盧平 曾彥清 馬揚揚 黃鶴鳴 胡興川 陳思原 吳志高

摘要：為探究在水肥一體化技術下追施不同鉀肥對烤煙葉片鉀吸收規(guī)律的影響，為烤煙質(zhì)量調(diào)控提供參考。以云煙99為研究對象，設置不同鉀肥為試驗因素，以當?shù)爻Ｓ免浄剩蛩徕洠┳鳛閷φ眨–K），設置磷酸二氫鉀（T1）、焦磷酸鉀（T2）、黃腐酸鉀（T3）3個鉀肥處理，研究不同處理對烤煙生育期葉片鉀含量、葉片鉀積累量與積累速率、鉀通道基因表達量及烤后煙常規(guī)化學成分的影響。結果表明，與移栽后30 d相比，在烤煙移栽后90 d，CK、T1、T2、T3處理葉片鉀含量分別降低了60.19%、52.75%、56.31%、48.54%，降低幅度表現(xiàn)為CK>T2>T1>T3。在烤煙移栽后45～60、75～90 d，T3處理烤煙葉片鉀的積累量、積累速率高于其他處理。在烤煙移栽后50 d，T1處理NtKC1基因相對表達量為CK處理的5.15倍。在烤煙移栽后65 d，T1、T3處理的NtHAK基因相對表達量分別為CK處理的4.27、3.77倍，T3處理NtNHX2基因的相對表達量為CK處理的3.46倍。在烤煙移栽后90 d，T3處理NtKC1基因的相對表達量為CK處理的7.98倍。在T3處理下，烤后煙上、中部葉鉀含量分別較CK處理提高了10.00%、33.33%，烤后煙中部葉鉀氯比較CK處理提高了107.41%。在水肥一體化技術下追施黃腐酸鉀可以顯著降低烤煙生育后期葉片鉀的流失量，提高葉片鉀的積累量及積累速率，誘導NtHAK、NtNHX2基因表達，并提高烤后煙中上部葉鉀含量、中部葉鉀氯比。

關鍵詞：水肥一體化技術；鉀肥；吸收；鉀通道基因相對表達量

中圖分類號：S572.06? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）08-0080-06

收稿日期：2023-06-08

基金項目：福建中煙工業(yè)有限責任公司科技計劃（編號：2021350000340469）。

作者簡介：盧 平（1972—），男，福建福州人，農(nóng)藝師，主要從事煙草原料學研究。E-mail：331222069@qq.com。

通信作者：吳志高，農(nóng)藝師，主要從事煙草生產(chǎn)和管理研究。E-mail：84848383@qq.com。

鉀離子是植物生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一，其含量約占植物干物質(zhì)量的0.3%～5.0%，植物生長發(fā)育過程和生理代謝過程的多個環(huán)節(jié)均有鉀離子的參與和調(diào)控［1］。鉀離子對煙草品質(zhì)有重要影響，它不僅能改善煙葉的燃燒性、降低焦油含量，并且顯著影響了烤后煙葉的可用性［2］。在低鉀脅迫下，煙堿含量增加，煙葉身份過厚，細胞間隙增大，煙株矮小且生長緩慢，葉尖、葉緣有雜色斑點，嚴重時甚至導致煙株死亡［3-4］。王英鋒等的研究結果表明，鈣濃度為5 mmol/L的水培條件最大限度緩解了低鉀脅迫造成的煙株生長緩慢及鉀吸收抑制現(xiàn)象［5］。巫彬芳研究證實，滴灌施肥可以大幅提高煙葉鉀含量［6］，這與席奇亮的研究結果［7］一致。江文林的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)割、斷根處理及運用降堿提鉀制劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等方式均達到了提升煙葉鉀含量、改善煙葉品質(zhì)的效果［8］。胡瓏瀚通過噴施不同葉面肥和分段式增施鉀肥的方式，也達到了煙葉提鉀的效果［9］。

