賽子林 韓世欣 齊虹凌 張彥麗 郝愛平 陳宇

賽子林，韓世欣，齊虹凌，等. 添加生物炭對煙草連作土壤化學(xué)性質(zhì)及真菌群落的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（8）：242-252.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.08.032

添加生物炭對煙草連作土壤化學(xué)性質(zhì)及真菌群落的影響

賽子林1， 韓世欣2， 齊虹凌1， 3

（1.牡丹江師范學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011； 2.黑龍江省煙草公司牡丹江煙葉公司，黑龍江牡丹江 157011； 3.牡丹江煙葉公司寧安分公司，黑龍江寧安 157400）

摘要：研究生物炭對煙草土壤化學(xué)性質(zhì)及真菌群落的影響，有助于深入了解煙草連作土壤狀況，為土壤改良及消減煙草連作障礙提供新思路。本研究采用田間試驗，分別施用5、15、25 t/hm2生物炭，并以不添加生物炭處理為對照，通過高通量測序技術(shù)研究生物炭的不同施用量對煙草連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。隨著生物炭施用量的增加，土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著增加，全鉀含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；施加生物炭后顯著增加了土壤交換性鈣的含量。同時，隨著生物炭施用量的增加真菌群落多樣性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中施用5 t/hm2生物炭處理的真菌群落多樣性最高。OTU Richness和Shannon指數(shù)受土壤全氮含量的影響最大，交換性鈣含量與真菌群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。此外，在不同生物炭的施用量下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、功能及組裝過程差異顯著。低施用量生物炭增強(qiáng)了土壤真菌群落之間的相互作用，提高了群落的穩(wěn)定性。低施用量的生物炭處理真菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比高施用量的生物炭處理真菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。施用適宜量（5 t/hm2）的生物炭在促進(jìn)煙草連作土壤真菌多樣性方面發(fā)揮了重要作用。而施加生物炭量過高不僅降低了土壤真菌多樣性，而且降低了真菌群落的網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：生物炭；煙草；土壤真菌群落；高通量測序；共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號：S572.06? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）08-0242-11

收稿日期：2023-10-30

基金項目：牡丹江師范學(xué)院科研項目（編號：YB2021005）；黑龍江省教育廳項目（編號：1451ZD005）；黑龍江省煙草行業(yè)科技項目（編號：20182300002700081）。

作者簡介：賽子林（1999—），男，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向為土壤生物炭。E-mail：szl990320@163.com。

