王寶才 李俊江 李榮焜

【摘 要】 目的：考察三黃膏制備工藝改進(jìn)對(duì)其體外藥物釋放特性的影響。方法：用人工尼龍膜作為半透膜，采用Franz直立式擴(kuò)散池考察三黃膏的釋放特性，應(yīng)用HPLC測(cè)定接收液介質(zhì)中小檗堿的含量，以美國(guó)FDA與歐盟體外釋放指南考察三黃膏變更前后質(zhì)量一致性，并對(duì)變更后的三黃膏釋放動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合。結(jié)果：變更前三黃膏（即參比制劑）單位面積累積滲透量（Atotal）為（556.35±28.65）μg/cm2，變更后三黃膏（即試驗(yàn)制劑）單位面積累積滲透量（Atotal）為（507.54±25.07）μg/cm2。試驗(yàn)制劑與參比制劑的中位體外釋放率比值、體外釋放率平均值比率、單位面積滲透總量（Atotal）平均值比率均符合美國(guó)FDA與歐盟的體外釋放指南要求。釋放動(dòng)力學(xué)過程符合零級(jí)和Hixson-Crowell釋放模型，Hixson-Crowell方程表明小檗堿釋放符合被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制。結(jié)論：試驗(yàn)制劑與參比制劑的體外釋放具有一致性，三黃膏工藝變更符合預(yù)期。

【關(guān)鍵詞】 三黃膏；體外釋放；小檗堿；一致性；工藝變更

【中圖分類號(hào)】R282.6?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2024）09-0040-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.09.zgmzmjyyzz202409010

Effect of Improved Preparation Process of Sanhuang Plaster on its Drug Release Characteristics in Vitro

WANG Baocai1 LI Junjiang1* LI Rongkun2

1.Center for Scientific Research Preparation，Gansu Provincial Hospital of TCM， Lanzhou 730050，China;

2.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000，China

Abstract：Objective Effect of improved preparation process of Sanhuang plaster on its drug release characteristics in vitro.Methods The artificial nylon membrane was used as the semi permeable membrane， and the vertical Franz diffusion cell was used to investigate the release characteristics of Sanhuang plaster. The content of berberine in the receiving medium was determined by HPLC. The quality consistency of Sanhuang plaster before and after the change was investigated according to the in vitro release guidelines of FDA and EU， and the release kinetics of Sanhuang plaster after the change was fitted. Result Before the change， the accumulated permeation amount （Atotal） per unit area of Sanhuang plaster （reference preparation） was （556.35±28.65）μg/cm2， after the change， the cumulative permeation amount （Atotal） per unit area of Sanhuang plaster （test preparation） is （507.54±25.07）μg/cm2。The median in vitro release rate ratio， average in vitro release rate ratio， and average permeability per unit area （Atotal） ratio of the test preparation and the reference preparation all conform to the requirements of the in vitro release guidelines of the US FDA and the EU. The release kinetics process conforms to zero order and Hixson Crowell release model. Hixson Crowell equation shows that berberine release conforms to passive diffusion mechanism.Conclusion The in vitro release of the test preparation was consistent with that of the reference preparation， and the process change of Sanhuang plaster was in line with expectations.