目前，一般認為植物對鉀離子的吸收有2套機制，即高鉀濃度下的低親和性鉀吸收機制及低鉀濃度下的高親和性鉀吸收機制［10］。高親和性鉀吸收為逆濃度梯度運輸?shù)闹鲃游者^程，一般發(fā)生在外界鉀離子濃度為1～200 μmol/L時，需通過細胞質(zhì)膜上的載體協(xié)助完成，其載體被稱為“離子泵”，低親和性鉀吸收是順濃度梯度運輸?shù)谋粍游者^程，主要發(fā)生在外界鉀離子濃度為1～10 mmol/L時，其運輸通道被稱為“離子通道”［10-12］。植物吸收鉀離子的過程需要多種蛋白質(zhì)參與，從分子水平上看，KUP/HAK/KT、HKT和CPA家族的鉀轉運蛋白是鉀離子主動運輸過程的主要參與者，而Shaker、TPK、Kir-like家族的鉀離子通道蛋白主要參與鉀離子的被動運輸過程［13-14］。

Shaker家族是在煙草鉀吸收與轉運中研究最早的轉運蛋白，目前已報道的煙草Shaker鉀通道基因共有12個，分別為圓錐煙草的NpKT1，普通煙草的NKT1、NKT2、NtKC1、NTORK1、NKT3、NKT4、NKT5、NtKAT3、NtSKOR，林煙草的NKT6和黃花煙草的NKC1［15-23］。其中，NKT1、NKT2、NtKC1為內(nèi)向整流鉀通道基因，與擬南芥的鉀通道基因AKT1、AKT2、AtKC1同源，NTORK1為外向整流鉀通道基因，與擬南芥的鉀通道Group V同源。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度水楊酸和低濃度萘乙酸可以誘導NTORK1表達，從而促進煙草根系鉀離子外流。NKT3、NKT5和擬南芥AtKC1基因同源［16-17，19］。NKT4主要在煙草的根部表達，與煙草的低鉀、干旱脅迫有關［18］。NtKAT3基因在煙草的根、莖、葉及花中均有表達，與煙草的低鉀、高鹽脅迫有關［20］。與NTORK1一樣，NtSKOR也為外向整流鉀通道基因，可能在調(diào)節(jié)煙草的低鉀、高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫中發(fā)揮了重要作用［21］。NKT6與擬南芥KAT1/KAT2同源，主要定位于細胞膜和核膜附近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其在林煙草的莖、腋芽、萼片、葉、花、根中均有表達，在外源施加脫落酸處理與干旱脅迫下，該基因的表達量下降，可能與林煙草的氣孔運動有關［22］。

目前對煙草TPK家族基因的研究較少，僅報道了NtTPK1、NtTPK2這2個TPK家族的鉀通道基因。其中NtTPK1存在于液泡膜中，對K+有高度的選擇性，在鹽脅迫、高滲透壓脅迫下，該基因的部分異構體表達量顯著提高［23］。NtTPK2是從普通煙草紅花大金元品種中克隆得到的，在煙草根、莖、葉、花中均有表達［24］。

鉀轉運體主要分為KUP/HAK/KT、HKT和CPA這3個家族。KUP/HAK/KT家族最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，在植物中的研究較晚，此類鉀轉運體廣泛存在于擬南芥、水稻、玉米等植物體內(nèi)［25-28］。2009年Guo等從黃花煙草中克隆得到了煙草中的首個鉀轉運基因——NrHAK1，其與煙草根部的鉀吸收過程相關［29］。魯黎明等在普通煙草中克隆得到基因NtHAK1，其在煙草K326品種中過表達后，煙株的富鉀能力顯著提高［30-31］。除此之外，還有主要在葉、莖、花中表達的煙草NtPOT10基因及在林煙草盛花期各組織中表達的HAK11基因等，各基因均在煙草的脅迫響應機制中扮演著重要角色［32-33］。HKT家族主要參與控制K+/Na+的選擇性運輸和K+的吸收，陸玉建等將AtHKT1啟動子導入到本生煙草細胞中，其β-D-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）染色結果顯示，本生煙草的葉片、根部及維管系統(tǒng)染色較深，表明這些區(qū)域AtHKT1表達量可能較高，有利于提高植物的耐鹽性［34］。