通信作者：齊虹凌，碩士，副教授，主要從事土壤改良方面的研究。E-mail：swxqhl2021@126.com。

煙草是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物，我國是世界上煙草第一生產(chǎn)和消費大國。煙草在我國種植歷史悠久，然而連作障礙的發(fā)生導(dǎo)致植煙土壤質(zhì)量退化、病害頻發(fā)、煙葉品質(zhì)下降，給煙草的生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。因此，改良植煙土壤，提高土壤肥力成為當(dāng)務(wù)之急。生物炭具有容重小、孔隙度高和比表面積大的特點。施加生物炭還可以降低土壤容重，提高土壤微生物的種類和數(shù)量，提高土壤肥力，促進(jìn)煙草生長進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益［2］。因此，通過研究適宜生物炭施用量對改良植煙土壤性質(zhì)以及煙草產(chǎn)質(zhì)量的影響具有重要意義。連作障礙導(dǎo)致土壤化學(xué)性質(zhì)惡化，烤煙黑脛病等病蟲害增加，煙草產(chǎn)質(zhì)量以及土壤微生物多樣性下降［3］。然而，在連作土壤中添加生物炭，可以有效地緩解連作障礙［4］。已有研究表明，在植煙土壤中加入生物炭不僅能夠吸收植物根部釋放的有毒物質(zhì)，還能夠提高土壤氮含量，增加土壤微生物多樣性以及數(shù)量［5］。然而，不同生物炭的施用量所得結(jié)果也不盡相同。姚麗茹等研究發(fā)現(xiàn)，低濃度生物炭（0～20 t/hm2）可以促進(jìn)植物生長、提高土壤pH值、有機(jī)碳含量、全氮含量以及增加微生物多樣性［6］。而Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，施用高濃度生物炭（10～50 t/hm2）導(dǎo)致微生物多樣性指數(shù)顯著降低［7］。上述結(jié)果表明，不同的生物炭施用量會對煙草生長以及微生物多樣性產(chǎn)生不同影響，生物炭具有良好的蓬松性和穩(wěn)定性，前人在生物炭的用量對煙草的生長、煙葉重等方面的影響均有研究，而生物炭的不同施用量對土壤理化性質(zhì)以及土壤微生物的影響尚不明確。本研究通過比較分析4個不同生物炭濃度處理下煙草土壤化學(xué)性質(zhì)及微生物多樣性，確定最佳的生物炭施用濃度，以期為煙田的生物炭施用量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于黑龍江省賓縣賓西鎮(zhèn)永和鄉(xiāng)張家大房屯（黑龍江煙草科學(xué)研究所賓西試驗場，45°47′55″N，127°7′24″E，海拔165 m）。該地區(qū)屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫4.4 ℃。日照平均每天7.2 h，無霜期平均148 d左右。年平均降水量570 mm，降水多集中于7—8月。地形地貌為漫崗地，土壤類型為黑土，質(zhì)地為沙壤土（沙粒占59%、粉粒占39%和黏粒占2%）。耕層土壤pH值為5.8、有機(jī)質(zhì)含量為30.5 g/kg、速效磷含量為 63.1 mg/kg、速效鉀含量為183.7 mg/kg、堿解氮含量為114.1 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗為小區(qū)定位試驗，煙草連作2年茬口。試驗共設(shè)4個處理：（1）不施生物炭（CK）；（2）生物炭施用量為5 t/hm2（B5）；（3）生物炭施用量為 15 t/hm2（B15）；（4）生物炭施用量為25 t/hm2（B25）。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個處理3次重復(fù)。行長 6 m，行距1.15 m，5行小區(qū)，小區(qū)面積34.5 m2。所施生物炭均為玉米秸稈生物炭，由沈陽隆泰生物工程有限公司生產(chǎn)，于2021年一次性施入。

生物炭施用方法：在試驗小區(qū)劃分好后，按照各處理生物炭用量將生物炭均勻撒施在供試小區(qū)地表，采用人工耕作方式，使其與耕層土壤充分混勻，再通過小型機(jī)械翻耕混入耕層土壤。

供試烤煙品種為0110-142。于2022年5月上旬覆膜移栽。種植密度為17 385株/hm2，行株距為1.15 m×0.50 m?；瘜W(xué)肥料為煙草專用肥、重過磷酸鈣、硝酸鉀混合配肥，各處理施純氮量為 22.5 kg/hm2，距煙株兩側(cè)10 cm用施肥器雙側(cè)施入，施肥深度10 cm左右。

1.3 土壤樣品采集

于2022年7月上旬，采用5點取樣法用土鉆在每個小區(qū)采集0～20 cm的土樣。新鮮土樣放入密封袋中用冰袋保存帶回實驗室，過2 mm篩后去除其他雜質(zhì)備用。一部分土壤樣品保存在-80 ℃冰箱中，7 d內(nèi)完成土壤DNA提??；另一部分土壤樣品在室溫下風(fēng)干用于土壤基本化學(xué)性質(zhì)的測定。

1.4 土壤化學(xué)性質(zhì)的測定

土壤化學(xué)性質(zhì)的測定均參照鮑士旦的方法［7］。有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定；全氮含量采用凱氏定氮法測定；土壤總磷含量采用堿溶-鉬銻抗比色法測定；土壤pH值采用電位法測定（水土比為2.5 ∶1）；土壤速效磷含量用鉬銻鈧比色法測定；土壤速效鉀含量用火焰光度法測定；土壤堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測定；氯含量的測定方法參照YC/T 162—2002；用原子吸收分光光度法測定交換性鈣和鎂的含量。

