黃志睿 廖至雯 羅紅麗

摘要：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起橡膠樹炭疽病的優(yōu)勢(shì)小種，橡膠樹感染后會(huì)大量減產(chǎn)。自噬現(xiàn)象是植物病原真菌中普遍存在的生理過程，自噬過程會(huì)受到多個(gè)自噬相關(guān)基因（ATG）的調(diào)控，在病原真菌對(duì)逆境的響應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和致病性方面具有重要作用。本研究克隆了橡膠樹膠孢炭疽菌的ATG20同源基因CgATG20，構(gòu)建了該基因的敲除突變株△CgATG20，并對(duì)其致病性、孢子產(chǎn)量、組織侵染情況和自噬情況等進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與野生型相比，△CgATG20的致病性、分生孢子產(chǎn)量和對(duì)植物的入侵率顯著降低。在缺氮條件下，△CgATG20菌絲體中自噬小體的數(shù)量顯著少于野生型。以上結(jié)果表明ATG20在膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)發(fā)育、致病性和自噬中發(fā)揮重要作用，這為尋找有效阻斷病原真菌發(fā)育和侵染途徑的防治策略提供了新的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；膠孢炭疽菌；自噬；ATG20；致病力

中圖分類號(hào)：S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）04-0636-09

Function of the autophagy-related gene ATG20 in Colletotrichum gloeosporioides in Hevea brasiliensis

HUANG Zhi-rui1，LIAO Zhi-wen2，LUO Hong-li 1

（1.Sanya Institute of Breeding and Multiplication， Hainan University， Sanya 572000， China;2.Hainan Yazhou Bay Seed Laboratory， Sanya 572000， China）

Abstract：Colletotrichum gloeosporioides is the dominant race that causes anthracnose on rubber trees， resulting in substantial reduction in rubber production. Autophagy is a common physiological process in plant pathogenic fungi， which is regulated by multiple autophagy related genes （ATG） and plays an important role in stress response， growth and pathogenicity of pathogenic fungi. In this study， the ATG20 homologous gene in C. gloeosporioides of rubber tree was cloned and named as CgATG20， and the CgATG20 gene knockout mutant △CgATG20 was constructed. The pathogenicity， spore production， tissue infection and autophagy of the mutant △CgATG20 were analyzed. The results showed that the pathogenicity， conidium production and plant invasion rate of △CgATG20 were significantly reduced compared with wild type. Under the condition of nitrogen deficiency， the number of autophagosomes in △CgATG20 mycelium was significantly less than that of wild type. The above results indicate that ATG20 plays an important role in the growth and development， pathogenicity and autophagy of C. gloeosporioides， which provides a new target for finding control strategies that can effectively block the development and infection pathways of pathogenic fungi.

Key words：rubber tree；Colletotrichum gloeosporioides;autophagy;ATG20;pathogenicity

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中在進(jìn)化上高度保守的、用于降解并利用細(xì)胞內(nèi)過多或異常的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的過程[1]。當(dāng)自噬被誘導(dǎo)后，首先自噬膜在自噬體組裝位點(diǎn)（PAS）處延伸形成自噬泡，隨后多種蛋白質(zhì)和膜材料參與自噬膜的延伸、融合和擴(kuò)張，最終形成雙層膜的自噬體，自噬體捕獲需降解的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等物質(zhì)，將其內(nèi)容物運(yùn)送至溶酶體腔降解成小分子物質(zhì)[2]。

