【摘要】綠原酸作為一種具備多種生理功能的活性物質(zhì)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。高效液相色譜法因分離能力強、靈敏度高、分析速度快、結(jié)果精確以及應(yīng)用廣泛等優(yōu)點而備受青睞，成為綠原酸檢測中最為常用的檢測方法。本文闡述了高效液相色譜法測定混合型飼料添加劑中綠原酸含量的優(yōu)勢及注意事項，旨在為檢測混合型飼料添加劑中的綠原酸含量提供一些新思路。

【關(guān)鍵詞】綠原酸；高效液相色譜法；混合型飼料添加劑

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.002

Determination of Chlorogenic Acid in Mixed Feed Additives by HPLC and Its Influencing Factors

YANG Huijie

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre〔Liaoning Lnstitute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： Chlorogenic acid， as an active substance with various physiological functions， has been more and more widely used in animal husbandry. High performance liquid chromatography （HPLC） is favored for its excellent separation ability， high sensitivity， rapid analysis speed， accurate results and a wide range of applications， and is most commonly used in chlorogenic acid detection. In this paper， the advantages and precautions of determination of chlorogenic acid in mixed feed additives by high performance liquid chromatography （HPLC） were described， in order to provide some new ideas for the determination of chlorogenic acid in mixed feed additives.

Keywords： chlorogenic acid； HPLC； mixed feed additives

綠原酸（Chlorogenic acid，CA）是由咖啡酸（Caffeic acid）與奎尼酸（Quinicacid，1-羥基六氫沒食子酸）生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[1]。綠原酸類物質(zhì)來源廣泛，具有重要的生物活性作用，如抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等[2]。作為一種潛在的增強動物自身免疫力的飼料添加劑，綠原酸能夠緩解動物腸道氧化應(yīng)激和炎癥，維持腸道穩(wěn)態(tài)和免疫機能，保障動物腸道健康[3]。綠原酸不僅可有效提高動物生產(chǎn)性能，具有抗炎、抗氧化、提升機體免疫能力的優(yōu)點[4-6]，還能作為替代飼用抗生素類的飼料添加劑，確保畜禽肉質(zhì)安全優(yōu)質(zhì)，顯著增強畜禽的抗病力。因此，在畜牧行業(yè)中綠原酸擁有廣闊的應(yīng)用前景。

1綠原酸的理化性質(zhì)

綠原酸半水合物為白色或微黃色的針狀結(jié)晶，其在110℃時會失去結(jié)晶水變?yōu)闊o水物，熔點為208℃。在25℃的條件下，綠原酸在水中的溶解度大約為4%。它易溶于如乙醇、丙酮和甲醇等極性溶劑，而在乙酸乙酯中的溶解度較小。同時，綠原酸難以溶解在三氯甲烷、乙醚和苯等親脂性的有機溶劑中[7]。在結(jié)構(gòu)上，綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸結(jié)合形成的酯，其分子中包含酯鍵、不飽和雙鍵以及多元酚這三個化學(xué)性質(zhì)較為活躍的部分。因此，在從植物中提取綠原酸時，常常會因為水解和分子內(nèi)酯基的遷移而導(dǎo)致綠原酸異構(gòu)化。由于綠原酸具有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，我們可以利用極性溶劑如乙醇、丙酮、甲醇等從植物中提取綠原酸，但綠原酸并不穩(wěn)定，所以應(yīng)避免在高溫、強光的環(huán)境下進行提取，并且不要長時間加熱。

2高效液相色譜法檢測混合型飼料添加劑中綠原酸的含量

綠原酸的檢測方法很多，例如應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)快速測定甜葉菊中綠原酸含量[8]，應(yīng)用HPLC-MS/MS檢測杜仲中綠原酸含量[9]，基于碳點為探針的熒光檢測方法測定綠原酸含量[10]等。高效液相色譜法因分離效能高、靈敏度高、檢測快速準確、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，在綠原酸檢測中得到廣泛應(yīng)用。

