唐偉杰 陳海元 張所兵 唐駿 林靜 方先文 張?jiān)戚x

摘要： ?水稻氮素利用效率的高低直接影響水稻產(chǎn)量以及生態(tài)環(huán)境。在水稻氮素利用相關(guān)基因的研究中，研究人員通過連鎖作圖和關(guān)聯(lián)作圖等方法克隆基因，并解析水稻的氮素利用機(jī)理，為水稻氮素高效利用育種提供了基因資源。本文從水稻氮素利用QTL定位及基因克隆，基于全基因組關(guān)聯(lián)分析的水稻氮素利用相關(guān)基因克隆，利用突變體克隆水稻氮素利用相關(guān)基因，利用反向遺傳學(xué)克隆水稻氮素利用相關(guān)基因等方面總結(jié)了近年水稻氮素利用相關(guān)基因的研究進(jìn)展。同時(shí)對(duì)該領(lǐng)域的未來(lái)研究進(jìn)行了展望。本文為水稻氮素高效利用基因的研究和氮素高效利用育種提供了參考。

關(guān)鍵詞： ?水稻; 氮素利用效率; 基因變異

中圖分類號(hào)： ?S511 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ???文章編號(hào)： ?1000-4440（2024）03-0570-07

Progress in genetic research on genes related to nitrogen utilization in rice

TANG Wei-jie1， CHEN Hai-yuan1， ZHANG Suo-bing1， TANG Jun1， LIN Jing1， FANG Xian-wen1， ZHANG Yun-hui1，2

（1.Provincial Key Laboratory of Agrobiology， Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China; 2.Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops， Yangzhou 225009， China）

Abstract： ?Nitrogen use efficiency （Nue） of rice directly affects rice yield and ecological environment. In the research of rice nitrogen use-related genes， researchers cloned the genes by means of linkage mapping and association mapping， and analyzed the mechanism of rice nitrogen utilization， which provided genetic resources for rice nitrogen efficient utilization breeding. This article summarized the research progress of rice nitrogen utilization related genes in recent years， including QTL mapping and gene cloning of rice nitrogen utilization， cloning of rice nitrogen utilization related genes based on whole genome association analysis， cloning of rice nitrogen utilization related genes using mutants， and cloning of rice nitrogen utilization related genes using reverse genetics. At the same time， the future research in this field was prospected. This paper provides a reference for the research of nitrogen efficient utilization genes and nitrogen efficient utilization breeding in rice.

Key words： ?rice; nitrogen utilization efficiency; gene variations

水稻作為全球最重要的糧食作物之一，為保障世界糧食安全和滿足日益增長(zhǎng)的人口對(duì)糧食的需求起到了至關(guān)重要的作用[1]。氮肥是水稻種植過程中用量最大的肥料，對(duì)水稻產(chǎn)量的提高至關(guān)重要。然而，隨著農(nóng)田氮肥的過度施用，氮肥對(duì)環(huán)境的污染問題日益嚴(yán)重[2-3]，提高水稻氮素利用效率（Nitrogen use efficiency，NUE）已成為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)的重要途徑之一[4-5]。因此，開展水稻的氮營(yíng)養(yǎng)與遺傳交叉研究，發(fā)掘水稻氮素利用相關(guān)基因，鑒定基因的優(yōu)異單倍型，對(duì)于提升糧食產(chǎn)量和保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

水稻氮素利用包括氮吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化和再利用等過程，涉及到多個(gè)基因、多個(gè)途徑的參與和調(diào)控[6]。氮肥在土壤中以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮形式存在，水稻根系通過NO-3轉(zhuǎn)運(yùn)子和NH+4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等調(diào)控硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，通過硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶實(shí)現(xiàn)氮同化[7-12]。在植株地上部分，氮素的運(yùn)輸和分配受到氮素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的調(diào)控[7，13]。此外，水稻對(duì)氮素的同化和再利用還受到天冬氨酸合成酶和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[6，14]。這些氮素利用相關(guān)基因的克隆、功能分析等揭示了水稻氮素利用的調(diào)控機(jī)制，為培育氮高效利用水稻品種，提高水稻氮肥利用效率提供了科學(xué)依據(jù)和基因資源。

