Deltocephalinae.?Combined?with?the?reported?data?from?other?auchenorrhynchans，?these?accessory?bodies?likely?provide?valuable?characters?for?phylogenetic?analysis?of?Cicadellidae?and?Auchenorrhyncha.

Key?words

Auchenorrhyncha;?Cicadellinae;?germ?cell;?spermiogenesis;?ultrastructure;?accessory?body

葉蟬科Cicadellidae是昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera頭喙亞目Auchenorrhyncha中最大的類群，目前已知記載約1?500屬20?000余種［1］，廣泛分布于世界各地，是生態(tài)系統(tǒng)中昆蟲物種最豐富的類群之一。該類昆蟲具有典型的刺吸式口器和較強(qiáng)的生殖力，其通過吸食植物汁液影響植物生長(zhǎng)，一些種類還可以傳播植物病毒，是重要的農(nóng)林業(yè)害蟲。然而，葉蟬科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系至今仍存在較大爭(zhēng)議［214］。近年來，基于形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育研究認(rèn)為葉蟬科是并系群，科內(nèi)窄頰葉蟬亞科Ulopinae和圓痕葉蟬亞科Megophthalminae互為姊妹群，與角蟬分支（犁胸蟬科Melizoderidae、美角蟬科Melizoderidae和角蟬科Membracidae）聚成一支［5，8，14］，而葉蟬科其他亞科支系間親緣關(guān)系仍處于爭(zhēng)論中。因此，若要完善葉蟬科的系統(tǒng)發(fā)育分析，還需尋找更多的特征依據(jù)。

精子是有性生殖動(dòng)物中高度特化且形態(tài)最多樣化的一類特殊細(xì)胞［15］，對(duì)種族的繁衍、延續(xù)至關(guān)重要。昆蟲精子因快速、趨異的進(jìn)化特性，形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，尤其是精子的超微結(jié)構(gòu)在不同類群間表現(xiàn)出顯著差異，可為昆蟲分類、進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育分析提供有效的特征依據(jù)［1622］。然而，關(guān)于葉蟬科昆蟲的精子超微結(jié)構(gòu)研究迄今僅涉及少數(shù)種類，其中精子超微結(jié)構(gòu)被完整研究的種類只有6種，包括玉米黃翅葉蟬Dalbulus?maidis?（Delong?&?Wolcott）、條沙葉蟬Psammotettix?striatus?（Linnaeus）、橫線頂帶葉蟬Exitianus?nanus?（Distant）、短二室葉蟬Balclutha?brevis?Lindberg、大青葉蟬Cicadella?viridis?（Linnaeus）和白邊大葉蟬Kolla?paulula?（Walker）［2328］。因此，亟須開展更多葉蟬科昆蟲的精子研究。

瓊凹大葉蟬Bothrogonia?qiongana?Yang?et?Li，?1980，隸屬于葉蟬科大葉蟬亞科Cicadellinae凹大葉蟬屬Bothrogonia，已知分布于中國華中、華南等地山間陰濕林區(qū)，尤其在海南地區(qū)廣泛分布，為害林木及近林區(qū)農(nóng)作物，是一類重要潛在農(nóng)林業(yè)害蟲［29］。本研究采用光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)，對(duì)瓊凹大葉蟬雄性生殖器官、精子發(fā)生及精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究，旨在為葉蟬科及頭喙亞目系統(tǒng)發(fā)育分析提供更多有用的特征依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試標(biāo)本

瓊凹大葉蟬雄成蟲于2020年，2021年的6月－8月在海南省五指山市海南熱帶雨林國家公園五指山片區(qū)（18°54′N，?109°40′E）掃網(wǎng)捕獲。網(wǎng)捕采集的成蟲裝入預(yù)先盛放有新鮮枝條的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2?光學(xué)顯微鏡樣品制備與觀察

用乙酸乙酯將新鮮雄性活體成蟲麻醉，放入盛有磷酸緩沖液（0.1?mol/L?PBS，?pH?7.2）的凹面皿中，在Olympus?SZX7體視顯微鏡下迅速解剖，獲得完整的雄性生殖系統(tǒng)，并置于裝有HQimagie?C630成像系統(tǒng)的Nikon?SMZ800N光學(xué)體視顯微鏡下觀察、拍照。

精子形態(tài)觀察：將快速解剖分離出來的貯精囊轉(zhuǎn)移至預(yù)先滴有磷酸緩沖液的潔凈載玻片上，破壁使囊內(nèi)精子游離出來，加蓋蓋玻片后置于連有Nikon?DSFi3成像系統(tǒng)的Nikon?NI/E顯微鏡下觀察、拍照。