根據(jù)對(duì)降解底物的選擇性的不同，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬，其中非選擇性自噬隨機(jī)對(duì)底物進(jìn)行降解，而選擇性自噬是與特定的底物結(jié)合并將其降解，有利于維持細(xì)胞器的完整性和數(shù)量[3]。細(xì)胞質(zhì)空泡靶向（Cvt）途徑、線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、過氧化物酶體自噬、核糖體自噬等都屬于選擇性自噬[4]。在選擇性自噬中，一類具有磷酸肌醇結(jié)合PX（Phox結(jié)構(gòu)域同源）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)被稱為分選連接蛋白質(zhì)（SNX），該蛋白質(zhì)對(duì)于貨物蛋白質(zhì)的識(shí)別和運(yùn)輸起著重要作用[5]。在酵母中，自噬相關(guān)基因（ATG）ATG20編碼一種分選連接蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)的缺失突變體中幾乎檢測(cè)不到成熟的氨基肽酶（Ape1），導(dǎo)致Cvt途徑缺陷[6-7]。而且，酵母的ATG20與ATG24蛋白存在功能冗余，不僅影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和線粒體自噬過程中的液泡運(yùn)輸[8]，還影響非選擇性自噬的液泡運(yùn)輸和自噬小體的形成[9-10]。在稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）中MoSnx41與酵母ATG20同源，MoSnx41缺失突變體表現(xiàn)出產(chǎn)孢能力減弱、致病性減弱和過氧化物酶體自噬缺陷[11]。在禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中，F(xiàn)gATG20被證明不僅參與自噬小體的形成和Cvt途徑，而且調(diào)控病菌的生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)量和致病性[12]。在玉米小斑病病原菌異旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）中，ChATG20參與病菌正常無性生長(zhǎng)和致病力的調(diào)控[5]。由此可見，不同真菌中ATG20的功能存在差異。

天然橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略資源，由膠孢炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病是導(dǎo)致橡膠減產(chǎn)的重要因素之一[13]。自噬對(duì)植物病原真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病性具有重要影響，深入研究自噬的機(jī)制和影響因素能為研發(fā)可有效阻斷病原真菌發(fā)育和侵染途徑的防治策略提供新的靶點(diǎn)[14-15]，但是目前對(duì)于膠孢炭疽菌自噬機(jī)理和自噬相關(guān)基因的研究不多，僅對(duì)CgAtg4和CgATG8進(jìn)行了克隆和初步的功能分析[16-17]。本研究擬克隆和分析膠孢炭疽菌中的CgATG20基因，構(gòu)建該基因的2個(gè)敲除突變株△CgATG20-1和△CgATG20-2，分析CgATG20對(duì)膠孢炭疽菌致病力、分生孢子產(chǎn)量和附著胞生長(zhǎng)發(fā)育以及自噬的影響，為解析膠孢炭疽菌自噬機(jī)理提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

膠孢炭疽菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；致病性分析所用的巴西橡膠樹品種為熱研7-33-97。

試驗(yàn)中用于進(jìn)行目的片段擴(kuò)增的高保真酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；用于目的片段檢測(cè)的2×Taq Master Mix購自近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的PEG4000、氯嘧磺隆和用于自噬染色的單丹磺酰尸胺（MDC）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；羧芐青霉素（Car）和卡那霉素（Kan）購自賽國(guó)生物科技有限公司；鈣熒光白（CFW）購自源葉生物有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；剛果紅（CR）購自北京索萊寶科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自蘭杰柯科技有限公司。

CM培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、微量元素1 ml、維生素1 ml、硝酸鹽50 ml、蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、酸水解酪蛋白1 g，加 ddH2O定容到1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。MM培養(yǎng)基：氯化鉀0.50 g、硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、七水硫酸鎂0.50 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、微量元素200 μl，加 ddH2O 定容到1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。在MM培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上去除硝酸鈉即為MM-N缺氮培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1生物信息學(xué)分析引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0 軟件，引物合成由北京擎科生物科技股份有限公司完成。使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)注釋資源（NCBI CDD）分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，使用在線工具NovoPro（https：//novopro.cn/tools/signalp.html）和DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，使用DNAMAN軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列對(duì)比，使用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.2敲除突變體的構(gòu)建根據(jù)同源重組敲除原理，利用融合PCR擴(kuò)增目的基因的上下游同源臂和抗性基因的融合片段，使用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將融合片段轉(zhuǎn)入到膠孢炭疽菌的原生質(zhì)體中[18]，對(duì)獲得的抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單孢分離和PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示上游、下游片段擴(kuò)增結(jié)果呈陽性而目的基因擴(kuò)增結(jié)果呈陰性的轉(zhuǎn)化子為純合的敲除突變株。