Keywords：Sanhuang Plaster;In Vitro Release;Berberine;Consistency; Process Change

三黃膏（甘藥制備字Z20190333000）由黃連、黃柏、黃芩及冰片組成，具有清熱止痛、去腐生肌之功效，用于痔瘺、肌肉腐爛等癥。該制劑在甘肅省中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年，目前在甘肅全省醫(yī)療機(jī)構(gòu)調(diào)劑使用。由于該制劑注冊(cè)時(shí)間較早，原制備工藝采用全方打粉入藥，由于處方藥材的纖維性極強(qiáng)，筆者曾嘗試采用超微粉碎，所得藥粉亦含有超過180 μm的微粒，從而導(dǎo)致三黃膏粒度檢查難以符合2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0109軟膏劑乳膏劑項(xiàng)下［粒度］規(guī)定［1］，由此產(chǎn)生了藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。為了解決三黃膏存在的上述問題，本研究將黃連、黃柏、黃芩提取后制成干浸膏粉，用干浸膏粉制備三黃膏，由于浸膏粉無組織結(jié)構(gòu)，粉碎后其粒度滿足制劑要求。為了使三黃膏工藝變更前后質(zhì)量保持一致性，故對(duì)其體外釋放進(jìn)行考察研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 PerkinElmer A-10型高效液相色譜儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀、Franz 直立式擴(kuò)散池（上海黃海藥檢儀器有限公司）；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SB-5200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)（寧波新芒生物科技股份有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 黃連（批號(hào)：201102）購自安徽省神草堂國(guó)藥有限公司，黃柏（批號(hào)：210626）購自康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司，黃芩（批號(hào)：210801）購自甘肅冠蘭中藥飲片有限責(zé)任公司，冰片（批號(hào)：201201）購自江蘇同濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李俊江主任中藥師鑒定符合《中國(guó)藥典》2020年版黃連、黃柏、黃芩、冰片藥材項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201814）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白凡士林（批號(hào)：20210606）購自南昌白云藥業(yè)有限公司。乙腈為色譜純（購自天津市大茂化學(xué)試劑廠），水為超純水（自制），無水乙醇、甲醇、鹽酸、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉、磷酸均為分析純，氯化鈉注射液（0.9%，即生理鹽水），尼龍膜（70 μm，購自北京賽福萊博科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 三黃膏的制備 參比制劑（R）：黃連、黃柏、黃芩粉碎過120目篩，混勻，備用；冰片粉碎過100目篩。上述藥粉、冰片粉與適量白凡士林混勻，即得。

試驗(yàn)制劑（T）：黃連與黃柏加11倍量水煎煮2次，每次煎煮95 min，收集濾液；黃芩煎煮2次，第1次加12倍量水，第2次加10倍量水，每次煎煮2 h，收集濾液［2］。將上述濾液合并，濃縮至飲片∶濃縮液=1∶2～1∶2.5（重量比），濃縮液在70 ℃干燥16 h，所得干浸膏粉碎過120目篩，混勻，備用；冰片粉碎過100目篩。上述浸膏粉、冰片粉與適量白凡士林混勻，即得。

2.2 接收液中小檗堿含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取鹽酸小檗堿2.01 mg，置10 mL容量瓶中，加生理鹽水-無水乙醇（50∶50）至刻度，搖勻，即得201 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品母液。取5 mL對(duì)照品母液置10 mL容量瓶中，定容至刻度，即得濃度為100.5 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Kromasil 100-5-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g與磷酸0.4 mL）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL［3］。

2.2.3 供試品溶液制備 取適量接收液，水浴蒸干，殘?jiān)尤脒m量甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液，稱定重量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液［3］。

2.2.4 缺黃連、黃柏陰性樣品溶液的制備 按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)制劑的制備方法，制備缺黃連、黃柏陰性樣品，取1 g按照“2.6.3”項(xiàng)下方法制備，即得陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性考察 取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.6.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，小檗堿與其它組分能夠達(dá)到基線分離，且陰性樣品無干擾，表明該方法專屬性良好。高效液相色譜圖如圖1所示。

2.2.6 線性關(guān)系與檢測(cè)限、定量限考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液分別自動(dòng)進(jìn)樣1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，再按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)照品含量（μg，x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4789306.97x-34113.58（r2=0.9997），線性范圍0.1005～2.01 μg。將小檗堿對(duì)照品溶液逐步稀釋，3倍信噪比（S/N=3∶1）時(shí)，小檗堿檢測(cè)限為3.5175 ng；10倍信噪比（S/N=10∶1）時(shí)，小檗堿定量限為9.9495 ng［4］。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。結(jié)果表明，RSD=1.34%（n=5），該儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三黃膏的接收液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算小檗堿含量。結(jié)果顯示，RSD=1.47%（n=5），該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.2.2” 項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，RSD=2.16%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的接收液1 mL，共9份分別置于具塞試管中，水浴蒸干。分別加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0.55 mL、0.55 mL、0.55 mL、0.73 mL、0.73 mL、0.73 mL、0.89 mL、0.89 mL、0.89 mL，水浴蒸干，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液1 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.3 體外釋放試驗(yàn)

2.3.1 擴(kuò)散池系統(tǒng) 采用Franz直立式擴(kuò)散池系統(tǒng)，擴(kuò)散池體積為8 mL，擴(kuò)散面積為2.2 cm2。

