陳竹芳 杜冀暉

基金項(xiàng)目：2022年深圳市南山區(qū)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：NS2022001）

作者簡介：陳竹芳（1994.1-），女，湖北黃石人，碩士，住院醫(yī)師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)分子診斷方向的研究

通訊作者：杜冀暉（1970.12-），女，廣東三水人，博士，主任技師，主要從事結(jié)直腸癌的分子診斷標(biāo)志物相關(guān)研究

摘要：結(jié)直腸癌（CRC）是世界上高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤之一，迫切需要尋找特征性的診斷標(biāo)志物并進(jìn)行早期干預(yù)、治療。已有研究表明腸道微生物菌群與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過對腸道菌群的宏基因組或16S rRNA的測序分析，鑒定出CRC相關(guān)的腸道特征性菌群，其豐度、組成的變化有望作為潛在的CRC診斷標(biāo)志物。本文就結(jié)直腸癌的腸道菌群變化特征、檢測方法及其作為生物標(biāo)志物在CRC診斷、進(jìn)展分期、治療及預(yù)后中的作用進(jìn)行綜述，以期為CRC的臨床診治提供新思路。

關(guān)鍵詞：腸道菌群；結(jié)直腸癌；生物標(biāo)志物

中圖分類號：R735.3+7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.09.035

文章編號：1006-1959（2024）09-0168-05

Research Status of Intestinal Characteristic Microbial Flora in the Diagnosis

and Treatment of Colorectal Cancer

CHEN Zhu-fang1，2，DU Ji-hui2

（1.The First School of Clinical Medicine，Guangdong Medical University，Dongguan 523808，Guangdong，China;

2.Research Center for Clinical and Translational Medicine，Huazhong University of Science and Technology Union Shenzhen Hospital，Shenzhen 518052，Guangdong，China）

Abstract：Colorectal cancer （CRC） is one of the malignant tumors with high morbidity and mortality in the world. It is urgent to find characteristic diagnostic markers and carry out early intervention and treatment. Previous studies have shown that intestinal microflora is closely related to the occurrence and development of CRC. Through the sequencing analysis of the metagenome or 16S rRNA of intestinal microflora， CRC-related intestinal characteristic microflora is identified， and its abundance and composition changes are expected to be used as potential CRC diagnostic markers. This article reviews the characteristics of intestinal flora changes in colorectal cancer， detection methods and their role as biomarkers in the diagnosis， progression， staging， treatment and prognosis of CRC， in order to provide new ideas for the clinical diagnosis and treatment of CRC.

Key words：Intestinal flora;Colorectal cancer;Biomarkers

結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）是全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居第3位，死亡率位居第2位[1]。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)[2]，在全球范圍內(nèi)，2020年有超過190萬CRC新發(fā)病例和93萬死亡病例，預(yù)計(jì)到2040年，將增加至320萬和160萬，迫切需要有效的預(yù)防和治療措施。由于CRC起病隱匿、早期癥狀不典型且惡性程度高，患者確診時往往已處于中晚期，預(yù)后較差。因此，尋找CRC的特異性診斷標(biāo)志物，并建立一種能對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷、疾病分期和療效評估的方法顯得尤為重要。近年來研究提示[3-5]，CRC的發(fā)生發(fā)展可能與遺傳相關(guān)，腸道菌群的變化在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中亦具有重要作用。本文將重點(diǎn)討論CRC的腸道菌群變化特點(diǎn)、腸道特征菌群的檢測方法及其在CRC診治中的臨床研究進(jìn)展，以期為CRC的早期診斷、治療以及預(yù)后評估提供新的視角。