1.5 土壤DNA提取及高通量測序

使用美國OMEGA公司的Mo Bio Power Soil DNA Isolation Kit（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA）試劑盒進(jìn)行DNA提取。從各處理中稱取約0.5 g新鮮樣品，按照試劑盒提取步驟進(jìn)行DNA提取。利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測DNA。用核酸定量儀Nano Drop ND-1000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）檢測DNA濃度同時提純DNA。合格的DNA樣品放于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存。使用真菌引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴(kuò)增真菌ITS序列。PCR反應(yīng)體系：10× FastPfu Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、引物各0.8 μL（5 μL）、TaKaRa rTaq Polymerase 0.2 μL、BSA 0.2 μL、模板DNA 10 ng，加ddH2O至總反應(yīng)體積為20 μL，共3個重復(fù)。擴(kuò)增步驟：95 ℃預(yù)變性 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 變性30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min（PCR儀器：ABIGeneAmp9700）。將所有樣品的PCR產(chǎn)物混合，用2%濃度的瓊脂糖凝膠和DNA純化試劑盒檢測并純化PCR產(chǎn)物。純化后PCR產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq測序。

1.6 原始數(shù)據(jù)處理及生物信息分析

運用QIME Pipeline Version去除所有序列中相同連續(xù)堿基大于8或平均質(zhì)量值小于25的低質(zhì)量原始序列［8］。根據(jù)Mothur的Greengene 13.8數(shù)據(jù)庫［9］，使用“chimera uchime”命令檢測并消除嵌合序列［10］。嵌合體檢測后，使用UCLUST方法將剩余的高質(zhì)量序列以97%的同一性閾值聚類為操作分類單元（OTU）［11］。聚集在同一OTU中的序列數(shù)量被計算為分配給特定OTU的豐度。通過選擇與OTU中其他序列最相似的最長序列，從每個OTU中選擇一個代表性序列。消除相對豐度小于0.001%的OTU以去除低質(zhì)量序列［12］。所得樣本OTU矩陣用于基于OTU的群落分析。細(xì)菌的生物信息分析依據(jù)Silva數(shù)據(jù)庫（Release 115，https：//www.arb-silva.de）［13］，真菌的生物信息分析依據(jù)UNITF數(shù)據(jù)庫（Release 5.0，https：//unite.ut.ee/）［14］。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

真菌微生物群落多樣性指數(shù)采用R中的vegan包計算［15］。根據(jù)Bray-Curtis矩陣，利用R語言中的vegan庫進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。使用R語言中的隨機(jī)森林包對土壤化學(xué)性質(zhì)和多樣性進(jìn)行隨機(jī)森林分析［16］。采用R語言中的ggplot2對真菌微生物群落組成以及微生物群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行可視化，其中微生物群落組成與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性使用R語言中的psych包計算Spearman相關(guān)系數(shù)。使用R語言中的igraph包，構(gòu)建并可視化了低濃度與高濃度生物炭下的真菌網(wǎng)絡(luò)及其拓?fù)鋵傩?，包括連通性、平均性和模塊化等［17-18］。使用FUNGuild數(shù)據(jù)庫預(yù)測真菌的功能特征，并用R語言中g(shù)gplot 2包進(jìn)行可視化。使用標(biāo)準(zhǔn)化隨機(jī)率（NST）方法定量生態(tài)過程中的隨機(jī)性，區(qū)分了確定性過程（NST<0.5）和隨機(jī)性過程（NST>0.5）［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