2.3.2 操作方法 尼龍膜在接收液中浸泡24 h［5］，將處理過的尼龍膜置于給藥池與擴(kuò)散池之間，用專用夾子緊固雙池。取1 g三黃膏加入給藥池中，用玻棒輕搗使軟膏與膜充分接觸，用封口膜密封給藥池。擴(kuò)散池中加入8 mL脫氣的接收液介質(zhì)即生理鹽水-無水乙醇（1∶1）的混合溶液，設(shè)置轉(zhuǎn)速為300 r/min，水浴溫度為（37±0.5）℃；分別于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h取4 mL接收液介質(zhì)［6］（同時(shí)補(bǔ)加同溫度等量的新鮮接收液介質(zhì)），水浴蒸干，加入4 mL甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下“稱定重量……即得供試品溶液”方法制備供試品溶液，按“2.2.2” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按下式計(jì)算累積滲透量Q（μg·cm2）［7］。

Q=VCn+∑n-1i=1V0CiA

式中：V為接收液介質(zhì)體積；V0為取樣體積；Cn為第n次取樣濃度；Ci為第i次取樣濃度；A為擴(kuò)散面積。

2.3.3 體外釋放數(shù)據(jù)的處理與分析 試驗(yàn)制劑（T）與參比制劑（R）中小檗堿在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積滲透量見表2，經(jīng)SPSS軟件方差分析（P=0.808），試驗(yàn)制劑與參比制劑在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積滲透量的差異不顯著［7］。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，單位面積累積滲透量為縱坐標(biāo)，繪制釋放曲線如圖2所示，可見試驗(yàn)制劑與參比制劑的釋放曲線較為一致。以Q與t（即時(shí)間的平方根）進(jìn)行線性擬合，回歸方程斜率即為體外釋放率。結(jié)果見表3。

體外釋放（IVRT）及體外滲透（IVPT）試驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)皮膚局部外用制劑藥學(xué)研究的重要技術(shù)方法。根據(jù)美國(guó)FDA發(fā)布的體外釋放試驗(yàn)（IVRT）的要求，將累積滲透量Q與t（即時(shí)間的平方根）進(jìn)行線性擬合，回歸方程的斜率代表制劑的體外釋放率（Jss，μg/cm2/h）；試驗(yàn)制劑與參比制劑各重復(fù)運(yùn)行6次，分別得到6個(gè)體外釋放率，將T的體外釋放率與R的體外釋放率兩兩相除，共得到36個(gè)單獨(dú)的比值，將36個(gè)比值按升序排列，排序的第8個(gè)與第29個(gè)比值分別是中位體外釋放率比值的90%置信區(qū)間的下限與上限［8］。故本試驗(yàn)中小檗堿體外釋放率比值的90%置信區(qū)間為86.41%～95.63%，符合90%置信區(qū)間在75%～133.33%范圍內(nèi)的要求。結(jié)果見表4。

根據(jù)歐盟體外滲透試驗(yàn)（IVPT）指導(dǎo)原則要求，試驗(yàn)制劑與參比制劑體外釋放率（Jss）平均值比率的90%置信區(qū)間為80%～125%；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)單位面積滲透總量（Atotal）平均值比率的90%置信區(qū)間亦為80%～125%［7-8］。本試驗(yàn)中小檗堿的體外釋放率與單位面積滲透總量平均值比率的90%置信區(qū)間均在80%～125%之間。結(jié)果見表5。

根據(jù)上述結(jié)果，可以判定試驗(yàn)制劑與參比制劑中小檗堿的體外釋放具有一致性，證明三黃膏制備工藝變更前后其內(nèi)在質(zhì)量具有一致性、穩(wěn)定性，變更后制備工藝科學(xué)、合理。

2.4 試驗(yàn)制劑中小檗堿釋藥模型擬合 對(duì)試驗(yàn)制劑中小檗堿的釋放動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合，結(jié)果見表6。表6中的相關(guān)系數(shù)表明，小檗堿釋放性能以零級(jí)和Hixson-Crowell釋放擬合較佳。其中 Hixson-Crowell方程表明小檗堿釋放符合被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制［9-10］。

3 討論

體外釋放試驗(yàn)最佳的半透膜為人體離體皮膚，由于涉及倫理問題，一般采用動(dòng)物皮膚、人工膜進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)研究。動(dòng)物皮膚常見的有豬皮、鼠皮等，其中豬皮的構(gòu)造、生理特性與人體皮膚較為相似；但動(dòng)物的性別、年齡、皮膚解剖部位、皮膚水化程度以及解剖人員的操作熟練程度均會(huì)影響藥物釋放行為。而人工膜具有良好的均勻性與穩(wěn)定性，應(yīng)用簡(jiǎn)便且價(jià)廉易得，故本研究選擇人工膜進(jìn)行三黃膏體外釋放試驗(yàn)研究［5］。