1 CRC腸道菌群特征

隨著二代測序技術(shù)的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物和人的免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)存在緊密聯(lián)系。腸道微生物又被稱作人的“第二器官”，與人的健康息息相關(guān)。腸道微生物群是一組由1014細(xì)菌、真核生物和病毒組成的腸道菌群，在許多生理過程中起著至關(guān)重要的作用，特別是在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要作用[6]。有研究表明[7]，腸道菌群微生態(tài)失衡時，腸道內(nèi)致病菌占優(yōu)勢并且發(fā)生代謝特征變化，釋放的毒素結(jié)合細(xì)胞表面受體繼而影響子細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可作用于基因易感性宿主，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，激活炎癥反應(yīng)。CRC的發(fā)生是上皮基因突變、黏膜屏障、腸道菌群和炎癥的綜合作用[8]。腸道微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)改變以及腸道菌群豐度變化均可引起腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)后，腸內(nèi)益生菌群如雙岐桿菌、乳桿菌、擬桿菌等減少，致病菌群如產(chǎn)腸毒素脆弱類桿菌、大腸桿菌、艱難梭菌等數(shù)量增加。致病菌分泌大量毒性因子損傷腸上皮細(xì)胞，引發(fā)慢性炎性反應(yīng)，促進(jìn)CRC的發(fā)生[9，10]。Gueimonde M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，CRC患者的腸道菌群具有顯著差異，CRC患者有更多的腸球菌、鏈球菌、埃希氏桿菌、克雷伯氏桿菌等，同時羅氏菌和一些產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌則顯著減少。另有研究發(fā)現(xiàn)[12，13]，CRC腸道內(nèi)富含脆弱擬桿菌、具核梭桿菌等7種細(xì)菌，而微桿菌和芽孢桿菌則顯著減少，提示這些細(xì)菌微生物可能成為CRC的潛在診斷性細(xì)菌標(biāo)志物。因此，CRC患者腸道菌群的組成和數(shù)量與正常人存在差異，表現(xiàn)為腸道菌群的多樣性降低、有益菌數(shù)量減少、致病菌數(shù)量增加等。

2腸道菌群檢測分析方法

2.1培養(yǎng)法? 培養(yǎng)法是通過對糞便中的腸道微生物進(jìn)行分離和培養(yǎng)后，對菌種進(jìn)行鑒定。這種方法雖然對操作要求低，且靈敏度高。但對于種類繁多、數(shù)量龐大的腸道微生態(tài)系而言，僅可鑒定其中的1%，不能反映腸道微生物的真實(shí)情況，分析的結(jié)果與結(jié)論存在一定局限性[14]。另一方面，培養(yǎng)時間較長，需耗費(fèi)大量的人力，并且大多數(shù)細(xì)菌在體外難以培養(yǎng)或容易被其他雜菌污染，限制了其在微生物分析中的應(yīng)用。

2.2 16S rRNA擴(kuò)增子測序法? 近年來高通量測序的方法應(yīng)用廣泛，擴(kuò)增子測序是對腸道微生物基因組中的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測序，較常用的是16S rRNA。16S rRNA基因存在于所有細(xì)菌的基因組中，它是一個高度保守的基因，常以多基因家族或操縱子的形式存在，是細(xì)菌編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，具有高度的保守性和特異性[15]。16S rRNA基因包括保守區(qū)和可變區(qū)，因此可以在保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行擴(kuò)增；通過對可變區(qū)的序列進(jìn)行分析測序，則可以對不同菌種進(jìn)行區(qū)分。16S rRNA擴(kuò)增子測序技術(shù)成熟，分析相對簡單、成本低廉。但是由于某些物種在可變區(qū)的序列相似，而能夠區(qū)分它們的特異性片段卻不在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，因此測序得到的序列很多注釋不到種水平，限制了其應(yīng)用。

2.3宏基因組測序法? 宏基因組測序是將腸道微生物基因組DNA樣品用物理方法隨機(jī)打斷成小的片段，在DNA分子兩端引入接頭序列及index序列，用PCR擴(kuò)增富集文庫片段后進(jìn)行測序。Relman實(shí)驗(yàn)室和美國基因組研究所于2005年第一次全面開展人類腸道宏基因組學(xué)的研究，完善了人們對腸道微生物群多樣性的認(rèn)識[16]。與16S rRNA擴(kuò)增子分析不同，宏基因組分析還可以用于研究樣本中的真菌和病毒[17]。宏基因組測序的優(yōu)勢在于它可以鑒定微生物至種水平甚至菌株水平，但是其缺點(diǎn)是成本較高，所需時間較長，對于前期樣品處理和文庫構(gòu)建的質(zhì)量要求較高。另外，對于這些高通量測序方法，測序結(jié)果中許多菌種信息并不是研究關(guān)注的重點(diǎn)，大量的測序結(jié)果反而會導(dǎo)致結(jié)果分析變得復(fù)雜和困難。而對于研究中關(guān)注的菌種，有可能因?yàn)樨S度較低而無法通過測序鑒定出來。因此，研發(fā)有關(guān)對腸道微生物菌群組成和豐度變化進(jìn)行有效分析的新檢測技術(shù)方法至關(guān)重要。