1.2.3生長(zhǎng)速率分析參照Liu等[19]的方法進(jìn)行。將生長(zhǎng)狀況一致的待測(cè)菌株用無菌打孔器打出相同大小的菌塊，將其分別接種在PDA培養(yǎng)基中央，置于28 ℃培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并拍照，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次且每次有3個(gè)以上重復(fù)。

1.2.4分生孢子產(chǎn)量分析參照Liu等[19]的方法進(jìn)行。將待測(cè)菌株置于完全培養(yǎng)基（CM培養(yǎng)基）中，在28 ℃ 120 r/min條件下培養(yǎng)2 d，用濾膜過濾1 ml新鮮孢子懸浮液，8 000 r/min離心1 min獲得橙黃色分生孢子沉淀，倒掉上清液，加入1 ml ddH2O振蕩混勻，重復(fù)以上步驟，清洗2遍分生孢子后加1 ml ddH2O振蕩混勻，使用顯微鏡計(jì)數(shù)，將孢子含量調(diào)整到1 ml 1×103個(gè)，往30 ml CM培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素、卡那霉素和1 ml稀釋好的孢子液，在28 ℃ 120 r/min條件下培養(yǎng)3 d，過濾孢子液，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)分生孢子計(jì)數(shù)。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次且每次有3個(gè)以上重復(fù)。

1.2.5致病性分析參照Gao等[20]的方法進(jìn)行。將重懸于CM培養(yǎng)基的新鮮的菌液孢子含量調(diào)整至1 ml 2×105個(gè)，采集生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)一致的橡膠樹苗葉片，接種5 μl菌液在完整葉片或預(yù)先刺傷的葉片上，保濕并做好標(biāo)記，在28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d后拍照留存并測(cè)量病斑直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次且每次有3個(gè)以上重復(fù)。

1.2.6細(xì)胞壁應(yīng)激分析參照Liu等[19]的方法進(jìn)行。將待測(cè)菌株培養(yǎng)5～6 d，用無菌打孔器打出相同大小的菌塊，將菌塊分別轉(zhuǎn)接于添加了SDS（0.005%）、CFW（200 μg/ml）和剛果紅（250 μg/ml）的PDA培養(yǎng)平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)6 d。測(cè)量菌落直徑并拍照，計(jì)算并分析生長(zhǎng)抑制率。每個(gè)樣品至少設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7附著胞形成分析參照Gao等[20]的方法進(jìn)行。將重懸于新鮮的CM液體培養(yǎng)基中的菌液孢子含量調(diào)整至1 ml 5×105個(gè)，接種5 μl在聚苯乙烯板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，于不同時(shí)間點(diǎn)在顯微鏡下觀察，拍照并進(jìn)行附著胞形成率的統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8洋蔥表皮穿透力分析參照Gao等[20]的方法進(jìn)行。將新鮮的孢子懸浮液稀釋至1 ml 2.5×105個(gè)的孢子含量，小心揭下洋蔥內(nèi)表皮，將其置于培養(yǎng)皿中，接種5 μl稀釋的孢子懸浮液在洋蔥內(nèi)表皮上，于28 ℃保濕培養(yǎng)12 h后觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)穿透洋蔥內(nèi)表皮的附著胞比例。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.9氮饑餓誘導(dǎo)自噬參照廖至雯等[21]改良的Veneault-Fourrey等[22]的方法進(jìn)行。用CM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得新鮮的孢子懸浮液，稀釋至1 ml 5×105個(gè)，將20 ml孢子液在28 ℃ 120 r/min的條件下培養(yǎng)24 h獲得菌絲體，將培養(yǎng)獲得的菌絲體吸取出來平均分裝到不同離心管中，然后加入1 ml ddH2O輕搖混勻，重復(fù)以上步驟，用離心水洗2遍以洗去CM培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)，再將菌絲體加入到不同培養(yǎng)基中進(jìn)行處理，并加入PMSF溶液（終濃度4 mmol/L）使其發(fā)生氮饑餓誘導(dǎo)的自噬，在28 ℃ 120 r/min條件下培養(yǎng)3 h后，加入MDC染液（終濃度100 μmol/L）避光染色30 min，洗去營(yíng)養(yǎng)和MDC染液，在熒光顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)自噬小體的數(shù)目。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用 Graphpad prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異分析，單變量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，采用Duncans多重范圍檢驗(yàn)。在P<0.05時(shí)的差異被認(rèn)為是顯著的。