小檗堿是黃連、黃柏的主要有效成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。按照中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的定義與基本條件［11］，基于黃連、黃柏傳統(tǒng)功效、藥性、化學(xué)成分有效性與可測(cè)性、所處的配伍環(huán)境的Q-marker預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，小檗堿是三黃膏發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其可以作為該研究中的質(zhì)量標(biāo)志物。故對(duì)小檗堿釋放性能進(jìn)行考察具有重要的意義。

小檗堿為季銨型生物堿，其在水中的溶解度較小，故接收液介質(zhì)中需要加入適量的醇類提高小檗堿的溶解度，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選擇生理鹽水-無水乙醇（1∶1）的混合溶液作為接收液介質(zhì)。接收液介質(zhì)須脫氣后使用，以避免產(chǎn)生氣泡附著在人工膜上影響藥物釋放。補(bǔ)充新鮮接收液介質(zhì)時(shí)需注意操作方法，盡量避免將空氣注入接收池，若不慎產(chǎn)生氣泡應(yīng)調(diào)整擴(kuò)散池角度并輕輕敲擊使氣泡從側(cè)臂逸出。

研究從體外釋放一致性角度考察了三黃膏工藝變更對(duì)藥物釋放的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三黃膏變更后工藝合理、可行；筆者后續(xù)將通過體外抑菌試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)工藝改進(jìn)對(duì)三黃膏藥效學(xué)的影響。作者在查閱文獻(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有研究采用Q-t進(jìn)行線性擬合，亦有采用Q-t進(jìn)行線性擬合的；經(jīng)過查證，國(guó)家藥審中心組織翻譯并最終核準(zhǔn)的文本中描述的是“用單位面積釋放的藥物量（mcg/cm2）相對(duì)時(shí)間平方根繪圖應(yīng)生成一條直線”，因此在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)應(yīng)采用Q-t進(jìn)行線性擬合，這一細(xì)節(jié)須引起研究者的注意。

由于歷史及管理原因，醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑存在制備工藝粗放，生產(chǎn)工藝與批件不符的情況，特別對(duì)于局部外用制劑而言，制備工藝變更后，須采用體外釋放比較試驗(yàn)，應(yīng)證明變更前后制劑的中位體外釋放速率在可接受的限度之內(nèi)，從而保證變更前后療效、質(zhì)量具有一致性，為工藝變更的合理性提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：11-12.

［2］于蓓蓓，呂凌，于宗淵，等.藥效學(xué)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選黃芩提取工藝［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（24）：4314-4318.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：316-318.

［4］羅家敏，高雯，李萍.指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法的梔子質(zhì)量控制方法研究［J］.中草藥，2022，53（11）：3480-3486.

［5］侯迪旭，王東凱.關(guān)于半固體制劑中藥物的體外釋放研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥劑學(xué)雜志（網(wǎng)絡(luò)版），2019，17（4）：135-140.

［6］肖學(xué)成，熊馳，彭秀菊，等.HPLC測(cè)定他克莫司軟膏體外透皮吸收［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（7）：839-843.

［7］劉孟洋，李蒙，王增明，等.復(fù)方利多卡因乳膏體外透皮一致性研究［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2022，42（12）：1186-1191.

［8］周剛，付曉婷，潘靜茹，等.他克莫司軟膏透皮一致性的體外Franz擴(kuò)散池測(cè)定比較研究［J］.藥物分析雜志，2020，40（12）：2126-2133.

［9］張悅，吳忠斌，陳建明.土荊芥油自微乳化釋藥系統(tǒng)的體外釋藥特性研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2009，18（14）：1364-1368，1376.

［10］王寶才，李國(guó)鐸.潰平寧胃漂浮片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)藥房，2022，33（1）：69-73.

［11］劉昌孝，陳士林，肖小河，等.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）：中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念［J］.中草藥，2016，47（9）：1443-1457.

（收稿日期：2023-08-04 編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：白銀市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2021-2-25Y）。

作者簡(jiǎn)介：王寶才（1986—），男，漢族，碩士，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型。E-mail：398360652@qq.com

通信作者：李俊江（1972—），男，漢族，本科，主任中藥師，研究方向?yàn)樵簝?nèi)中藥制劑研發(fā)。E-mail：2271442179@qq.com