由表1可知，各處理的根際土壤均呈酸性。與未施生物炭相比，施用5 t/hm2（B5）、15 t/hm2（B15）和25 t/hm2（B25）生物炭的土壤速效鉀（AK）含量、pH值、堿解氮（AHN）含量、Cl-含量、陽離子交換量（CEC）、全磷（TP）含量和交換性鎂含量均無顯著差異（P>0.05）。與CK相比，B25處理土壤有效磷（AP）含量增加了234.07%（P<0.05）；B15和B25處理土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）含量分別提高了9.92%和19.91%（P<0.05）；B5處理全鉀（TK）含量增加了3.43%（P<0.05）。各處理土壤交換性鈣含量表現(xiàn)為B25>B15>CK>B5，與CK相比，B15和B25處理分別顯著提高14.10%、18.10%（P<0.05）。與B25處理相比，B5處理土壤全氮（TN）含量降低了6.43%（P<0.05）。

2.2 真菌群落多樣性和豐富度

由圖1-a可知，Shannon指數(shù)表現(xiàn)為B5>B15>CK>B25，B5處理顯著高于CK和B25處理（P<0.05），分別增加了0.91和1.05。但OTU Richness指數(shù)對添加生物炭的變化不同（圖1-b），B5和B15處理的OTU Richness指數(shù)顯著高于CK，分別增加了151和125，表明施用生物炭對土壤微生物的多樣性及豐富度有一定促進(jìn)作用，以低濃度（B5）處理效果最好。PCoA結(jié)果表明，在不同生物炭施用量的土壤中，真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（P<0.05）（圖2-a），這一點得到了β分散試驗的證實（圖2-c）。隨著生物炭施用量的增加導(dǎo)致β多樣性指數(shù)顯著降低（P<0.05）（圖2-b）。隨機(jī)森林分析結(jié)果顯示，TN含量是OTU Richness和Shannon指數(shù)的主要影響因素（圖1）。Mantel試驗分析結(jié)果表明，交換性鈣含量與真菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)（表2）。

2.3 真菌群落組成

由于在土壤真菌群落已知的門數(shù)量較少，進(jìn)一步分析了屬水平上的差異（圖3，表3）。各處理土壤真菌屬水平（前10）優(yōu)勢菌群如下：籃狀菌屬（Talaromyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、木拉克屬（Mrakia）、發(fā)膚菌屬（Piloderma）、棉革菌屬（Tomentella）、紅菇屬（Russula）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）、被孢霉屬（Mortierella）、絲膜菌屬（Cortinarius）和一部分未知真菌（圖3-a）。其中，B25處理木拉克屬（Mrakia）的相對豐度最高，CK中絲膜菌屬（Cortinarius）的相對豐度顯著高于其他處理（P<0.05），發(fā)膚菌屬（Piloderma）在CK、B15、B25處理間無顯著差異（P>0.05）。B15和B25處理中鐮刀菌屬（Fusarium）、木拉克屬（Mrakia）的相對豐度顯著高于CK和B5處理（P<0.05），而紅菇屬（Russula）的相對豐度與之相反。CK處理中被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著低于其他處理（P<0.05）。CK和B5處理中古根菌屬（Archaeorhizomyces）和棉革菌屬（Tomentella）的相對豐度高于B15和B25處理。籃狀菌屬（Talaromyces）的相對豐度在B5處理中最低。利用Spearman相關(guān)分析進(jìn)一步分析土壤化學(xué)性質(zhì)對優(yōu)勢屬的影響（圖3-b），發(fā)現(xiàn)木拉克屬（Mrakia）和籃狀菌屬（Talaromyces）與CEC和TK含量呈顯著負(fù)相關(guān)；木拉克屬（Mrakia）、鐮刀菌屬（Fusarium）和籃狀菌屬（Talaromyces）與SOM含量和交換性鈣含量呈顯著正相關(guān)；古根菌屬（Archaeorhizomyces）、紅菇屬（Russula）與CEC呈正相關(guān)，而籃狀菌屬（Talaromyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）與CEC呈顯著負(fù)相關(guān)；棉革菌屬（Tomentella）、紅菇屬（Russula）和古根菌屬（Archaeorhizomyces）與SOM含量和交換性鈣含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.4 真菌群落功能預(yù)測與群落組裝過程

