劉悅 曲浩 田易萍 陳春林 冉隆珣 陳林波

摘要：水楊酸是誘導(dǎo)植物抗性機(jī)制中重要的信號(hào)分子，外源噴施水楊酸能夠調(diào)控多種防御相關(guān)蛋白質(zhì)，提升農(nóng)作物的抗病能力。開(kāi)展外源水楊酸誘導(dǎo)茶樹(shù)抗性機(jī)制的研究能夠挖掘抗病基因，為茶樹(shù)抗病育種提供分子基礎(chǔ)。本研究采集外源噴施水楊酸0 h、6 h、12 h、24 h、48 h的茶樹(shù)葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析，結(jié)果表明，外源噴施水楊酸6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)茶樹(shù)葉片內(nèi)差異表達(dá)基因數(shù)量分別為9 360個(gè)、3 399個(gè)、596個(gè)、115個(gè)，外源水楊酸處理后各時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生差異表達(dá)的基因共604個(gè)。KEGG功能富集結(jié)果顯示，處理后6 h時(shí)富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原菌互作、核糖體、剪接體和碳代謝通路上的差異表達(dá)基因數(shù)量分別為95個(gè)、73個(gè)、121個(gè)、94個(gè)、154個(gè)。差異表達(dá)基因中有12個(gè)熱激因子基因、40個(gè)熱激蛋白基因和12個(gè)WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)。處理48 h后，無(wú)上調(diào)表達(dá)的熱激因子基因，但仍有28個(gè)熱激蛋白基因上調(diào)表達(dá)。病程相關(guān)蛋白基因在檢測(cè)階段均上調(diào)表達(dá)。外源水楊酸的誘導(dǎo)作用在處理6 h時(shí)最為明顯，并且引起了大量熱激蛋白的響應(yīng)。本研究結(jié)果為開(kāi)展外源水楊酸誘導(dǎo)茶樹(shù)抗病機(jī)制和茶樹(shù)抗病分子育種研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：外源水楊酸;茶樹(shù);轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因;熱激蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）04-0607-08

Transcriptome analysis of the response of heat shock protein encoding genes induced by salicylic acid in tea plants

LIU Yue，QU Hao，TIAN Yi-ping，CHEN Chun-lin，RAN Long-xun，CHEN Lin-bo

（Tea Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting Cultivation/Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science， Kunming 666201， China）

Abstract：Salicylic acid is an important signal molecule in mechanism of plant resistance induction. Externally spraying salicylic acid can regulate multiple defense-related proteins and improve the resistance of crops. Research on the resistance mechanism of tea plants induced by exogenous salicylic acid can explore resistance genes and provide molecular basis for resistance breeding of tea plants. In this study， transcriptome sequencing and analysis were conducted on tea leaves collected at 0 h 6 h， 12 h， 24 h and 48 h of spraying exogenous salicylic acid. The results showed that numbers of differentially expressed genes in tea leaves at 6 h， 12 h， 24 h and 48 h of spraying exogenous salicylic acid were 9 360， 3 399， 596 and 115 respectively， 604 genes were differentially expressed at each time point after exogenous salicylic acid treatment. Results of KEGG functional enrichment showed that 95， 73， 121， 94 and 154 differentially expressed genes were respectively enriched in plant hormone signal transduction， plant-pathogen interaction， ribosome， spliceosome and carbon metabolic pathways six hours after treatment. Among the differentially expressed genes， 12 genes of heat shock protein transcriptional factors， 40 genes of heat shock proteins and 12 transcriptional factor genes of WRKY family were up-regulated. No up-regulated gene of HSP transcriptional factors was found after 48 h of treatment， but 28 HSP genes were upregulated. Expression of genes encoding pathogenesis related protein were up-regulated at the detection stage. The induction effect of exogenous salicylic acid was the most obvious at six hours of treatment and caused many responses of heat shock protein. The results of the study provided a reference for the research of disease-resistance mechanism of tea tree induced by exogenous salicylic acid and molecular breeding for disease resistance of tea tree.