2結(jié)果與分析

2.1CgATG20的基因擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析

在膠孢炭疽菌的轉(zhuǎn)錄組中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼自噬相關(guān)蛋白質(zhì)ATG20的基因（XP_045265376.1），將其命名為CgATG20。通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了該基因的編碼區(qū)并進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明該基因編碼了1條含有 636 個(gè)氨基酸的多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為70 300，等電點(diǎn)（pI）為5.41。該蛋白質(zhì)序列與酵母（Saccharomyces cerevisiae）ScATG20（AJV07481.1）、稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）MoATG20（MGG_12832）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）FgATG20（FGSG_06950）的一致性分別為28.65%、75.08%和75.31%。NCBI CDD分析結(jié)果顯示，CgATG20 蛋白含有位于第117～227 aa處的PX保守結(jié)構(gòu)域和第308～629 aa處的 BAR （Bin/Amphiphysin/Rvs）保守結(jié)構(gòu)域。使用在線工具NovoPro 和DeepTMHMM預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，CgATG20蛋白不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN軟件對(duì)CgATG20和其他幾個(gè)主要植物病原真菌的ATG20進(jìn)行多序列對(duì)比，結(jié)果顯示，CgATG20與其他同源蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)域PX和BAR處高度保守（圖1A）。利用MEGA 4.0軟件對(duì)CgATG20與其他同源蛋白質(zhì)和禾谷鐮刀菌的28個(gè)ATG蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果（圖1B）顯示，CgATG20與來自稻瘟病病菌的MoATG20、禾谷鐮刀菌的FgATG20和煙曲霉菌的AfATG20位于同一分支，其中與禾谷鐮刀菌FgATG20的親緣關(guān)系最近。以上結(jié)果表明，CgATG20是膠孢炭疽菌中ATG20的同源蛋白質(zhì)。

2.2CgATG20敲除突變體的構(gòu)建

為了研究CgATG20的生物學(xué)功能，我們根據(jù)同源重組原理構(gòu)建膠孢炭疽菌的敲除突變株（圖2A）。利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增了CgATG20的上游同源臂（702 bp）、下游同源臂（804 bp）和氯嘧磺隆抗性基因SUR（2 807 bp），用融合PCR的方法得到帶有氯嘧磺隆的片段，使用PEG介導(dǎo)法將片段轉(zhuǎn)入膠孢炭疽菌野生型的原生質(zhì)體中，利用抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行單孢分離，獲得2個(gè)純合株系，通過PCR技術(shù)檢測(cè)，在2個(gè)純合株系的基因組中均可以檢測(cè)到上游片段（圖2B）和下游片段（圖2C），但檢測(cè)不到目的基因的存在（圖2D），說明CgATG20基因已經(jīng)被成功敲除。將這2個(gè)純合株系分別命名為△CgATG20-1和△CgATG20-2。

2.3CgATG20對(duì)膠孢炭疽菌致病力影響

為了探究CgATG20對(duì)膠孢炭疽菌致病力的影響，用野生型（WT）、△CgATG20-1和△CgATG20-2的孢子懸浮液分別接種離體橡膠樹葉片，3 d后觀察到WT、△CgATG20-1和△CgATG20-2都能夠引起典型的病斑，且△CgATG20-1和△CgATG20-2引起的病斑明顯小于WT引起的病斑（圖3A），進(jìn)一步測(cè)量并統(tǒng)計(jì)分析病斑直徑，結(jié)果顯示，△CgATG20-1和△CgATG20-2引起的病斑直徑顯著小于WT引起的病斑直徑（圖3B），說明CgATG20的缺失導(dǎo)致膠孢炭疽菌對(duì)橡膠樹葉片的致病能力顯著降低，CgATG20能夠影響膠孢炭疽菌對(duì)橡膠樹的致病力。