3腸道特征性菌群與結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后評估

3.1腸道特征性菌群檢測與CRC的診斷? Thomas AM等[18]對涉及5個國家（中國、法國、奧地利、美國和加拿大）人群隊(duì)列的糞便宏基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)果鑒定出在不同人群間共同的CRC相關(guān)腸道菌群，建立了主要包括具核梭桿菌、微小單胞菌、麻疹孿生球菌、口腔消化鏈球菌、莫雷梭菌、共生梭菌、不解糖卟啉單胞菌、中間普氏菌和脆弱擬桿菌等在內(nèi)的16個菌種的CRC疾病預(yù)測模型，其平均受試者工作特征曲線下面積（area under curve， AUC）為0.84。該研究證實(shí)了不同人群中的CRC菌群特征存在異質(zhì)性，綜合分析多個隊(duì)列獲得的菌群標(biāo)志物，能提高診斷準(zhǔn)確性，這些發(fā)現(xiàn)對于利用腸道菌群標(biāo)志物進(jìn)行疾病診斷、以及研究菌群成員在CRC中的潛在作用均有重要的參考價值。

有研究[19]對不同人群中CRC患者和健康對照的腸道菌群進(jìn)行宏基因組分析，鑒定出了在CRC中富集的7種細(xì)菌，包括脆弱擬桿菌、具核梭桿菌、不解糖卟啉單胞菌、微小單胞菌、中間普氏菌、Alistipes finegoldii和Thermanaerovibrio acidaminovorans，其可作為潛在的診斷標(biāo)志物以區(qū)分CRC與健康個體，具有一定的臨床應(yīng)用前景。L？觟wenmark T等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者糞便樣本中的微小單胞菌水平明顯高于對照組。微小單胞菌檢測CRC的特異性為87.3%，敏感性為60.5%；此外，還發(fā)現(xiàn)將微小單胞菌與其他微生物標(biāo)記物結(jié)合，可以進(jìn)一步提高檢測靈敏度。Liang JQ等[21]研究證實(shí)，來自臘腸種（Lachnoclostridiumsp）的M3基因可用于大腸腺瘤的非侵入性診斷，而且M3聯(lián)合具核梭桿菌、Clostridium hathewayi（Ch）、Bacteroides clarus（Bc）和糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)（FIT）診斷CRC效能最好，特異性為81.2%，敏感性為93.8%。上述研究結(jié)果表明，CRC患者的腸道菌群具有特征性改變，梭桿菌、單胞菌和卟啉單胞菌等菌屬在結(jié)直腸癌中豐度升高，檢測糞便中這些富集的腸道菌特征性菌群，并聯(lián)合糞便FIT檢測，可作為潛在的診斷標(biāo)志物用于CRC的早期診斷、篩查，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

3.2腸道特征菌群豐度變化與CRC的進(jìn)展分期? 劉艷等[22]采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測腸癌患者糞便樣本中具核梭桿菌與clbA+大腸埃希菌DNA相對表達(dá)量，結(jié)果顯示健康對照組、腸癌組clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對表達(dá)量存在差異，診斷腸癌的敏感性分別為64.32%、80.87%，特異性分別為65.52%、68.97%，提示具核梭桿菌與clbA+大腸埃希菌在結(jié)直腸癌患者糞便中顯著富集，可作為CRC潛在的早篩生物標(biāo)志物。