2.1高效液相色譜法檢測混合型飼料添加劑中綠原酸含量概述

目前，針對混合型飼料添加劑中綠原酸含量的檢測尚無國家標(biāo)準。在實際檢測過程中實驗室基本采用企業(yè)提供的標(biāo)準，以高效液相色譜法為主。該方法在不同的企業(yè)標(biāo)準中雖不完全一致，但所采用的設(shè)備、試劑及檢測條件基本一致。

2.1.1試劑和設(shè)備

甲醇（色譜純），磷酸（優(yōu)級純），乙腈（色譜純），綠原酸標(biāo)準品（含量≥95.0%），高效液相色譜儀（配備紫外檢測器或二極管陣列檢測器），超聲波清洗器，分析天平。

2.1.2色譜條件

色譜柱：長度為250 mm、內(nèi)徑為4.6 mm的C18柱或與之相當(dāng)性能的色譜柱；流動相組成為乙腈和0.4%磷酸溶液，比例為15∶85；檢測波長設(shè)定為327 nm。

2.1.3含量測定

1）標(biāo)準品溶液制備

精密稱取10 mg的綠原酸標(biāo)準品，將稱取的標(biāo)準品放入一個10 mL的棕色量瓶中，然后加入50%的甲醇溶液，使其溶解，并確保準確定容，然后將量瓶中的溶液混合均勻，這樣就得到了標(biāo)準品儲備液。再從標(biāo)準品儲備液中準確量取5 mL的溶液，并將其轉(zhuǎn)移到一個50 mL的棕色容量瓶中，再次使用50%的甲醇溶液，將容量瓶中的溶液稀釋至刻度線，并混合均勻，這樣就得到了用于上機分析的標(biāo)準品上機液。

2）試樣溶液制備

稱取適量混合型飼料添加劑（約相當(dāng)于綠原酸2 mg），放入一個100 mL的棕色量瓶中，加入50%的甲醇溶液，并通過振搖使其充分溶解。待溶解完全后，使用50%的甲醇溶液將容量瓶中的溶液定容至刻線，然后將定容后的樣品充分搖勻，以確其?；旌暇鶆?。最后，通過0.45μm的有機濾膜進行過濾灌瓶，即得試樣溶液。

3）上機測定

分別將上述標(biāo)準品上機液和試樣溶液注入高效液相色譜儀進行測定。

4）結(jié)果計算

2.2高效液相色譜法測定混合型飼料添加劑中綠原酸含量的優(yōu)勢

2.2.1高效液相色譜法的自身優(yōu)勢

高效液相色譜法具有分離效果好、檢測靈敏度高、分析速度快、定量準確、選擇性好、自動化程度高和適用范圍廣等優(yōu)勢。好的分離效果可以有效地將綠原酸與其他化合物進行分離，避免干擾物質(zhì)的影響，提高檢測結(jié)果的準確性和可靠性；高靈敏度可以滿足各種不同類型樣品的分析需求；相比傳統(tǒng)的檢測方法，高效液相色譜法的分析速度更快，可以在短時間內(nèi)完成大量樣品檢測，提高工作效率；高效液相色譜法可以提供準確的定量結(jié)果，通過對比標(biāo)準品和樣品的峰面積，可以確定樣品中綠原酸的含量，這對混合型飼料添加劑中綠原酸的質(zhì)量控制非常重要；好的選擇性可以有效避免干擾物質(zhì)的影響，從而更準確地測定綠原酸含量。

2.2.2試劑設(shè)備簡單

高效液相色譜法檢測綠原酸，常用的試劑主要包括甲醇（色譜純）、磷酸（優(yōu)級純）、乙腈（色譜純）、綠原酸標(biāo)準品（含量≥95.0%）等，這些試劑在高效液相色譜分析中比較常用，相對容易獲取。因此，從試劑的角度來看，高效液相色譜法檢測綠原酸所用的試劑相對簡單。而該方法所用設(shè)備有高效液相色譜儀（配備紫外檢測器或二極管陣列檢測器）、超聲波清洗器、分析天平，這些設(shè)備均為實驗室常規(guī)檢測設(shè)備，操作相對簡單。

2.2.3前處理方法簡單

應(yīng)用高效液相色譜法測定混合型飼料添加劑中綠原酸含量的前處理方法操作簡便，只需通過甲醇提取，確保充分溶解、定容準確即可。全程操作簡便快捷，無需凈化、衍生化等復(fù)雜的前處理過程。另外，此方法因操作步驟少也減少了處理過程中綠原酸的損失。