2.4CgATG20對(duì)菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力的影響

為了探究CgATG20是否影響膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)發(fā)育，將WT和△CgATG20接種在PDA培養(yǎng)基上，6 d后觀察到△CgATG20-1和△CgATG20-2的菌落形態(tài)與WT沒有明顯差異（圖4A），菌落直徑統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，△CgATG20-1和△CgATG20-2的菌落直徑分別比WT減少了11.5%和12.3%，具有顯著差異（圖4B）。對(duì)孢子產(chǎn)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，△CgATG20-1和△CgATG20-2的孢子產(chǎn)量顯著低于WT的孢子產(chǎn)量（圖4C）。以上結(jié)果說明CgATG20參與調(diào)控病菌的產(chǎn)孢能力和菌落的放射性生長(zhǎng)。

2.5CgATG20對(duì)細(xì)胞壁完整性的影響

為了探究CgATG20對(duì)細(xì)胞壁完整性的影響，我們將WT和△CgATG20接種在添加了SDS（0.005%）、CFW（200 μg/ml）和CR（250 μg/ml）的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，6 d后觀察，結(jié)果顯示，△CgATG20-1和△CgATG20-2的菌落形態(tài)與WT沒有明顯差異（圖5A）。抑制率分析結(jié)果顯示，這幾種藥劑對(duì)△CgATG20-1和△CgATG20-2的生長(zhǎng)抑制率與對(duì)WT的生長(zhǎng)抑制率也沒有明顯差異（圖5B）。以上結(jié)果說明，CgATG20不參與細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)，與膠孢炭疽菌的細(xì)胞壁完整性無關(guān)。

2.6CgATG20對(duì)膠孢炭疽菌侵染結(jié)構(gòu)形成的影響

為了探究CgATG20是否影響膠孢炭疽菌侵染結(jié)構(gòu)的形成，我們觀察并分析了分生孢子在疏水聚苯乙烯板表面形成附著胞的過程（圖6A）和對(duì)洋蔥表皮的侵染過程。結(jié)果表明，WT、△CgATG20-1和△CgATG20-2的孢子形態(tài)和附著胞形成率沒有顯著差異（圖6B、圖6C）。洋蔥表皮接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，在侵染過程中附著胞存在2種類型，我們將其分為TypeⅠ和TypeⅡ，其中TypeⅠ可以形成正常的侵染菌絲，TypeⅡ不能形成侵染菌絲（圖6D）。在WT菌株侵染過程中，約有80%的附著胞可以形成正常的侵染菌絲（TypeⅠ），而在△CgATG20-1和△CgATG20-2菌株侵染過程中，形成正常侵染菌絲的附著胞只占不到20%，大部分為TypeⅡ（圖6C、圖6D）。以上結(jié)果表明，CgATG20并不影響附著孢的形成，但在侵染過程中發(fā)揮重要作用。

2.7CgATG20參與氮饑餓誘導(dǎo)的自噬

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，禾谷鐮刀菌中ATG20在自噬過程中參與了自噬小體的形成[12]。為了探究CgATG20是否參與膠胞炭疽菌自噬小體的形成，我們將WT和△CgATG20菌株的菌絲在氮缺失培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后進(jìn)行MDC染色。結(jié)果顯示，WT菌株在CM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，菌絲體中熒光強(qiáng)度較弱且?guī)缀跤^察不到自噬小體，在基本培養(yǎng)基（MM培養(yǎng)基）和氮饑餓條件下，WT菌株熒光亮度增強(qiáng)且形成明顯的自噬小體；而△CgATG20-1和△CgATG20-2菌絲體中熒光強(qiáng)度普遍弱于WT且沒有明顯的自噬小體形成（圖7A）。進(jìn)一步對(duì)不同菌株中自噬小體的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，2個(gè)突變體菌株中的自噬小體數(shù)量顯著低于野生型中的自噬小體數(shù)量（圖7B）。以上結(jié)果說明CgATG20參與了自噬小體的形成。