精子細(xì)胞核形態(tài)觀察：將貯精囊置于預(yù)先滴有蒸餾水的潔凈載玻片上，破壁后使精子游離出來，室溫條件下晾干后用4，6二脒基2苯基吲哚（DAPI，?Beyotime）對(duì)精子進(jìn)行染色，蒸餾水沖洗干凈后在顯微鏡下觀察、拍照。

在同一顯微鏡下，隨機(jī)拍攝50個(gè)精子和精子細(xì)胞核，采用NISElements?（D?5.20.00）軟件測(cè)量長(zhǎng)度，并結(jié)合Excel?2010軟件及SPSS進(jìn)行精子長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)、分析。

1.3?透射電子顯微鏡樣品制備與觀察

樣品預(yù)處理：用乙酸乙酯將新鮮雄性活體成蟲麻醉，在低溫環(huán)境下將其置于盛有2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液的表面皿中，在體視顯微鏡下快速解剖。將精巢小管和貯精囊剪切為1?mm3的樣塊，投入盛有添加3%蔗糖溶液的多聚甲醛戊二醛固定液的離心管中，4℃條件下避光固定12?h以上。

透射電子顯微鏡樣品制備與觀察：預(yù)處理后的樣品室溫條件下用磷酸緩沖液漂洗，4℃條件下置于1%鋨酸中固定2?h，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后用乙醇溶液（30%、50%、75%、80%、90%、100%）逐級(jí)脫水。脫水后的樣品依次經(jīng)過不同濃度的乙醇LR?White樹脂混合物（乙醇和LR?White樹脂體積比為3∶1，1∶1和1∶3）及純LR?White樹脂滲透后包埋，并置于烘箱內(nèi)于60℃條件下聚合48?h。聚合好的樣品膠粒使用Leica?EM?UC7超薄切片機(jī)進(jìn)行定位及切片，切片厚度約70?nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，在Hitachi?HT7700透射電子顯微鏡80?kV下觀察并拍照。

1.4?組織學(xué)觀察

聚合好的樣品膠粒經(jīng)修整后，用裝有玻璃刀的切片機(jī)切成厚度約800?nm的半薄切片。將樣品切片置于預(yù)先滴有蒸餾水的潔凈載玻片水滴上，烤干后經(jīng)0.5％甲苯胺藍(lán)染色，蒸餾水沖洗，再次烤干，最后在顯微鏡下觀察、拍照。

2?結(jié)果與分析

2.1?瓊凹大葉蟬雄性生殖器官

瓊凹大葉蟬雄性生殖系統(tǒng)由精巢、輸精管、貯精囊、附腺、射精管及外生殖器組成（圖1A）。其中1對(duì)精巢左右對(duì)稱，各由12個(gè)長(zhǎng)度約為1.27?mm的淡黃色指狀精巢小管組成，基部連接輸精管。2條輸精管細(xì)長(zhǎng)，前端略粗，后端較細(xì)，末端膨大形成長(zhǎng)卵形、長(zhǎng)寬比約為5∶1的淡黃色貯精囊，并與1對(duì)發(fā)達(dá)的附腺連接側(cè)射精管。2條側(cè)射精管末端匯合形成膨大、近球狀的中射精管，最后與外生殖器連接（圖1A）。

2.2?瓊凹大葉蟬精子發(fā)生

瓊凹大葉蟬精子發(fā)生在精巢小管中以精囊為單位同步進(jìn)行細(xì)胞分裂、形變（圖2A～D）。精巢小管頂端精原細(xì)胞被非生殖性細(xì)胞包圍形成精囊（圖2A，星號(hào)），精原細(xì)胞在精囊中進(jìn)行多次有絲分裂產(chǎn)生精母細(xì)胞（圖2A，?2E）。精母細(xì)胞經(jīng)歷2次分裂產(chǎn)生精子細(xì)胞（圖2C，?2D，?2F），而精子細(xì)胞經(jīng)過形變最終形成線狀成熟精子（圖1C，?2F）。精子發(fā)生早期，隨著精原細(xì)胞的產(chǎn)生、分裂及增殖，精巢小管內(nèi)精囊逐漸增多，體積增大（圖2A～B），向基部移動(dòng)。精原細(xì)胞經(jīng)過多次連續(xù)有絲分裂后產(chǎn)生精母細(xì)胞，而處于精母細(xì)胞時(shí)期的精囊內(nèi)細(xì)胞體積較大，具有直徑約8.3?mm的細(xì)胞核，且在核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量為細(xì)胞分裂提供能量的線粒體（圖2C，?2E，?3A）。精子發(fā)生中期，精囊內(nèi)精母細(xì)胞經(jīng)歷2次分裂產(chǎn)生精子細(xì)胞（圖2B～D）。精子細(xì)胞相比于精母細(xì)胞，細(xì)胞核明顯較小，直徑約4.3?mm（圖2C，?2F）。