Key words：exogenous salicylic acid;tea plant;transcriptome;differentially expressed gene;heat shock protein

水楊酸（Salicylic acid）是一種重要的植物激素，是介導(dǎo)植物免疫和生長(zhǎng)的關(guān)鍵信號(hào)分子，在植物體內(nèi)廣泛存在[1-2]。水楊酸可以被致病相關(guān)基因NPR1、NPR3、NPR4感知，進(jìn)而刺激水楊酸下游基因，誘導(dǎo)植物免疫應(yīng)答[3]。在植物中水楊酸通過(guò)2條不同途徑合成，即苯丙氨酸解氨酶和異分支酸合成酶途徑。外源水楊酸能夠誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，如水稻、擬南芥[4-5]。茶葉的質(zhì)量安全一直是消費(fèi)者關(guān)注的問(wèn)題，因此茶樹(shù)的病蟲(chóng)害綠色防控技術(shù)研究尤為重要。外源水楊酸是一種綠色防控藥劑，但有關(guān)外源水楊酸在茶樹(shù)上的應(yīng)用和作用機(jī)制方面的研究較少。

植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量和質(zhì)量受到各種生物因素影響，如致病細(xì)菌、真菌、病毒和線(xiàn)蟲(chóng)，能夠?qū)е轮参锘盍?、生長(zhǎng)量和產(chǎn)量降低。外源水楊酸能夠誘導(dǎo)植物抵御多種病害，同時(shí)促進(jìn)植物中大量與病程相關(guān)的蛋白質(zhì)積累，其中包括幾丁質(zhì)酶和1，3-β-葡聚糖酶[6]。炭疽病病菌侵染茶樹(shù)的過(guò)程中，水楊酸相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，葉面水楊酸發(fā)生積累，這在茶樹(shù)抵抗炭疽病的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。對(duì)水稻稻瘟病的防控同樣可以使用外源水楊酸[8]。外源水楊酸能夠通過(guò)改善甜菜的光合特性和抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)緩解氟磺胺草醚毒性[9]。外源水楊酸還可以改善熱脅迫誘導(dǎo)的紫花苜蓿損傷，提高其生長(zhǎng)和光合效率[10]。此外，水楊酸通過(guò)與其他參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和擴(kuò)張的激素相互作用來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，例如與生長(zhǎng)素、乙烯的互作[11]。熱激蛋白（HSP）的表達(dá)是由熱激因子（HSF）調(diào)控的[12]，但在脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。研究結(jié)果表明，HSP在植物應(yīng)激反應(yīng)中充當(dāng)分子伴侶并發(fā)揮作用，HSP90以共伴侶模式調(diào)控了木薯中水楊酸和生長(zhǎng)素之間的拮抗作用。在枯萎病病菌誘導(dǎo)下HSP90.9通過(guò)促進(jìn)水楊酸生物合成基因PBS3和色氨酸代謝基因ASMT2的轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)了水楊酸的生物合成[13]。植物中應(yīng)對(duì)生物脅迫的適應(yīng)性系統(tǒng)之一就是通過(guò)調(diào)控HSP發(fā)揮作用，HSP對(duì)生物脅迫的反應(yīng)取決于致病生物和植物基因型[14]。HSP17.8和WRKY在抗性基因型的馬鈴薯中同時(shí)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，HSP使防御相關(guān)蛋白質(zhì)在生物脅迫下保持活性[15]。在細(xì)胞生物學(xué)中， HSP在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是一種蛋白質(zhì)，在高溫脅迫時(shí)產(chǎn)生。HSP在植物生命周期中扮演著重要角色，除了參與生長(zhǎng)發(fā)育外，還參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，包括保護(hù)植物免受生物和非生物脅迫[16]。

外源水楊酸能夠通過(guò)誘導(dǎo)茶樹(shù)的防御機(jī)制抵抗病原菌侵染，并且外源水楊酸能夠誘導(dǎo)HSP基因的過(guò)表達(dá)，但茶樹(shù)中水楊酸誘導(dǎo)的抗性機(jī)制尚不清晰?；谕庠此畻钏釋?duì)植物的重要作用，本研究擬對(duì)外源噴施水楊酸后不同時(shí)間點(diǎn)的茶樹(shù)葉片基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到各時(shí)間點(diǎn)上差異表達(dá)基因數(shù)量，篩選出在水楊酸處理的整個(gè)階段都發(fā)生差異表達(dá)的基因，分析處理產(chǎn)生的信號(hào)通路差異以及HSP基因的表達(dá)差異。本研究將為外源水楊酸誘導(dǎo)的茶樹(shù)抗病機(jī)制研究和茶樹(shù)抗病分子育種提供參考。