目前已有研究證實，水肥一體化技術可以促進煙株對鉀離子的吸收［35］。本研究在水肥一體化技術的基礎上設計追施不同鉀肥的處理，研究不同鉀肥對烤煙葉片鉀吸收規(guī)律及鉀通道基因表達量的影響，擬篩選出對烤煙提鉀效果最佳的鉀肥品種，以提高烤煙葉片鉀含量，提升煙葉品質(zhì)，并將其應用在大田生產(chǎn)上，指導大田生產(chǎn)活動。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2022年在云南省大理白族自治州祥云縣開展，土壤類型為黃褐土，土壤pH值為6.80，堿解氮含量為51.45 mg/kg，速效磷含量為9.67 mg/kg，速效鉀含量為92.00 mg/kg，氯含量為66.03 mg/kg，有機質(zhì)含量為11.35 g/kg。

1.2 試驗設計

選用當?shù)刂髟云贩N云煙99作為供試材料。各處理均在移栽前1周每666.67 m2施入29 kg復合肥，復合肥選用當?shù)責煵輰Ｓ梅剩琋、P2O5、K2O的施用比例為12 ∶10 ∶25，采用水肥一體化技術追肥和灌水。根據(jù)鉀肥品種不同，試驗共設置4個處理，其中CK追施當?shù)爻Ｓ免浄势贩N硫酸鉀，T1處理追施磷酸二氫鉀，T2處理追施焦磷酸鉀，T3處理追施黃腐酸鉀。追肥時，為了保證各處理在整個生育期施入的N、P、K總量相同，在移栽后30、45 d，T1、T2、T3處理使用自制液體專用肥。每666.67 m2的具體追肥方案見表1。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 烤煙生育期葉片鉀含量的測定 在烤煙移栽后30、45、60、75、90 d，隨機選取各處理烤煙各3株，分別取上、中、下3個葉位的新鮮葉片3張，每次采樣時，每株采摘相同葉位的鮮葉片，鮮葉片在105 ℃殺青30 min后轉于60 ℃烘干至恒重，研磨后過0.25 mm（60目）篩網(wǎng)，用質(zhì)量分數(shù)4%的鹽酸浸提-火焰光度計法測定鉀含量［36］。

1.3.2 烤煙葉片鉀積累量及積累速率的測定 分別計算在烤煙移栽后30～45、45～60、60～75、75～90 d烤煙葉片鉀的積累量及積累速率，其中，鉀離子積累量=相鄰2次取樣時間間隔鉀離子含量之差，鉀離子積累速率=鉀離子積累量/相鄰2次取樣時間間隔。

1.3.3 鉀通道基因相對表達量的測定 在煙葉移栽后50、65、90 d，各個處理選取具有代表性的煙株３株，每株選取自下而上第3、10、15葉位的3 g葉片并混合，在-80 ℃超低溫條件下保存，用熒光定量PCR法測定鉀通道基因的相對表達量。

1.3.4 烤后煙常規(guī)化學成分的測定 分別選取各處理上、中部葉烤后樣1 kg，用近紅外法檢測葉片的常規(guī)化學成分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)用Excel 2013、SPSS 26.0進行處理分析，繪圖用Excel 2013。

2 結果與分析

2.1 追施不同鉀肥對烤煙生育期葉片鉀含量的影響

由圖1可知，在烤煙移栽后45 d，T3處理葉片鉀含量顯著低于CK處理；施入鉀肥后，在烤煙移栽后的60、75 d，各處理葉片鉀含量無顯著差異；在烤煙移栽后的90 d，T1、T3處理烤煙葉片鉀含量顯著高于CK處理；與移栽后30 d相比，在烤煙移栽后90 d，各處理烤煙葉片鉀含量分別降低了60.19%、52.75%、56.31%和48.54%，其中T1、T3處理葉片鉀的損失量顯著低于CK處理。上述結果表明，追施磷酸二氫鉀、黃腐酸鉀顯著降低了烤煙葉片鉀的損失量。