為探究不同生物炭處理下真菌群落功能是否存在差異，選取土壤中真菌生態(tài)功能進(jìn)行研究。由圖4可知，隨著生物炭施用量的逐漸增加，未知（unknown）的類別逐漸減少，B5、B15和B25處理下未知菌的比例分別為80.85%、38.16%和26.44%。共生營養(yǎng)型（symbiotroph）真菌分別占CK、B5、B15和B25處理的39.83%、14.36%、0.10%和0.06%。腐生營養(yǎng)型（saprotroph）真菌分別占比1.31%、4.78%、61.60%和73.48%。因此，隨著生物炭施用量的增加腐生營養(yǎng)型真菌比例有所增加。病理營養(yǎng)型（pathotroph）真菌占比分別為0.02%、0.02%、0.15%和0.03%。進(jìn)一步分析營養(yǎng)模式信息發(fā)現(xiàn)：與其他處理相比，B15處理中Fungal Parasite、Plant Pathogen和Leaf Saprotroph的相對豐度明顯較高；而施加生物炭處理的Animal Pathogen、Epiphyte、Soil Saprotroph、Ectomycorrhizal和Orchid Mycorrhizal的相對豐度明顯低于CK，B25處理Wood Saprotroph的相對豐度明顯較高，B5處理Arbuscular Mycorrhizal的相對豐度高于其他處理（圖4-e）。綜上所述，不同生物炭施用量對真菌群落功能有影響。通過計算NST分析不同生物炭施用量處理下土壤真菌群落的組裝過程（圖5），土壤真菌群落中B5處理的NST值大于0.5，表明在B5處理中土壤真菌群落的組裝過程受隨機(jī)性過程的主導(dǎo)，而CK、B15和B25處理下土壤真菌群落的組裝過程均受確定性過程主導(dǎo)。

2.5 真菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

PCoA結(jié)果（圖2）顯示，添加低濃度（CK和B5）和高濃度（B15和B25）生物炭處理是明顯分開的，分別分布于PCoA1的負(fù)方向和正方向上，說明CK和B5處理以及B15和B25處理真菌群落結(jié)構(gòu)相似。因此，進(jìn)一步分析了施加低濃度生物炭和高濃度生物炭之間的真菌群落網(wǎng)絡(luò)和主要拓?fù)湫再|(zhì)的差異（圖6和表4）。由節(jié)點和邊的數(shù)量可以看出，施加低濃度生物炭具有更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖6和表4）。這些結(jié)果也表現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，即平均度、模塊化系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)直徑。低濃度生物炭處理的平均度、網(wǎng)絡(luò)直徑、模塊化系數(shù)均高于高濃度生物炭處理，分別提高了0.37、9、0.116（表4）。

3 討論與結(jié)論

3.1 施加不同濃度生物炭對煙草土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，施用5 t/hm2生物炭土壤的全鉀含量顯著高于未施用生物炭土壤。生物炭的添加已被證實能夠促進(jìn)土壤全鉀含量的增加，進(jìn)而提高土壤肥力［20］。然而，本研究注意到隨著生物炭施用量的增加，土壤全鉀含量變化并不顯著。生物炭在一定程度上增加了土壤的孔隙結(jié)構(gòu)， 增加土壤全鉀的總輸出負(fù)荷，這可能是僅在施用5 t/hm2生物炭處理表現(xiàn)顯著促進(jìn)的原因［21］。此外，這也與王薇薇等的研究結(jié)果相似，即高用量的生物炭投入并不一定促進(jìn)土壤全鉀含量的增加［22-23］。鈣和鎂是煙草種植生長過程中重要且必需的中量元素，植煙土壤交換性鈣鎂的水平失衡容易導(dǎo)致烤煙的生理性功能障礙［24］。施用15 t/hm2和25 t/hm2生物炭顯著增加了土壤交換性鈣含量，這表明生物炭施用量的增加對煙草植株具有潛在的促進(jìn)作用。一般來講，酸性土壤中吸附于土壤膠體中的交換性鈣可直接與土壤中的氫離子進(jìn)行交換導(dǎo)致在土壤中流失，降低土壤交換性鈣含量［25］。本研究土壤的pH值處于6.464～6.549之間，酸性土壤中交換性鈣含量的增加可能是由土壤有機(jī)質(zhì)含量的變化所驅(qū)動的。在施用15 t/hm2和25 t/hm2生物炭土壤有機(jī)質(zhì)含量的變化中發(fā)現(xiàn)了相同的變化趨勢，即土壤有機(jī)質(zhì)含量隨著生物炭施用量增加而增加。土壤有機(jī)質(zhì)存在著大量帶有負(fù)電荷的氨基酸和羧酸，能夠與交換性鈣發(fā)生吸附作用形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而增強(qiáng)對交換性鈣的吸附能力［26］。有研究表明，生物炭能夠提高土壤的養(yǎng)分含量，其中就包括土壤速效磷［27］。Chen等通過添加生物炭改良鹽堿地土壤發(fā)現(xiàn)，生物炭的添加能夠顯著提高土壤速效磷含量［28］。Jing等的研究也證實，施加生物炭能夠顯著促進(jìn)土壤速效磷含量的增加［29］。