1材料與方法

1.1樣品處理與采集

試驗(yàn)材料選用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)基地5年生的感病品種云抗10號(hào)。于2022年5月10日開(kāi)展試驗(yàn)，采用前期研究中確定的外源水楊酸濃度（1 mmol/L）噴施茶樹(shù)葉片，9：00噴施外源水楊酸，分別在第1 d 15：00、第1 d 21：00、第2 d 9：00和第3 d 9：00采集處理0 h、6 h、12 h、24 h、48 h的茶樹(shù)芽下第4葉和第5葉片作為待測(cè)樣品，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2cDNA文庫(kù)構(gòu)建與注釋

利用RNA提取試劑盒對(duì)葉片總RNA進(jìn)行提取，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過(guò)聚合酶進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，進(jìn)行凝膠電泳分離靶DNA片段，回收凝膠，完成cDNA文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)有效濃度大于2 nmol/L，使用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，獲得高質(zhì)量非冗余的clean reads，組裝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用BLAST在7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)基因進(jìn)行注釋。

1.3差異表達(dá)基因分析

使用DESeq方法進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估，產(chǎn)生的結(jié)果對(duì)P值（判定假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)）進(jìn)行調(diào)整，控制錯(cuò)誤率， P值小于0.05并且差異倍數(shù)大于2的基因存在差異表達(dá)。

1.4基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析

根據(jù)基因富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類(lèi)，GO注釋通過(guò)BLAST2 GO程序完成，在差異表達(dá)基因中顯著富集的 GO 功能條目通過(guò)WEGO生成GO分類(lèi)圖。利用KEGG分析生物進(jìn)程，并將本研究數(shù)據(jù)與KEGG集成數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

1.5構(gòu)建蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

使用分析工具STRING（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，分析蛋白質(zhì)間的相互作用。

2結(jié)果與分析

2.1水楊酸誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組分析

為了探索水楊酸處理對(duì)茶樹(shù)葉片內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控作用，利用測(cè)序技術(shù)對(duì)未處理和水楊酸處理后6 h、12 h、24 h、48 h的茶樹(shù)葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析。結(jié)果顯示，在未處理和處理6 h、12 h、24 h、48 h的茶樹(shù)葉片中分別得到大小為41 887 894 bp、43 386 156 bp、45 284 300 bp、41 989 512 bp、42 918 618 bp的序列，其中過(guò)濾得到的有效數(shù)據(jù)分別為39 803 468 bp、41 580 120 bp、42 549 320 bp、39 857 074 bp、41 380 250 bp。原始數(shù)據(jù)的測(cè)序質(zhì)量值在20以上的堿基比例（Q20）大于97.00%，測(cè)序質(zhì)量值在30以上的堿基比例（Q30）大于93.00%，G+C含量大于44.00%（表1）。

2.2差異表達(dá)基因篩選

對(duì)注釋的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選差異表達(dá)基因。結(jié)果（圖1）表明，外源水楊酸處理0 h與6 h間差異表達(dá)基因?yàn)?6 448個(gè)，其中下調(diào)表達(dá)基因8 053個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因8 395個(gè);0 h與12 h間差異表達(dá)基因?yàn)?0 237個(gè)，其中下調(diào)表達(dá)基因5 150個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因5 087個(gè);0 h與24 h間差異表達(dá)基因?yàn)? 227個(gè)，其中下調(diào)表達(dá)基因1 750個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因1 477個(gè);0 h與48 h間差異表達(dá)基因?yàn)? 854個(gè)，其中下調(diào)表達(dá)基因1 012個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因842個(gè)。差異表達(dá)基因數(shù)量逐漸減少，說(shuō)明本研究設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)中外源水楊酸噴施后6 h的誘導(dǎo)效果最為明顯。

差異表達(dá)基因維恩圖分析結(jié)果（圖2）顯示，處理6 h時(shí)特有的差異表達(dá)基因有9 360個(gè)，處理12 h時(shí)特有的差異表達(dá)基因有3 399個(gè)，處理24 h時(shí)特有差異表達(dá)基因596個(gè)，處理48 h時(shí)特有差異表達(dá)基因?yàn)?15個(gè)。表明在水楊酸處理的不同階段茶樹(shù)產(chǎn)生的差異性響應(yīng)會(huì)隨時(shí)間的變化而改變。在外源水楊酸處理0～48 h均發(fā)生差異表達(dá)的基因共有604個(gè)，這是保證外源水楊酸噴施后產(chǎn)生持續(xù)效果的關(guān)鍵。