3高效液相色譜法測定混合型飼料添加劑中綠原酸含量時的注意事項

盡管高效液相色譜法測定混合型飼料添加劑中綠原酸含量簡便、易行，但忽視操作細節(jié)容易導(dǎo)致測定含量偏低、色譜峰型差、峰前延、峰拖尾甚至不出峰等情況發(fā)生。為了更好地應(yīng)用液相色譜法開展混合型飼料添加劑中綠原酸的檢測，我們總結(jié)了以下注意事項。

3.1樣品的稱量

在檢測樣品過程中，稱量樣品時要注意以下幾點：一是精確度。稱量樣品時需要保證稱量的精確度，以避免因稱量誤差導(dǎo)致實驗結(jié)果不準確。二是避免污染。需要確保樣品不被污染，這包括避免樣品受到外界物質(zhì)的干擾，如灰塵、雜質(zhì)等，同時也需要確保稱量器具的清潔和衛(wèi)生。三是稱量設(shè)備合格。一定使用檢定合格的天平，且天平放置環(huán)境的溫濕度等要符合相關(guān)規(guī)定。四是樣品均勻性。稱量前一定要充分混勻，且至少稱量兩組平行樣品。

3.2色譜柱的選擇

在色譜分析中色譜柱的選擇是非常重要的。選擇適合的色譜柱需要考慮多個因素，如分離度、柱效、穩(wěn)定性、兼容性和價格等。測定綠原酸推薦使用耐酸范圍寬的C18色譜柱。一方面，該類型色譜柱穩(wěn)定性好、分離度高、柱效高；另一方面，該實驗中采用的流動相含有磷酸溶液，pH值在1.8左右。色譜柱選擇不當(dāng)不僅影響檢測結(jié)果，還會損壞色譜柱的填料，縮短色譜柱使用壽命。

3.3避光操作

綠原酸含有鄰二酚羥基。這個結(jié)構(gòu)使得綠原酸在受熱、遇強光時容易發(fā)生氧化反應(yīng)，影響檢測結(jié)果的準確性，因此該實驗需要在避光條件下進行。具體措施為：一是使用遮光窗簾或黑布遮蓋實驗臺或整個實驗室，以阻擋外界光源的照射；二是在實驗室內(nèi)使用黑色塑料袋或黑布，將需要避光的容量瓶等容器包裹起來，以避免受到光線的影響。

3.4預(yù)防交叉污染

同一臺液相色譜儀，同一個色譜柱，如果既做綠原酸檢測又做其他樣品的檢測，需要格外注意每次實驗結(jié)束后的沖洗程序，建議低流速過夜清洗色譜柱，確保整個系統(tǒng)清潔完全后再進行下一次的實驗。

3.5質(zhì)控管理

在實驗過程中很多因素會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，如儀器狀態(tài)、試劑質(zhì)量、實驗人員的操作等。為了確保檢測的準確性、穩(wěn)定性和可靠性，每次檢測時，實驗人員可通過加標(biāo)回收或質(zhì)控樣的方式來確保實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，一旦實驗過程中出現(xiàn)問題則立即進行調(diào)整，以保證檢測結(jié)果的準確性。

4結(jié)束語

綠原酸作為一種天然植物提取物，具有環(huán)保、可持續(xù)等特點。在畜牧業(yè)中應(yīng)用綠原酸，可有效減少對環(huán)境的污染和對資源的浪費，從而促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了更加充分地發(fā)揮綠原酸的作用和優(yōu)勢，應(yīng)進一步加強研究和實踐，不斷探索更好的檢測方法、質(zhì)量控制方案及其在畜牧業(yè)中的最佳應(yīng)用方式等，以滿足畜牧業(yè)發(fā)展的多樣化需求。

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【作者簡介】

楊慧杰，女，1986年出生，高級畜牧師，碩士，研究方向為飼料、畜產(chǎn)品檢驗檢測及相關(guān)標(biāo)準制修訂。

（編輯：李鈺雙）