3.2 施加不同濃度生物炭對煙草土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

生物炭因具備有效儲存碳的能力而被視為一種很好的改良劑，生物炭對土壤真菌群落的積極影響已被廣泛報道［30-31］。例如，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭對土壤真菌群落的α多樣性影響較大，子囊菌的相對豐度在所有菌群中受土壤生物炭的影響最大［32］。Li等通過Illumina MiSeq測序也證實了土壤真菌對生物炭應(yīng)用的響應(yīng)存在明顯差異，生物炭促進(jìn)了真菌豐富度和多樣性的增加［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，施用5 t/hm2和15 t/hm2生物炭處理土壤真菌群落豐富度指數(shù)顯著提高，而多樣性指數(shù)僅在5 t/hm2生物炭處理表現(xiàn)更優(yōu)勢。這可能是由于土壤生物炭結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，主要成分為芳香烴的惰性碳庫，不易分解，對真菌群落多樣性的作用較為緩慢［34-35］。全氮是驅(qū)動植煙土壤真菌群落多樣性和豐富度變化的主要因素。Zeng等通過對黃土高原區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)土壤的24個樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)真菌群落的Shannon指數(shù)與OTU豐富度與土壤全氮含量顯著相關(guān)［36］。此外，Chen等同樣利用隨機(jī)森林預(yù)測發(fā)現(xiàn)，土壤真菌群落多樣性主要由有機(jī)質(zhì)和全氮含量預(yù)測，其次是地上生物量和降水量等其他參數(shù)［37］，本研究進(jìn)一步印證了這個結(jié)果。