2.3差異表達(dá)基因GO功能富集分析

GO功能富集結(jié)果（表2）顯示，大量差異表達(dá)功能基因數(shù)量隨時(shí)間變化逐漸減少，如氧酸代謝過(guò)程、 有機(jī)酸代謝過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過(guò)程、細(xì)胞器合成、催化反應(yīng)、膜蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性、蛋白質(zhì)活性、鐵離子結(jié)合、ATP酶活性，而部分差異表達(dá)功能基因數(shù)量在處理12 h后明顯下降，如肽代謝過(guò)程、細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程、翻譯相關(guān)基因、多肽生物合成過(guò)程、細(xì)胞器膜相關(guān)、結(jié)構(gòu)分子活性。處理6 h時(shí)差異表達(dá)基因主要富集于生物過(guò)程，富集于細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程、有機(jī)酸代謝過(guò)程、肽代謝過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)和多肽生物合成過(guò)程的基因數(shù)分別為247個(gè)、220個(gè)、191個(gè)、143個(gè)、186個(gè)。富集于核糖體和細(xì)胞外圍的細(xì)胞組成功能基因較多，數(shù)量分別為127個(gè)、69個(gè)。在分子功能方面，處理6 h時(shí)富集于水解酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性、核糖核酸結(jié)合和脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的差異表達(dá)基因數(shù)量分別為156個(gè)、158個(gè)、153個(gè)、147個(gè)。細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程相關(guān)基因中198個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，49個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程相關(guān)基因中23個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，66個(gè)下調(diào)表達(dá)。鐵離子結(jié)合相關(guān)基因中72個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，61個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)基因中69個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，98個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

2.4差異表達(dá)基因KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果（表3）顯示，大部分信號(hào)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因在處理6 h時(shí)富集數(shù)量最多，隨檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)增加差異表達(dá)基因富集數(shù)量逐漸減少。水楊酸處理6 h時(shí)有大量差異表達(dá)基因富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原菌互作、核糖體、剪接體和碳代謝通路上，富集的基因數(shù)量分別為95個(gè)、73個(gè)、121個(gè)、94個(gè)、154個(gè)。另外，富集在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路的差異表達(dá)基因數(shù)量分別為45個(gè)、72個(gè)、60個(gè)。富集在糖酵解途徑的差異表達(dá)基因數(shù)量為63個(gè)。核糖體相關(guān)通路共富集到差異表達(dá)基因121個(gè)，其中110個(gè)上調(diào)表達(dá)，下調(diào)表達(dá)數(shù)僅為11個(gè)。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共富集到95個(gè)差異表達(dá)基因，其中58個(gè)發(fā)生上調(diào)表達(dá)，有37個(gè)下調(diào)表達(dá)。植物-病原菌互作通路共富集到差異表達(dá)基因73個(gè)，其中51個(gè)上調(diào)表達(dá)，22個(gè)下調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明外源水楊酸影響了茶樹(shù)內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，推測(cè)在外源水楊酸噴施后茶樹(shù)通過(guò)各信號(hào)通路的協(xié)同作用抵御病害侵染。