2.2 追施不同鉀肥對烤煙生育期葉片鉀積累量及積累速率的影響

由圖2可知，葉片鉀積累速率的變化規(guī)律與葉片鉀積累量的變化規(guī)律一致。在烤煙移栽后 45～60 d，各處理烤煙葉片中鉀的積累量及積累速率均達到最低值，在這一時期各處理烤煙葉片中鉀的積累量及積累速率表現(xiàn)為T3>T2>CK>T1；T1、T3處理烤煙葉片中鉀的積累量及積累速率在烤煙移栽后75～90 d達到高峰，CK、T2處理烤煙葉片中鉀的積累量及積累速率在烤煙移栽后60～75 d達到高峰。因此可見，追施黃腐酸鉀可能促進了烤煙移栽后45～60、75～90 d葉片中鉀的積累量及積累速率的提高，從而促進了烤煙葉片對鉀離子的吸收。

2.3 追施不同鉀肥對烤煙葉片鉀通道基因表達量的影響

追施不同鉀肥對烤煙葉片鉀通道基因表達量的影響見圖3至圖6。NtHAK基因是KUP/HAK/KT

家族中調(diào)節(jié)鉀素吸收的鉀離子轉運蛋白基因。由圖3可知，在烤煙移栽后的65 d，T1、T2、T3處理NtHAK基因的相對表達量顯著高于CK處理，分別為CK處理的4.27、2.25、3.77倍，表明在水肥一體化技術下，追施不同鉀肥均促進了烤煙移栽后65 d NtHAK基因的表達，其中磷酸二氫鉀、黃腐酸鉀的效果顯著優(yōu)于焦磷酸鉀。

CPKs基因在植物中廣泛存在，已有研究證實，CPKs家族的NtCPK4、NtCPK5基因為鈣依賴型的蛋白激酶基因［37］。由圖4可知，在烤煙移栽后50 d，T1、T2、T3處理的NtCPK基因相對表達量顯著低于CK處理，但在烤煙移栽后65、90 d，T1、T2處理葉片NtCPK基因相對表達量顯著高于CK處理，在移栽后65 d分別為CK處理的1.92、1.73倍，在移栽后90 d分別為CK處理的2.15、1.77倍。這表明水肥一體化技術下追施不同鉀肥均促進了烤煙移栽后65、90 d NtCPK基因的表達。

NHX常作為抗鹽方面的基因被研究，但相關研究發(fā)現(xiàn)，該基因也可以促進植物大量吸收、積累鉀離子［38］。由圖5可知，在烤煙移栽后50 d，T1處理NtNHX2基因的相對表達量顯著高于CK處理，為CK處理的1.69倍；在烤煙移栽后65 d， T1、 T3處理NtNHX2基因的相對表達量顯著高于CK處理，

分別為CK處理的1.67、3.46倍。上述結果表明，在水肥一體化技術下追施的磷酸二氫鉀、黃腐酸鉀誘導了烤煙移栽后65 d葉片中NtNHX2基因的表達，對烤煙葉片中鉀的積累產(chǎn)生有利影響。

NtKC1基因是Shaker家族的一種內(nèi)向整流型鉀離子通道基因。由圖6可知，在烤煙移栽后的 50 d，T1、T2處理烤煙中NtKC1基因的相對表達量顯著高于CK處理，分別為CK處理的5.15、3.09倍；在烤煙移栽后的65 d，T3處理烤煙中NtKC1基因的相對表達量為CK處理的2.56倍，顯著高于CK處理；在烤煙移栽后的90 d，T2、T3處理烤煙中NtKC1基因的相對表達量顯著高于CK處理，分別為CK處理的7.98、2.15倍。上述結果表明，在水肥

一體化技術下追施黃腐酸鉀促進了烤煙移栽后65、90 d NtKC1基因的表達，追施焦磷酸鉀促進了烤煙移栽后90 d NtKC1基因的表達，對烤煙葉片鉀的積累產(chǎn)生有利影響。