精子發(fā)生后期是精子細(xì)胞形變轉(zhuǎn)化為線狀精子的過程，又稱為精子形成時(shí)期。精子形成初期，精子細(xì)胞具有染色質(zhì)較均勻的圓球狀細(xì)胞核，而進(jìn)入精子形成早期細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)開始小區(qū)域凝集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體聚集融合形成連鎖狀副核結(jié)構(gòu)（圖3B）。隨著時(shí)間的延續(xù)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的高爾基復(fù)合體及原頂體結(jié)構(gòu)，同時(shí)細(xì)胞核基部出現(xiàn)由中心粒形變形成的基體結(jié)構(gòu)（圖3C）。原頂體顆粒出現(xiàn)在高爾基復(fù)合體凹窩內(nèi)，體積逐漸增大，并隨高爾基復(fù)合體開始移向細(xì)胞核頂端位置（圖3C，?3D）。細(xì)胞核基部基體產(chǎn)生軸絲結(jié)構(gòu)。隨著軸絲的出現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中副核開始移向軸絲兩側(cè)。精子形成中期，精子細(xì)胞細(xì)胞核由球狀開始向兩端伸長(zhǎng)，核內(nèi)的染色質(zhì)繼續(xù)凝集（圖3E）。而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的原頂體顆粒與高爾基復(fù)合體一起移動(dòng)至細(xì)胞核頂端，形成內(nèi)部具腔的頂體結(jié)構(gòu)（圖3F）。精子細(xì)胞核基部副核形成2條大小相等的線粒體衍生物，平行于軸絲結(jié)構(gòu)（圖4C）。頂體、細(xì)胞核及線粒體衍生物等結(jié)構(gòu)隨精子形成過程逐漸伸長(zhǎng)（圖4A，?4D），外圍具有一圈明顯的單層微管結(jié)構(gòu)（圖4B，?4C）。精子形成后期，細(xì)胞核基部中心粒周圍物質(zhì)逐漸在細(xì)胞核與線粒體衍生物之間形成中心粒側(cè)體結(jié)構(gòu)（圖4D）。精子細(xì)胞內(nèi)組成精子的各部分結(jié)構(gòu)繼續(xù)伸長(zhǎng)，同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)進(jìn)一步凝集。精子形成末期，精子細(xì)胞的細(xì)胞核伸長(zhǎng)呈圓柱狀，核內(nèi)染色質(zhì)變得致密（圖4E，?4F），核外微管層逐步消失，而精子細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)仍具有部分細(xì)胞質(zhì)殘余物質(zhì)（圖4F，星號(hào)）。隨著時(shí)間的推移，精子各組成部分完成伸長(zhǎng)過程，其中精子頭部頂體呈帽狀結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞核頂端，頸區(qū)中心粒側(cè)體沿鞭毛延伸成副體，鞭毛軸絲和兩條線粒體衍生物隨鞭毛延伸至末端。精子形變成熟后，與形成末期精子細(xì)胞區(qū)別的典型特征為精子質(zhì)膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)殘余物質(zhì)消失不見，呈現(xiàn)透明狀（圖6B，星號(hào)）。

2.3?瓊凹大葉蟬精子超微結(jié)構(gòu)

貯精囊內(nèi)成熟精子長(zhǎng)線狀，約（196.41±1.67）?μm（樣本量50，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤），主要由較短的頭部和細(xì)長(zhǎng)的鞭毛組成（圖1C），其中精子頭部細(xì)胞核長(zhǎng)約（39.01±0.22）?μm（圖1E），頭、尾長(zhǎng)度比約為1∶4。瓊凹大葉蟬精子整體形態(tài)無多態(tài)性現(xiàn)象，貯精囊內(nèi)成熟精子頭部頂端排列整齊由繩狀物質(zhì)連成一排，形成梳狀精子束（圖1B，?1D）。