本研究中PCoA圖的PCoA1將未施用生物炭和 5 t/hm2 與施用15 t/hm2和25 t/hm2生物炭的處理分割為明顯的2個部分，說明生物炭的施用量顯著改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，這與前人的研究結(jié)果［38-39］保持一致。本研究通過Mantel試驗分析發(fā)現(xiàn)，土壤交換性鈣含量是影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。Hou等也通過Mantel試驗分析證實了土壤速效磷含量、脲酶活性和土壤交換性鈣含量是與真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)的主導(dǎo)因子［40］。相比于未施用和低施用量生物炭的處理（CK和B5），高施用量生物炭顯著提高了Fusarium和Mrakia的相對豐度。Elmer等報道了硬木屑炭可以通過增加叢枝菌根的定殖來減少土壤鐮刀菌根腐病的發(fā)生［41］。生物炭的施用還可以形成特定的微生物種群，形成競爭機(jī)制來抑制致病菌的發(fā)生與危害［42-43］，本研究得到的結(jié)果與之相反。有研究報道，生物炭并不是在所有的情況下都能通過提高有益土壤微生物菌群的活動來抑制致病菌豐度的增加［44］。這需要進(jìn)一步確定土壤微生物群落特征及其對不同地上作物的反應(yīng)機(jī)制，才能明確特定生態(tài)系統(tǒng)下添加生物炭能否促進(jìn)有益菌群落或間接抑制鐮刀菌病害的發(fā)生［45］。除此之外，Wang等通過玉米和大豆輪作的研究發(fā)現(xiàn)，Mrakia的相對豐度與地上作物產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)［46］。煙草的產(chǎn)量已被證實隨生物炭量增加而增加［47］。高投入量的生物炭可能會通過促進(jìn)煙草植株的產(chǎn)量進(jìn)而影響Mrakia的相對豐度。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)了施用生物炭導(dǎo)致真菌群落組成相對豐度的降低。相較于未施用生物炭，生物炭的施用降低了Cortinarius和Russula的相對豐度。專門從事有機(jī)氮和磷采集的真菌類群Cortinarius的減少，可能是由于生物炭的投入吸收了土壤中一部分的有機(jī)氮和磷［48］。Mortierella的相對豐度升高，表明生物炭的施入促進(jìn)了Mortierella在抵御病害疾病中的積極作用［49］。施用5 t/hm2處理的土壤真菌群落Talaromyces的相對豐度明顯降低。潛在的植物有益菌Talaromyces通常在肥力較高的土壤中富集［50］。低用量的生物炭投入并未補(bǔ)給更多的養(yǎng)分支持，并且可能吸附了一部分土壤養(yǎng)分，造成了與未投入生物炭處理相比的土壤養(yǎng)分虧缺。此外，Talaromyces與土壤全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，施用 5 t/hm2 處理提高了土壤全鉀含量造成了Talaromyces相對豐度的降低。Jiang等研究報道，生物炭的施用會導(dǎo)致Russula相對豐度的降低［51］。Cheng等在我國東北地區(qū)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)含量與Tomentella的相對豐度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，Tomentella的相對豐度可能受到東北黑土區(qū)地理位置效應(yīng)的影響［52］。施用15 t/hm2和25 t/hm2生物炭處理土壤中Archaeorhizoyces相對豐度的降低可能是由于交換性鈣濃度的提高而導(dǎo)致的。Spearman相關(guān)性分析進(jìn)一步證實了這一猜測，Archaeorhizoyces的相對豐度與土壤交換性鈣含量呈顯著負(fù)相關(guān)。除此之外，本研究還注意到不同優(yōu)勢屬水平分類群與土壤性質(zhì)呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，如土壤有機(jī)質(zhì)含量、CEC、全氮含量等。生物炭的施入通過改變土壤環(huán)境因子進(jìn)而影響土壤真菌群落組成，這與前人的研究結(jié)果［53-55］一致。

3.3 施加不同濃度生物炭對煙草土壤真菌群落組裝和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的影響

在群落生態(tài)學(xué)中，微生物群落組成的更替由生態(tài)學(xué)組裝過程控制，即確定性和隨機(jī)性過程［56-58］。確定性過程影響微生物群落的適應(yīng)度，從而影響微生物群落數(shù)量和組成，而隨機(jī)過程導(dǎo)致群落組成的不可預(yù)測變化［59］。確定性和隨機(jī)性過程都會影響微生物群落的功能［60-61］。本研究發(fā)現(xiàn)，僅施用 5 t/hm2 生物炭的處理由隨機(jī)性過程所主導(dǎo)，而其余處理均由確定性過程所主導(dǎo)。少量生物炭的施用可能促進(jìn)土壤形成了較15 t/hm2和25 t/hm2生物炭處理更小的微團(tuán)聚體。這些小的微團(tuán)聚體與腐生菌產(chǎn)物結(jié)合成了稍大的微團(tuán)聚體，這為真菌提供了保護(hù)性的棲息地。許多研究表明，較小團(tuán)聚體的營養(yǎng)成分受環(huán)境變化的影響較?。?2-63］。因此，與高施用量的生物炭處理相比，5 t/hm2生物炭處理可能較少受到環(huán)境因素的影響，從而使真菌群落組裝過程更具有隨機(jī)性。此外，土壤真菌群落多樣性的變化也可能會影響NST值。Xu等的研究表明，土壤真菌多樣性與NST值呈極強(qiáng)的正相關(guān)，而土壤環(huán)境因子僅與NST值密切相關(guān)［64］。Zheng等的研究也證實，真菌群落NST值與真菌多樣性呈正相關(guān)［65］。因此，施用5 t/hm2生物炭處理土壤真菌群落組裝的變化也可能是多樣性的顯著提高所引起的。