2.4 追施不同鉀肥對烤后煙常規(guī)化學成分的影響

由表2可知，追施不同鉀肥后，各處理烤煙各葉位的化學成分含量均表現(xiàn)為總植物堿含量偏低、兩糖含量適宜、 總氮含量為最適范圍。在T1、T3處理下，上部烤煙葉片中的鉀含量分別較CK高6.00%、10.00%，T1、T2、T3處理烤煙中部葉的鉀含量分別較CK高25.49%、20.59%、33.33%；T2處理烤煙上部葉的氯含量較CK低20.00%，T2、T3處理烤煙中部葉的氯含量分別較CK低21.43%、35.71%；T2處理烤煙上部葉的鉀氯比較CK高25.00%，T1、T2、T3處理烤煙中部葉鉀氯比分別較CK高3.29%、53.50%、107.41%。除T2處理上部葉外，與CK處理相比，追施不同鉀肥均提高了烤后煙上、中部葉的鉀含量，效果表現(xiàn)為黃腐酸鉀>磷酸二氫鉀>焦磷酸鉀，追施不同鉀肥均提高了烤后煙中部葉的鉀氯比，效果表現(xiàn)為黃腐酸鉀>焦磷酸鉀>磷酸二氫鉀。

3 討論與結論

鉀離子是煙草生長及品質(zhì)形成的關鍵物質(zhì)。本研究在水肥一體化技術下追施不同鉀肥，研究烤煙生育期葉片鉀離子的變化規(guī)律，鉀離子的積累規(guī)律以及鉀通道基因相對表達量的變化規(guī)律，并檢測了烤后煙的常規(guī)化學成分。研究結果表明，追施磷酸二氫鉀和黃腐酸鉀可以顯著降低烤煙生長發(fā)育期間葉片鉀的損失量，與移栽后30 d相比，在烤煙移栽后90 d，CK、T1、T2和T3處理葉片鉀含量分別降低了60.19%、52.75%、56.31%和48.54%，降低幅度表現(xiàn)為CK>T2>T1>T3；在烤煙移栽后45～60 d，各處理葉片鉀的積累量及積累速率均達到最低峰，在這一時期T3處理鉀積累量及積累速率明顯高于其他處理，在烤煙移栽75 d后，CK、T2處理葉片鉀積累量及積累速率開始下降，但T1、T3處理仍保持上升趨勢，且T3處理升高更為明顯，追施黃腐酸鉀可能提高了烤煙移栽后45～60、75～90 d葉片鉀的積累量及積累速率。

對鉀通道基因表達量的研究結果顯示，追施不同鉀肥在烤煙移栽后的50、65、90 d均對烤煙葉片鉀通道基因表達量產(chǎn)生了不同程度的影響，其中T1處理在烤煙移栽后50 d NtNHX2基因和NtKC1基因相對表達量分別為CK處理的1.69、5.15倍，在烤煙移栽后65 d，NtHAK、NtCPK、NtNHX2基因相對表達量分別為CK處理的4.27、1.92、1.67倍，在移栽后90 d，NtCPK基因相對表達量為CK處理的2.15倍；T2處理在烤煙移栽后50 d，NtKC1基因相對表達量為CK處理的3.09倍，在烤煙移栽后65 d，NtHAK、NtCPK基因相對表達量分別為CK處理的2.25、1.73倍，在烤煙移栽后90 d NtCPK、NtKC1基因相對表達量分別為CK處理的1.77、7.98倍；T3處理在烤煙移栽后65 d NtHAK、NtNHX2和NtKC1基因相對表達量分別為CK處理的3.77、3.46、2.56倍，在烤煙移栽后90 d NtKC1基因相對表達量為CK處理的2.15倍。其中NtHAK、NtNHX2基因主要在移栽后65 d起作用，NtCPK基因主要在移栽后65、90 d起作用，NtKC1基因主要在移栽后50、90 d起作用。

對烤后煙常規(guī)化學成分的研究結果顯示，除T2處理上部葉外，與CK處理相比，追施不同鉀肥均提高了烤后煙上、中部葉的鉀含量，其中追施黃腐酸鉀提鉀效果最佳，烤后煙上、中部葉的鉀含量分別較CK處理提高了10.00%、33.33%，追施不同鉀肥均提高了烤后煙中部葉的鉀氯比，其中T3處理烤后煙中部葉鉀氯比較CK處理提高了107.41%。

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