精子頭部主要由致密的長(zhǎng)細(xì)胞核和位于細(xì)胞核頂端的頂體組成（圖5A，?5B）。頂體圓錐狀，長(zhǎng)度較短，約3?μm，基部直徑約0.4?μm，由纖維管狀結(jié)構(gòu)組成（圖5A，?5B）。頂體頂端通常插入胞外基質(zhì)中，后端多呈帽狀插入精核頂端，頂體內(nèi)形成頂體腔（圖5A，?B）。頂體腔直徑漸增，前端通常不與頂體同軸心，后端多不規(guī)則。頂體末端兩側(cè)多延伸成突起插入細(xì)胞核頂端，橫切圖上清晰可見（圖5A）。細(xì)胞核細(xì)長(zhǎng)，圓柱狀（圖1C，?1E，?5C），由致密染色質(zhì)組成。精核直徑自頂端處至基部漸增，0.4～0.6?μm，其橫切由前端橢圓形至特殊的不規(guī)則五邊形（圖5A，?6A，?6B）。

頭部細(xì)胞核與尾部鞭毛的連接區(qū)為精子頸區(qū)，主要由中心粒和中心粒側(cè)體組成。瓊凹大葉蟬精子細(xì)胞核末端平截、一側(cè)凹陷，由中心粒連接尾部軸絲，而凹陷區(qū)域出現(xiàn)中心粒側(cè)體連接鞭毛線粒體衍生物（圖5D，?5E）。從精子頸區(qū)的橫、縱切圖中可見，中心粒側(cè)體為致密片層狀結(jié)構(gòu)，在精核凹陷區(qū)緊鄰細(xì)胞核，長(zhǎng)度從凹陷區(qū)前端延伸至鞭毛軸絲區(qū)，連接精核和線粒體衍生物（圖5D，?5E，?6C，?6D，?7A）。

瓊凹大葉蟬精子尾部鞭毛較長(zhǎng)，主要由1條軸絲，2條線粒體衍生物，2條副體，2條細(xì)小附結(jié)構(gòu)及鞭毛中心物質(zhì)組成（圖1C，?6E）。鞭毛中線粒體衍生物為1對(duì)長(zhǎng)度和直徑大小對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度延伸至鞭毛末端，占據(jù)整個(gè)鞭毛的大部分區(qū)域。從縱切圖中可見，線粒體衍生物由一列垂直于縱軸、規(guī)則排列的嵴狀結(jié)構(gòu)組成，其中嵴狀結(jié)構(gòu)間隔13?nm，直徑38?nm（圖5E）。隨鞭毛長(zhǎng)度向后延伸，線粒體衍生物橫切呈現(xiàn)出不同形狀，前端卵圓狀，中間兔耳狀，后端芒果狀（圖6C～F）;且從橫切圖中可明顯看到線粒體衍生物具有電子稀疏區(qū)和電子致密區(qū)，其中底部電子致密區(qū)有晶狀體結(jié)構(gòu)（圖7D）。此外，從橫、縱切圖中明顯可見線粒體衍生物基部區(qū)域中央具有電子稀疏的間隙區(qū)（圖6D，?6E，箭頭），且間隙區(qū)直徑隨線粒體衍生物長(zhǎng)度延伸變大，之后消失不見（圖5E，?6D，?6E，?6F，?7B）。

鞭毛軸絲較長(zhǎng)，始于中心粒延伸達(dá)整個(gè)鞭毛，具有典型的9+9+2型微管模式，即中央2個(gè)中心微管，內(nèi)層9個(gè)雙微管，外圍9個(gè)副微管（圖6E，?6F）。其中軸絲副微管間有粗纖維，雙微管有動(dòng)力蛋白臂及伸向中心微管的輻射鏈。沿鞭毛長(zhǎng)度的延伸，鞭毛中副體和線粒體衍生物相繼消失，末端規(guī)則排列的軸絲結(jié)構(gòu)逐漸變得雜亂無序（圖6A）直至消失。鞭毛中兩條副體平行于軸絲，位于軸絲和線粒體衍生物之間（圖6E）。副體結(jié)構(gòu)細(xì)小，直徑約100?nm，橫切呈現(xiàn)規(guī)則的橢圓形或近圓形，同時(shí)副體內(nèi)側(cè)出現(xiàn)細(xì)小附結(jié)構(gòu)（圖6E，?7D）。副體長(zhǎng)度較短，協(xié)同內(nèi)側(cè)細(xì)小附結(jié)構(gòu)隨鞭毛長(zhǎng)度延伸而消失，僅出現(xiàn)在鞭毛起始區(qū)域，明顯短于軸絲和線粒體衍生物（圖6E，?6F）。此外，研究發(fā)現(xiàn)精子鞭毛基部，軸絲與線粒體衍生物中間還出現(xiàn)了鞭毛中心物質(zhì)（圖7A～C）。