基于相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)分析已被廣泛用于推測微生物相互作用［66-67］。微生物物種間的合作與競爭相互作用會影響微生物穩(wěn)定性［68-69］。例如，Li等通過探究種植模式多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，相較于單一種植系統(tǒng)，混作能夠提高土壤真菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性［54］。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度生物炭的施入抑制了土壤真菌群落的網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性。土壤真菌群落的網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性與網(wǎng)絡(luò)整體的節(jié)點和邊密切相關(guān)，復(fù)雜的微生物網(wǎng)絡(luò)通常具有更多的節(jié)點與邊［54］。此外，隨著生物炭濃度的增加，網(wǎng)絡(luò)的平均度降低。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，向鹽堿地添加秸稈后，網(wǎng)絡(luò)平均度得到提高，真菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性得到顯著提高［70］。網(wǎng)絡(luò)平均度的變化表明，高濃度生物炭的施入造成土壤真菌群落網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的降低，這也由網(wǎng)絡(luò)直徑進(jìn)一步證實［71］。同樣，平均路徑長度和模塊化系數(shù)的降低也表明高濃度生物炭的施入造成土壤真菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的降低。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，植物入侵降低了土壤真菌群落平均路徑長度，從而降低了網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性［72］。土壤真菌網(wǎng)絡(luò)較高的模塊化表明其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和生態(tài)位分化更為復(fù)雜，高濃度的生物炭施入可能也會降低網(wǎng)絡(luò)生態(tài)位分化的復(fù)雜性［73］。前人已有研究報道了生物炭的添加導(dǎo)致土壤真菌群落網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的降低［74-75］。Zhang等認(rèn)為在微生物網(wǎng)絡(luò)生態(tài)中，只有適當(dāng)生物炭的投入才能促進(jìn)土壤微生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性［76］。由于生物炭的獨特性質(zhì)，生物炭添加入土壤后會影響微生物之間的相互作用［77］。不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物網(wǎng)絡(luò)因不同的外界條件而導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的不同［78-79］，本研究所關(guān)注的是對養(yǎng)分需求強(qiáng)烈的植煙土壤。生物炭可能更多地補(bǔ)給土壤養(yǎng)分供植物吸收，并削弱了土壤微生物之間的關(guān)系［80］。

3.4 施加不同濃度生物炭對煙草土壤真菌群落功能類群的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，施用15 t/hm2和25 t/hm2生物炭顯著刺激了土壤真菌群落腐生菌相對豐度的增加。腐生真菌通過釋放木質(zhì)素分解酶分解復(fù)雜的有機(jī)質(zhì)，介導(dǎo)陸地生態(tài)系統(tǒng)地球化學(xué)循環(huán)的關(guān)鍵微生物群落［81］。前人研究報道，腐生真菌似乎推動了真菌生物量與土壤碳的強(qiáng)正相關(guān)［82］，高施用量的生物炭帶來了一定的碳投入，這促進(jìn)了腐生真菌相對豐度的提高。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，土壤水分抑制了土壤共生真菌的豐度［83］。生物炭作為改良劑施入土壤后，可吸附更多的土壤水分［84］。隨著生物炭施入量的增加造成土壤水分的變化可能是導(dǎo)致共生菌相對豐度降低的原因。施用15 t/hm2生物炭后發(fā)現(xiàn)，致病菌的相對豐度得到提高。說明施用15 t/hm2生物炭增加了煙草染病的風(fēng)險，可能會造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，這與15 t/hm2生物炭顯著提高了致病菌Fusarium的相對豐度的結(jié)果吻合。

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