3討論

自噬現(xiàn)象是植物病原真菌中普遍存在的生理過程，該過程由多個(gè)自噬相關(guān)基因參與。ATG20原名Cvt20，因從酵母Cvt途徑缺陷突變體中篩選出來而得名，后來被統(tǒng)一命名為ATG20[6]。目前，真菌中已經(jīng)被鑒定的ATG20蛋白并不多，主要包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、玉米旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的同源蛋白質(zhì)，這些不同真菌的ATG20同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中都含有保守的PX和BAR結(jié)構(gòu)域[5，10-11，23-24]。本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CgATG20蛋白同樣含有PX和BAR保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果也顯示CgATG20與來自其他真菌的ATG20位于同一分支，與禾谷鐮刀菌FgATG20的親緣關(guān)系最近。因此，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系上來說CgATG20應(yīng)該就是膠孢炭疽菌中ATG20的同源蛋白質(zhì)。

已有的研究結(jié)果證明，自噬相關(guān)基因在植物病原真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病性中起著關(guān)鍵作用，而且同一自噬相關(guān)同源基因在不同病原真菌中的功能也存在差異[25]。例如：在稻瘟病病菌中，MoATG20的缺失導(dǎo)致分生孢子的形成缺陷和致病力減弱，說明MoATG20與稻瘟病病菌的分生孢子的產(chǎn)生和致病力有關(guān)[11]；在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gATG20的敲除突變體表現(xiàn)為病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢、病菌在寄主組織中的傳播和癥狀的發(fā)展受阻，但無性孢子的形成率沒有改變，證明FgATG20在病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和致病性調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但對(duì)有性孢子的發(fā)育影響不大[23]；在玉米旋孢腔菌中，ChATG20/ChSNX41的缺失影響病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)量，同時(shí)導(dǎo)致病菌對(duì)玉米的致病力顯著降低，而且病菌對(duì)氧化脅迫、細(xì)胞壁完整性應(yīng)激、殺菌劑和異硫氰酸酯的敏感性顯著增強(qiáng)[5]；在煙曲霉中，AfATG20受到蛋白激酶A（PKA）的磷酸化調(diào)節(jié)，對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)、病菌細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)和病菌毒力有重要影響[24]。我們發(fā)現(xiàn)CgATG20與其他病原真菌中的同源蛋白質(zhì)一樣影響病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)量和對(duì)寄主的致病性，盡管CgATG20對(duì)膠孢炭疽菌的附著胞形成和發(fā)育沒有影響，但能調(diào)控侵染菌絲的產(chǎn)生和入侵，說明CgATG20影響膠孢炭疽菌的侵染過程，但其對(duì)侵染過程的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的解析。

如前所述，CgATG20的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在PX和BAR保守結(jié)構(gòu)域。已有的研究結(jié)果表明，PX結(jié)構(gòu)域是一個(gè)磷酸肌苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域，含有該類結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在與分泌和內(nèi)吞作用相關(guān)的膜運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)代謝中具有多種功能，多被稱為分類連接蛋白質(zhì)（SNX）[26-27]。ATG20的PX結(jié)構(gòu)域能夠與磷脂酰肌醇3-單磷酸（PI3P）結(jié)合參與前自噬體結(jié)構(gòu)的形成[28]。BAR 結(jié)構(gòu)域是一種存在于多種蛋白質(zhì)中的膜脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它不僅與脂質(zhì)雙分子層結(jié)合，還具有膜雕刻能力，能夠直接控制生物膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)膜彎曲[5，29]。ATG20與同屬于分類連接蛋白質(zhì)的ATG24可以通過BAR結(jié)構(gòu)域相互作用組裝成異源二聚體，是內(nèi)吞體循環(huán)所必需的[8，30]。因此，自噬相關(guān)蛋白質(zhì)ATG20是分類連接蛋白質(zhì)家族的關(guān)鍵成員，其中的PX和BAR結(jié)構(gòu)域均參與自噬和膜重塑過程[10]，在細(xì)胞質(zhì)-液泡靶向（Cvt）途徑介導(dǎo)的選擇性自噬過程中發(fā)揮重要作用[7，31-32]。在本研究中，我們通過MDC染色的方法分析了CgATG20對(duì)膠孢炭疽菌自噬的影響，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過氮饑餓誘導(dǎo)自噬的WT菌絲體中，形成自噬小體的數(shù)量顯著多于CgATG20敲除突變體中形成的自噬小體的數(shù)量，證明了CgATG20參與自噬小體的形成，與膠孢炭疽菌的自噬過程有關(guān)。在酵母和禾谷鐮刀菌中的研究結(jié)果已經(jīng)證明Atg20與Atg24、Atg11和Atg17直接相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合物參與自噬起始系統(tǒng)[6，12，33-34]，那么CgATG20是否以同樣的作用方式發(fā)揮作用？這還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。