2.5差異表達(dá)基因中HSP相關(guān)基因

HSP是高度保守的分子伴侶蛋白質(zhì)，是植物通過(guò)調(diào)節(jié)熱激蛋白應(yīng)對(duì)脅迫形成的一種自適應(yīng)系統(tǒng)。本研究結(jié)果顯示，水楊酸噴施處理6 h時(shí)激活了12個(gè)熱激因子（HSF），包括HSF8、HSF24、HSF30、HSFB1、HSFC1、HSFA1、HSFA2B、HSFA3、HSFA8、HSFB1、HSFB2A、HSFB2B。熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子的激活能夠調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻谋磉_(dá)，結(jié)果顯示，處理6 h時(shí)有40個(gè)熱激蛋白基因發(fā)生差異表達(dá)，且全部上調(diào)表達(dá)，包括10個(gè)HSP70、4個(gè)HSP90、1個(gè)HSP15.7、7個(gè)HSP18.1、4個(gè)HSP18.2、3個(gè)HSP17.9、2個(gè)HSP20、1個(gè)HSP22、1個(gè)HSP23、3個(gè)HSP26、3個(gè)HSP82、1個(gè)HSP83家族基因。下調(diào)表達(dá)的熱激蛋白基因僅有HSP26。處理12 h時(shí)仍上調(diào)表達(dá)的熱激因子有3個(gè)，32個(gè)熱激蛋白基因上調(diào)表達(dá)，與處理6 h相比上調(diào)表達(dá)的HSP70家族基因由10個(gè)下降為5個(gè)，HSP90家族基因由4個(gè)下降為3個(gè)，HSP18.1家族基因由7個(gè)下降為6個(gè)，HSP18.2和HSP17.9上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量無(wú)變化（表4）。處理24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)的熱激因子基因僅有HSFA1。28個(gè)熱激蛋白基因上調(diào)表達(dá)，與處理12 h相比，HSP70家族基因上調(diào)表達(dá)數(shù)量不變，HSP90家族基因由3個(gè)變?yōu)?個(gè)，HSP18.1家族基因由6個(gè)下降到4個(gè)，HSP18.2家族基因由4個(gè)下降到3個(gè)，HSP17.9家族基因上調(diào)表達(dá)數(shù)量不變。處理48 h時(shí)，無(wú)上調(diào)表達(dá)的熱激因子基因，但仍有28個(gè)熱激蛋白基因上調(diào)表達(dá)，與處理24 h相比，HSP70家族基因，HSP90家族基因，小熱激蛋白HSP18.1、HSP18.2、HSP17.9家族基因上調(diào)表達(dá)數(shù)量無(wú)變化。

2.6差異表達(dá)基因中脅迫相關(guān)基因

NPR基因在植物免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，本研究結(jié)果顯示，共有3個(gè)NPR基因在水楊酸噴施處理6 h的時(shí)間節(jié)點(diǎn)處上調(diào)表達(dá)，12 h開(kāi)始無(wú)NPR基因上調(diào)表達(dá)（表5）。BOP1基因在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)，在外源水楊酸處理6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)，上調(diào)表達(dá)倍數(shù)分別為1.38倍、1.53倍、1.43倍、1.24倍。病程相關(guān)（PR）蛋白通常在脅迫環(huán)境下被誘導(dǎo)產(chǎn)生，本研究中水楊酸誘導(dǎo)的PR蛋白基因在處理48 h時(shí)仍然上調(diào)表達(dá)。WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子在水楊酸通路中起著關(guān)鍵性的作用，結(jié)果顯示，處理6 h和12 h時(shí)上調(diào)表達(dá)的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因均為12個(gè)，處理24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)?0個(gè)，處理48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因減少到9個(gè)。激酶在植物體中參與眾多的催化進(jìn)程，激活或能化底物分子。本研究在處理6 h時(shí)誘導(dǎo)了192個(gè)激酶相關(guān)的基因，這一數(shù)量在處理后的12 h時(shí)從192個(gè)減少120個(gè)，在處理24 h時(shí)減少至101個(gè)，在處理48 h時(shí)誘導(dǎo)的激酶相關(guān)基因數(shù)量為70。MYB家族在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中起著重要作用，本研究結(jié)果顯示，水楊酸噴施后6 h時(shí)24個(gè)MYB家族基因上調(diào)表達(dá)，在噴施后12 h時(shí)19個(gè)MYB家族基因上調(diào)表達(dá)，噴施后24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)下降為9個(gè)，處理后48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?個(gè)。AP2家族廣泛參與植物發(fā)育與脅迫應(yīng)答等多種生物學(xué)進(jìn)程，本研究結(jié)果顯示，處理6 h時(shí)19個(gè)AP2家族基因上調(diào)表達(dá)，處理12 h時(shí)12個(gè)AP2家族基因上調(diào)表達(dá)，處理24 h時(shí)減少到7個(gè)，處理48 h時(shí)仍有7個(gè)AP2家族基因上調(diào)表達(dá)。bZIP被認(rèn)為參與多種生物學(xué)進(jìn)程，包括花發(fā)育、光信號(hào)、病菌防御以及逆境脅迫響應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，13個(gè)bZIP家族基因在水楊酸噴施處理6 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，12 h后下降為5個(gè)，24 h時(shí)仍有5個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，48 h時(shí)僅剩3個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。這些差異表達(dá)基因?qū)⑹峭庠此畻钏嵴T導(dǎo)茶樹(shù)抗病機(jī)制的關(guān)鍵。