QTL（數(shù)量性狀基因座）定位是基因克隆、功能驗(yàn)證的重要技術(shù)手段，且推動(dòng)了品種的改良[15-16]。同時(shí)，基因組學(xué)和高密度遺傳圖譜等高通量技術(shù)也為基因遺傳研究提供了新的思路和方法[17-18]。在水稻氮素高效利用的研究中，通過研究氮素利用相關(guān)基因在不同品種中的變異情況，篩選出能夠高效利用氮素的優(yōu)異單倍型，為水稻育種提供種質(zhì)和基因資源。

綜上所述，本文從水稻氮素利用QTL定位及基因克隆，基于全基因組關(guān)聯(lián)分析的水稻氮素利用相關(guān)基因克隆，利用突變體克隆水稻氮素利用相關(guān)基因，利用反向遺傳學(xué)克隆水稻氮素利用基因等方面總結(jié)近年水稻氮素利用相關(guān)基因的研究進(jìn)展，討論了該領(lǐng)域存在的問題并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望，以期為人們快速深入了解水稻氮素利用相關(guān)研究，對(duì)于推動(dòng)水稻氮素高效利用育種有積極作用。

1 水稻氮素利用QTL定位及基因克隆

水稻種植歷史悠久，分布廣泛，形成了多種多樣的遺傳資源，具有豐富的遺傳多樣性[19]。Zhang等[20]利用秈稻資源特青與普通野生稻（Oryza rufipogon）雜交后代群體，通過調(diào)查0.24 mmol/L硝酸銨和1.44 mmol/L硝酸銨處理21 d的水稻植株相對(duì)干質(zhì)量，進(jìn)行QTL檢測(cè)，克隆到 ?TOND1 ?基因，該基因優(yōu)勢(shì)單倍型主要在秈稻品種中存在。通過基因內(nèi)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該基因和啟動(dòng)子上的5個(gè)SNP（單核苷酸多態(tài)性）可能是導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)單倍型的原因，在減氮條件下，該基因過表達(dá)后可有效提高水稻產(chǎn)量。

Yang等[21]以廣西普通野生稻Y11和秈型恢復(fù)系GH998雜交構(gòu)建后代群體，測(cè)定不同施氮處理的水稻體內(nèi)氮濃度，以氮素利用效率作為定位指標(biāo)，采用QTL-seq技術(shù)定位到1個(gè)位于6號(hào)染色體的影響氮素利用效率的QTL位點(diǎn)，進(jìn)一步精細(xì)定位得到 ?OsNPF3.1 ?，功能分析發(fā)現(xiàn)該基因影響株高、抽穗期和千粒質(zhì)量。在OsNPF3.1蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在1個(gè)氨基酸變異，由蘇氨酸變?yōu)楸彼幔瑢?dǎo)致了野生稻和栽培稻不同的氮素利用效率表型。進(jìn)一步分析栽培稻中的變異，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)自然變異位點(diǎn) ?OsNPF3.1 ?Chr6_8741040和 ?OsNPF3.1 ?Chr6_8742153與氮素利用效率相關(guān)，且 ?OsNPF3.1 ?Chr6_8742153位點(diǎn)具有明顯的秈粳分化[22]。