參考文獻(xiàn)：

[1]YAO W J， LI Y X， CHEN Y C， et al. Atg1-mediated Atg11 phosphorylation is required for selective autophagy by regulating its association with receptor proteins[J]. Autophagy，2023，19（1）：180-188.

[2]LI H， LIU Z Y， WU N Y， et al. PARP inhibitor resistance： the underlying mechanisms and clinical implications[J]. Molecular Cancer，2020，19（1）：107.

[3]KIRKIN V， ROGOV V. A diversity of selective autophagy receptors determines the specificity of the autophagy pathway[J]. Molecular Cell，2019，76（2）：268-285.

[4]LIU X M， SUN L L， HU W， et al. ESCRTs cooperate with a selective autophagy receptor to mediate vacuolar targeting of soluble cargos[J]. Molecular Cell，2015，59（6）：1035-1042.

[5]YU H L， JIA W T， LI Z X， et al. The sorting nexin genes ChSNX4 and ChSNX41 are required for reproductive development， stress adaption and virulence in Cochliobolus heterostrophus[J]. Journal of Fungi，2022，8（8）：855.

[6]NICE D C， SATO T K， STROMHAUG P E， et al. Cooperative binding of the cytoplasm to vacuole targeting pathway proteins， Cvt13 and Cvt20， to phosphatidylinositol 3-phosphate at the pre-autophagosomal structure is required for selective autophagy[J]. Biological Chemistry，2002，277（33）：30198-30207.

[7]KLIONSKY D J， CREGG J M， DUNN W A J R，et al. A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes[J]. Developmental Cell，2003，5（4）：539-545.

[8]ZHAO D， LIU X M， YU Z Q， et al Atg20-?and Atg24-family proteins promote organelle autophagy in fission yeast[J]. Journal of Cell Science，2016，129（22）：4289-4304.

[9]OHASHI Y， MUNRO S. Membrane delivery to the yeast autophagosome from the golgi-endosomal system[J]. Molecular Biology of the Cell，2010，21：3998-4008.

[10]POPELKA H， DAMASIO A， HINSHAW J E， et al. Structure and function of yeast Atg20， a sorting nexin that facilitates autophagy induction[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114（47）：E10112-E10121.

[11]DENG Y Z， QU Z， NAQVI N I. The role of snx41-based pexophagy in Magnaporthe development[J]. PLoS One，2013，8（11）：e79128.

[12]LYU W Y， XU Z， TALBOT N J， et al. The sorting nexin FgAtg20 is involved in the Cvt pathway， non-selective macroautophagy， pexophagy and pathogenesis in Fusarium graminearum[J]. Cellular Microbiology，2020，22（8）：e13208.

[13]梁晨，周蕓，安邦，等. 膠孢炭疽菌特有效應(yīng)蛋白基因CgE23對(duì)產(chǎn)孢能力的影響[J]. 分子植物育種，2020，18（19）：6377-6384.

[14]朱信霖，扈東營(yíng)，陳顯振，等. 作用于細(xì)胞壁的抗真菌藥物研究進(jìn)展[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2022，41（6）：871-877.

[15]段靈濤，祝一鳴，何九卿，等. 真菌細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2021，12（2）：253-260.