3討論

外源水楊酸與內(nèi)源水楊酸一樣，都能夠誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)。NPR1是第一個(gè)被報(bào)道的水楊酸誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)必需的基因，分為3個(gè)大類(lèi)，NPR1和NPR2為一類(lèi)，NPR3和NPR4為一類(lèi)，BOP1和BOP2為一類(lèi)[17]。NPR蛋白作為中樞調(diào)節(jié)水楊酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)[18]，通過(guò)與其他激素調(diào)節(jié)途徑的相互作用調(diào)節(jié)免疫和其他生物進(jìn)程[19]。NPR1和NPR2在水楊酸誘導(dǎo)反應(yīng)的下游基因調(diào)控中起著積極的作用，而NPR3和NPR4起負(fù)調(diào)控作用[3， 20]。NPR1、NPR2、NPR3和NPR4在體外試驗(yàn)中與水楊酸具有強(qiáng)相互作用，而B(niǎo)OP1和BOP2與水楊酸具有弱相互作用[21]。本研究中BOP1基因在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)，因此推測(cè)BOP1基因同樣在茶樹(shù)對(duì)外源水楊酸的響應(yīng)中發(fā)揮作用。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在植物中調(diào)控各種發(fā)育過(guò)程和脅迫反應(yīng)，并且參與水楊酸信號(hào)通路。在煙草中水楊酸能夠提高WRKY5、WRKY7、WRKY27、WRKY31、WRKY40、WRKY50、WRKY56、WRKY59、WRKY60、WRKY102的表達(dá)水平，其中WRKY40的上調(diào)表達(dá)增強(qiáng)了煙草的抗性[22]。在擬南芥中，水楊酸促進(jìn)了NPR1與WRKY18的相互作用，促進(jìn)了NPR1在植物防御機(jī)制中的表達(dá)[23]。WRKY19的表達(dá)促進(jìn)了擬南芥對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的基礎(chǔ)免疫[24]。本研究中水楊酸處理激活了WRKY14、WRKY17、WRKY18、WRKY19等12個(gè)WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)，這可能是水楊酸誘導(dǎo)茶樹(shù)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。

研究結(jié)果表明，HSP基因參與植物的抗病，例如，HSP90基因上調(diào)表達(dá)能夠提高番茄對(duì)番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的抗性[25]。而在一些植物中HSP基因的應(yīng)答并不一致，如病原真菌侵染時(shí)水稻中HSP基因表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，其中HSP16、HSP17、HSP18.1和HSP18.2上調(diào)表達(dá)，HSP16.6、HSP17.8、HSP18.8和HSP22下調(diào)表達(dá)[26]。HSP基因還能夠調(diào)控真菌感染的嚴(yán)重程度，如番茄中尖孢鐮刀菌的侵染與HSP20和PR蛋白有關(guān)[27];HSP17.6的沉默造成黑根霉侵染[28]。本研究中外源水楊酸噴施造成40個(gè)HSP基因上調(diào)表達(dá)，僅HSP26基因下調(diào)表達(dá)。蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)顯示HSP70和HSP89.1在關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，HSP70與AP2直接關(guān)聯(lián)，并且與苯丙氨酸解氨酶（PAL）間接相關(guān)。 PAL是用作衡量植物抗逆性的重要指標(biāo)[29]，HSP70與PAL的關(guān)聯(lián)性表明HSP70在植物抗逆性中扮演關(guān)鍵角色。目前，已知外源水楊酸能夠誘導(dǎo)植物的免疫反應(yīng)，而且水楊酸能夠應(yīng)用于茶餅病的防控[30]，但熱激蛋白是否參與茶樹(shù)的抗病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2023-04-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-19）;世界大葉茶技術(shù)創(chuàng)新中心建設(shè)及成果產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（202102AE090038）

作者簡(jiǎn)介：劉悅（1990-），女，黑龍江七臺(tái)河人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)椴铇?shù)遺傳育種。（E-mail）liuyue0504@126.com

通訊作者：陳林波，（E-mail）chenlinbo2002@sina.com