3?結(jié)論與討論

瓊凹大葉蟬具有葉蟬科已報(bào)道種類的精子形成及形態(tài)結(jié)構(gòu)的共同特征：1）精子細(xì)胞內(nèi)高爾基復(fù)合體形成精子頂體，線粒體融合形變?yōu)榫€粒體衍生物，中心粒產(chǎn)生軸絲結(jié)構(gòu);2）單層微管結(jié)構(gòu)在精子形成過程中圍繞精子各組成部分，在精子成熟時(shí)消失;3）成熟精子細(xì)長(zhǎng)、線狀，無多態(tài)性，頭部聚集形成精子束;4）圓錐狀頂體長(zhǎng)度短，內(nèi)部具有頂體腔，末端兩側(cè)多延伸2條突起插入細(xì)胞核頂端;5）圓柱狀細(xì)胞核染色質(zhì)致密，末端平截、側(cè)邊多凹陷;6）頸區(qū)中心粒連接軸絲與平截細(xì)胞核，片層狀中心粒側(cè)體于細(xì)胞核凹陷區(qū)連接細(xì)胞核與線粒體衍生物;7）尾部鞭毛細(xì)長(zhǎng)，多由1條9+9+2型軸絲，2條副體，2條線粒體衍生物組成;8）2條副體結(jié)構(gòu)相對(duì)較小，隨鞭毛長(zhǎng)度延伸最先消失;9）線粒體衍生物大小相等，由嵴狀結(jié)構(gòu)組成，內(nèi)部多具有晶狀體結(jié)構(gòu)［2328，30］。但瓊凹大葉蟬也有其獨(dú)特的特征，即橫切呈五邊形的細(xì)胞核、電子稀疏間隙區(qū)直徑增大的線粒體衍生物。

線粒體衍生物作為昆蟲精子鞭毛中重要的結(jié)構(gòu)組成部分之一，由昆蟲精子細(xì)胞內(nèi)線粒體衍化形成，為精子運(yùn)動(dòng)提供能量。本研究中瓊凹大葉蟬線粒體衍生物基部區(qū)域具有直徑明顯增大的電子稀疏間隙區(qū)。在已報(bào)道葉蟬科種類中僅白邊大葉蟬具有該結(jié)構(gòu)［27］，但不同的是白邊大葉蟬間隙區(qū)直徑均一、無明顯變化趨勢(shì)。半翅目昆蟲除頭喙亞目廣蠟蟬類（間隙區(qū)小、不明顯，橫切多呈圓形），其他類群同大多數(shù)昆蟲一樣線粒體衍生物中無類似的間隙區(qū)結(jié)構(gòu)［19，3132］?；诰€粒體衍生物間隙區(qū)，我們認(rèn)為大葉蟬亞科中凹大葉蟬屬與邊大葉蟬屬Kolla的親緣關(guān)系近，而非大葉蟬屬，這與孟澤洪等［33］根據(jù)線粒體Cyt?b基因得出的凹大葉蟬屬與邊大葉蟬屬親緣關(guān)系較近的研究結(jié)果相符合，但由于大葉蟬亞科昆蟲精子結(jié)構(gòu)涉及種類較少，仍有待于進(jìn)一步研究。此外，瓊凹大葉蟬精子鞭毛中出現(xiàn)了2條位于線粒體衍生物、軸絲和副體之間的細(xì)小附結(jié)構(gòu)，以及位于鞭毛基部軸絲、線粒體衍生物之間的鞭毛中心物質(zhì)，這與玉米黃翅葉蟬和短二室葉蟬的一致，也說明以上兩種結(jié)構(gòu)并非角頂葉蟬亞科獨(dú)有的特征［26，28］。關(guān)于2條特殊的細(xì)小附結(jié)構(gòu)，研究者曾認(rèn)為該結(jié)構(gòu)可能是由軸絲周圍膜池殘余物形成［26］。盡管也有類似的細(xì)小附結(jié)構(gòu)出現(xiàn)于異翅亞目、長(zhǎng)翅目、直翅目昆蟲精子鞭毛中［22，3437］，但它們是否為同一類結(jié)構(gòu)以及它們的來源、功能目前都尚不清楚，仍需開展更多深入的研究。