國外有研究結(jié)果表明，侵襲性大腸癌患者中梭形桿菌相對豐度高于早期結(jié)直腸癌患者[23]，具核梭桿菌的相對豐度從黏膜內(nèi)癌到晚期持續(xù)升高[24]。一項(xiàng)對腺瘤的研究[25]并未發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌的數(shù)量明顯增加，但是分化差的腺瘤比分化好的腺瘤具核梭桿菌的數(shù)量卻明顯升高，提示具核梭桿菌檢測具有作為CRC患者診斷和預(yù)后決定因素的潛力，該結(jié)果在后來的兩項(xiàng)研究中也得到驗(yàn)證[26，27]，其中Saito K等[26]用宏基因組分析法分析了81例日本患者的結(jié)腸鏡抽吸物樣本，結(jié)果顯示結(jié)直腸腺瘤、粘膜內(nèi)瘤變患者與健康對照者中梭桿菌屬豐度存在顯著差異，變形梭桿菌（Fusobacterium varium）至少部分參與了結(jié)直腸腺瘤和粘膜內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制。一項(xiàng)比較CRC組織中具核梭桿菌豐度與CRC臨床病理和分子特征的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[28]，Ⅳ期結(jié)直腸癌患者癌組織中具核梭桿菌拷貝數(shù)明顯高于正常黏膜，CRC Ⅳ期患者的正常黏膜中具核梭桿菌拷貝數(shù)比Ⅰ～Ⅲ期患者亦明顯增高。因此，腸道特定菌群豐度的變化可能會幫助醫(yī)師對CRC進(jìn)展及分期進(jìn)行判斷。這些研究結(jié)果提示了糞便中特征性菌群微生物有作為CRC篩查標(biāo)志物的潛在價值，臨床上可以選擇具有“高?！蔽⑸锬Ｊ降幕颊哌M(jìn)行其他進(jìn)一步的結(jié)腸鏡檢查，以明確診斷。

3.3腸道特征性菌群與CRC的治療? 腸道特征性菌群與CRC的治療目前研究較多的是具核梭桿菌與CRC的治療。Chen T等[29]首次研究表明具核梭桿菌可通過Toll樣受體4依賴的方式促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化，表明具核梭桿菌具有免疫抑制作用，可作為具核梭桿菌相關(guān)CRC免疫治療的一個有前景的靶點(diǎn)。有研究顯示[30]，Toll樣受體4拮抗劑TAK-242可抑制具核梭桿菌誘導(dǎo)的腸道腫瘤發(fā)生，提示Toll樣受體4是預(yù)防和治療具核梭桿菌相關(guān)CRC的另一潛在方向。還有研究表明[31，32]，具核梭桿菌具有增強(qiáng)CRC對化療的耐藥性作用，可作為降低晚期CRC患者對5-Fu治療的化學(xué)耐藥性的新靶點(diǎn)。由于具核梭桿菌能加速腫瘤進(jìn)展并實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，故去除具核梭桿菌可能改善CRC的治療效果[33]。有研究證實(shí)[34]，梭桿菌主要與轉(zhuǎn)移病灶中的CRC細(xì)胞相關(guān)，用抗生素甲硝唑治療結(jié)腸癌異種移植小鼠可降低具核梭桿菌負(fù)荷、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和整體腫瘤生長，故抗菌干預(yù)有望成為具核梭桿菌相關(guān)CRC患者的潛在治療方法。

越來越多的證據(jù)表明腸道菌群可調(diào)節(jié)宿主對化療藥物的反應(yīng)，主要有3種臨床結(jié)果：促進(jìn)藥物療效、消除抗癌作用以及調(diào)節(jié)藥物毒性。研究表明[35]，腸道細(xì)菌與化療（5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺、伊立替康、奧沙利鉑、吉西他濱、甲氨蝶呤）和新型靶向免疫療法（如抗pd-l1和抗clta-4療法）的藥理作用密切相關(guān)。另一方面，腸道菌群調(diào)節(jié)是預(yù)防和治療CRC的一種新策略，可通過使用益生菌、益生元、抗生素和糞便微生物移植（FMT）等方法逆轉(zhuǎn)腸道微生物菌群失調(diào)。盡管這些策略可從機(jī)制上糾正微生物群組成，調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腸道屏障功能，防止病原體定植和對腫瘤細(xì)胞施加選擇性細(xì)胞毒性[36]，但值得注意的是這類治療也伴隨著風(fēng)險和爭議，可能會導(dǎo)致臨床并發(fā)癥的發(fā)生。因此，腸道菌群微生物調(diào)節(jié)和干預(yù)在CRC治療中具有重要意義。未來需要進(jìn)一步探究腸道菌群在CRC治療中的作用機(jī)制，研究利用腸道特征性菌群作為生物標(biāo)志物來預(yù)測腫瘤治療效果或不良反應(yīng)的具體價值，針對腸道菌群的治療干預(yù)也將成為CRC個性化治療的一個新領(lǐng)域。