[16]翟李剛，林春花，蔡志英，等. 橡膠樹膠孢炭疽菌細(xì)胞自噬相關(guān)基因CgAtg4的克隆與序列分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（9）：2189-2191，2223.

[17]李超萍，林春花，翟李剛，等. 橡膠樹膠孢炭疽病菌致病相關(guān)基因CgATG8的功能分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（11）：2172-2178.

[18]WANG Q N， AN B， HOU X R， et al. Dicer-like proteins regulate the growth， conidiation， and pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides from Hevea brasiliensis[J]. Front Microbiol，2018，8：2621.

[19]LIU N， WANG Q N， HE C Z， et al. CgMFS1， a major facilitator superfamily transporter， is required for sugar transport， oxidative stress resistance， and pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides from Hevea brasiliensis[J]. Current Issues in Molecular Biology，2021，43（3）：1548-1557.

[20]GAO X S， WANG Q N， FENG Q D， et al. Heat shock transcription factor CgHSF1 is required for melanin biosynthesis， appressorium formation， and pathogenicity in Colletotrichum gloeosporioides[J]. Journal of Fungi，2022，8（2）：175.

[21]廖至雯，黃志睿，羅紅麗.膠胞炭疽菌自噬誘導(dǎo)和MDC染色方法的建立和條件優(yōu)化[J/OL].分子植物育種，2023：1-12[2023-03-14]. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20230313.1851.010.html.

[22]VENEAULT-FOURREY C， BAROOAH M， EGAN M， et al. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus[J]. Science，2006，312（5773）：580-583.

[23]呂務(wù)云. 禾谷鐮刀菌細(xì)胞自噬途徑相關(guān)基因的功能分析[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2019.

[24]SHWAB E K， JUVVADI P R， SHAHEEN S K， et al. Protein kinase a regulates autophagy-associated proteins impacting growth and virulence of Aspergillus fumigatus[J]. Journal of Fungi， 2022， 8（4）： 354.

[25]劉偉，杜春梅. 植物病原真菌的自噬[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2021，61（11）：3363-3376.

[26]TEASDALE R D， COLLINS B M. Insights into the PX （phox-homology） domain and SNX （sorting nexin） protein families： structures， functions and roles in disease[J]. Biochem Journal，2012，441（1）：39-59.

[27]CHANDRA M， COLLINS B M. The phox homology （PX） domain[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2019，1111：1-17.

[28]RATHOD J， YEN H C， LIANG B， et al. YPIBP：a repository for phosphoinositide-binding proteins in yeast[J]. Comput Struct Biotechnol Journal，2021，19：3692-3707.

[29]ASPENSTRM P. BAR domain proteins regulate rho GTPase signaling[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2019，1111：33-53.

[30]ZHENG W H， LIN Y H， FANG W Q， et al. The endosomal recycling of FgSnc1 by FgSnx41-FgSnx4 heterodimer is essential for polarized growth and pathogenicity in Fusarium graminearum[J]. New Phytologist，2018，219（2）：654-671.

[31]LYNCH-DAY M A， KLIONSKY D J. The Cvt pathway as a model for selective autophagy[J]. Febs Letters，2010，584（7）：1359-1366.

[32]MA M， KUMAR S， PURUSHOTHAMAN L， et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion[J]. Molecular Biology of the Cell，2018，29（18）：2190-2200.

[33]KABEYA Y， KAMADA Y， BABA M， et al. Atg17 functions in cooperation with Atg1 and Atg13 in yeast autophagy[J]. Molecular Biology of the Cell，2005，16（5）：2544-2553.

[34]YORIMITSU T， KLIONSKY D J. Atg11 links cargo to the vesicle forming machinery in the cytoplasm to vacuole targeting pathway[J]. Molecular Biology of the Cell，2005，16（4）：1593-1605.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2023-09-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32260716、32060591）

作者簡(jiǎn)介：黃志睿（2000-），男，河南許昌人，碩士研究生，主要從事膠孢炭疽菌的自噬相關(guān)基因功能研究。（E-mail）1657072859@qq.com

通訊作者：羅紅麗，（E-mail）hlluo@hainanu.edu.cn