瓊凹大葉蟬精子發(fā)生過程中精子細(xì)胞外圍繞的單層微管結(jié)構(gòu)，僅出現(xiàn)在精子形成期各組成部分伸長(zhǎng)過程中，在精子成熟時(shí)消失不見，與已報(bào)道種類一致［27，30］。研究發(fā)現(xiàn)微管結(jié)構(gòu)對(duì)精子細(xì)胞的形變和伸長(zhǎng)起重要作用，且該結(jié)構(gòu)與中心粒周圍物質(zhì)密切相關(guān)［38］。精子發(fā)生過程中中心粒周圍物質(zhì)參與了微管生成（主要為γ微管蛋白），而其剩余部分則會(huì)在精子形成后期沉積形成中心粒側(cè)體。大多數(shù)昆蟲的中心粒側(cè)體會(huì)沿著鞭毛向后伸長(zhǎng)形成2條副體結(jié)構(gòu)，雖然二者之間的直接聯(lián)系已被證實(shí)［17，38］，但它們的具體功能還尚不清楚。本研究中瓊凹大葉蟬片層狀中心粒側(cè)體連接細(xì)胞核與線粒體衍生物，延伸至鞭毛軸絲區(qū)后形成2條長(zhǎng)度較短、橫切呈橢圓形的副體結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，葉蟬科昆蟲精子副體在不同亞科類群間差異較大，在角頂葉蟬亞科副體長(zhǎng)度較長(zhǎng)幾乎延伸至鞭毛端部，橫切呈不規(guī)則三角形［2526，28］;而在大葉蟬亞科副體長(zhǎng)度較短僅出現(xiàn)在鞭毛起始區(qū)域，橫切呈橢圓形［24，27］。此外，副體結(jié)構(gòu)在頭喙亞目不同類群間也具有較大差異，其中蟬總科和沫蟬總科昆蟲缺少副體結(jié)構(gòu)［3943］，蠟蟬總科昆蟲副體結(jié)構(gòu)異常發(fā)達(dá)［3132，44］，角蟬總科昆蟲副體結(jié)構(gòu)相對(duì)較為發(fā)達(dá)［2428，45］。由于在不同類群間表現(xiàn)出較大變異，我們推測(cè)副體結(jié)構(gòu)很有可能為葉蟬科分類及半翅目頭喙亞目高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育分析提供有用的特征。

精子發(fā)生過程中精原細(xì)胞經(jīng)過一系列分裂、形變最終成為成熟精子。節(jié)肢動(dòng)物尤其是六足類雄性個(gè)體精子成熟后通常發(fā)生一定程度的精子接合形成精子束，以提高交配期間精子傳輸率，從而更有效地延續(xù)種族。關(guān)于精子接合方式，昆蟲有初級(jí)接合（源于自身精子發(fā)生過程，由單個(gè)精原細(xì)胞產(chǎn)生的全部精子頭部嵌入精囊細(xì)胞或包裹于帽狀物質(zhì)內(nèi)形成精子束）和次級(jí)接合（精子發(fā)生完成后游離精子通過特定物質(zhì)接合在一起形成精子束）2種方式，其中次級(jí)接合被認(rèn)為比初級(jí)接合更為進(jìn)化［46］。已報(bào)道頭喙亞目類昆蟲貯精囊中均有精子束存在，且精子頭部多插入胞外基質(zhì)。本研究中瓊凹大葉蟬精子在貯精囊內(nèi)由繩狀物質(zhì)連接頭部頂端形成梳狀精子束，與已報(bào)道葉蟬的彗星狀、沫蟬的球狀精子束差異較大，與蟬科昆蟲的繩狀精子束相類似［2526，28，3940，43］。結(jié)合精子發(fā)生特點(diǎn)及精子束形態(tài)，我們推斷瓊凹大葉蟬精子接合方式為次級(jí)接合，與Barcellos等［28］認(rèn)為的沫蟬總科和角蟬總科精子初級(jí)接合方式觀點(diǎn)不同，與Higginson等［46］的觀點(diǎn)相一致。盡管研究證實(shí)凹大葉蟬精子束繩狀連接物質(zhì)為透明蛋白質(zhì)類物質(zhì)［47］，但其來源、作用機(jī)理仍不清楚。明確頭喙亞目各類群間精子接合方式、接合物質(zhì)來源及其作用機(jī)理或許可為研究頭喙亞目種群進(jìn)化提供相應(yīng)的研究思路，但由于頭喙亞目昆蟲精子結(jié)構(gòu)研究涉及類群種類較少，亟須開展更多的研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）