3.4腸道特征性菌群與CRC的預(yù)后? 多項(xiàng)研究提示CRC的預(yù)后也與腸道特征性菌群密切相關(guān)。Yamaoka Y等[28]研究表明，CRC組織中具核梭桿菌的豐度與腫瘤大小和KRAS突變有關(guān)，并與縮短的總生存時間顯著相關(guān)，這種趨勢在Ⅳ期CRC患者中更明顯。根據(jù)具核梭桿菌拷貝數(shù)構(gòu)建Ⅳ期CRC總體生存期預(yù)測模型，靈敏度和特異度分別達(dá)90.9%和88.9%，提示具核梭桿菌的含量可以預(yù)測CRC患者的預(yù)后。Wei Z等[37]研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌、脆弱擬桿菌和普氏糞桿菌可作為CRC的有效預(yù)后生物標(biāo)志物，腸道微生物生態(tài)失調(diào)可能通過上調(diào)腸道炎癥水平使患者的預(yù)后惡化。高豐度的具核梭桿菌是CRC總生存期的負(fù)性預(yù)后因子，具核梭桿菌數(shù)量與CRC的復(fù)發(fā)無關(guān)，但是與轉(zhuǎn)移性CRC的低生存率有關(guān)[38]。有研究顯示[39]，在化療后復(fù)發(fā)的CRC患者的結(jié)直腸癌組織中，具核梭桿菌含量豐富，高豐度的具核梭桿菌與較短的無復(fù)發(fā)生存期（RFS）密切相關(guān)；多因素回歸分析表明具核梭桿菌的數(shù)量是CRC侵襲性的獨(dú)立預(yù)測因子，具有預(yù)測CRC復(fù)發(fā)的潛在價值。Oh HJ等[40]研究結(jié)果顯示，腫瘤內(nèi)具核梭桿菌負(fù)荷是接受奧沙利鉑輔助化療的非微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高/非乙狀結(jié)腸癌/非直腸癌Ⅱ/Ⅲ期CRC亞群的潛在預(yù)后因素。CRC組織中具核梭桿菌DNA的量與較短的生存期有關(guān)，并可能作為預(yù)后生物標(biāo)志物[41]。綜上所述，腸道特征性菌群作為一種新型生物標(biāo)志物，在CRC預(yù)后評估中具有重要的應(yīng)用前景。通過檢測腸道特征性菌群如梭桿菌、擬桿菌等類型和數(shù)量變化，有望成為生物標(biāo)志物與常規(guī)診斷方法結(jié)合使用，為CRC的診斷及預(yù)后預(yù)測提供更加有價值的診治策略。

4總結(jié)

隨著新一代基因測序等基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腸道微生物與結(jié)直腸癌的關(guān)系逐漸被披露，已有相當(dāng)數(shù)量的研究表明，與健康人相比，CRC患者結(jié)直腸組織和糞便中的微生物種類和豐度具有顯著不同，且特定微生物在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療、預(yù)后等方面均存在一定相關(guān)性。微生物群落結(jié)構(gòu)的改變在從炎癥到發(fā)育異常到腺癌的逐步發(fā)展過程中起著推動作用。但腸道菌群引起CRC的確切機(jī)制尚有待作進(jìn)一步深入的研究?；诂F(xiàn)有的研究，不同報道的特異性菌群以及預(yù)測模型的準(zhǔn)確性有差異，這可能與患者特征和研究方法存在異質(zhì)性有關(guān)。盡管如此，腸道細(xì)菌在癌癥診斷及治療中的作用仍值得進(jìn)一步探索。今后仍需開展更多的臨床研究，以達(dá)到模型的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，為CRC檢測、治療和預(yù)防提供新策略。

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收稿日期：2023-03-25；修回日期：2023-04-28

編輯/王萌