水稻中的秈稻和粳稻亞群具有不同的氮素利用效率，因此研究者利用秈稻和粳稻雜交構(gòu)建后代群體，通過調(diào)查與氮素利用效率相關(guān)的性狀，發(fā)掘與氮素利用效率相關(guān)的等位基因，解釋秈粳間的差異，進(jìn)而提高粳稻的氮素利用效率。Sun等[23]利用氮素敏感秈稻品種南京6號(hào)和氮不敏感粳稻品種千重浪2號(hào)雜交構(gòu)建后代群體，調(diào)查不同氮素處理下的株高，采用QTL作圖，發(fā)現(xiàn)1個(gè)氮敏感基因 ?DEP1 ?，已有報(bào)道稱該基因?yàn)?個(gè)控制穗型基因， ?DEP1 ?控制穗型直立， ?dep1 ?為其等位基因[24]，其中 ?dep1 ?缺失了長(zhǎng)度為625 bp的片段，導(dǎo)致翻譯提前終止。在體內(nèi)，DEP1蛋白與Gα（RGA1）和Gβ（RGB1）亞基互作，降低RGA1活性或增強(qiáng)RGB1活性均會(huì)導(dǎo)致植物對(duì)氮不敏感。攜帶 ?dep1-1 ?等位基因的植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期對(duì)氮素不敏感，從而可以提高中等氮肥水平下的水稻產(chǎn)量和收獲指數(shù)。

NO-3是重要的氮素來(lái)源，且具有信號(hào)功能。學(xué)者用氯酸鹽代替NO-3，檢測(cè)不同水稻品種對(duì)硝酸鹽的吸收和同化能力，發(fā)現(xiàn)秈稻和粳稻對(duì)NO-3的吸收存在差異[25]。Hu等[25]利用氯酸鹽敏感秈稻品種IR24和氯酸鹽鈍感粳稻品種日本晴雜交構(gòu)建BC2F5家系，進(jìn)行QTL檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)在秈粳稻間分化的編碼NO-3轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因 ?NRT1.1B ?，該基因編碼的蛋白在氨基酸序列中第327位氨基酸的變異導(dǎo)致秈粳稻間NO-3吸收的差異。秈稻中的變異有效提高NO-3吸收和NO-3響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)入到粳稻中可有效提高粳稻氮素利用效率，從而提高粳稻產(chǎn)量。Guo等[26]同樣利用氯酸鹽抗性不同的秈稻品種9311和粳稻品種日本晴雜交構(gòu)建后代群體，進(jìn)行QTL定位，在2號(hào)染色體上檢測(cè)到與目標(biāo)性狀相關(guān)的位點(diǎn)，經(jīng)過圖位克隆得到基因 ?OsNR2 ?，該基因編碼NAD（P）H-依賴性硝酸還原酶，NAD（P）H-依賴性硝酸還原酶氨基酸序列中第738位精氨酸是決定NO-3還原能力的關(guān)鍵位點(diǎn)，當(dāng)該位點(diǎn)的精氨酸變?yōu)樯彼釙r(shí)，NO-3還原能力下降。進(jìn)一步調(diào)查產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)秈稻9311水稻產(chǎn)量較高，這是由于9311中存在 ?OsNR2 ?基因的優(yōu)勢(shì)單倍型， ?OsNR2 ?基因的不同單倍型導(dǎo)致 ?NRT1.1B ?的不同表達(dá)。且 ?NRT1.1B ?和 ?OsNR2 ?的克隆充分闡明了秈稻中NO-3吸收和同化效率高于粳稻的機(jī)制，為粳稻提高氮素利用效率，特別是NO-3吸收同化提供了優(yōu)異基因資源。

NH+4是水稻主要的氮源，通過遺傳手段了解NH+4吸收相關(guān)基因可有效提高水稻對(duì)氮肥的利用效率。Li等[27]利用銨態(tài)氮吸收速率較高的育種家系NM73，與銨態(tài)氮吸收速率較低的秈稻品種南京6號(hào)（NJ6）雜交構(gòu)建后代群體，通過調(diào)查水稻對(duì)15N標(biāo)記的NH+4吸收速率，檢測(cè)到2個(gè)QTL，經(jīng)過圖位克隆，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因分別是 ?sd1 ?和 ?GRF4 ?。其中 ?GRF4 ???ngr2 ?是一種可以促進(jìn)銨根吸收的單倍型，跟NJ6相比，NM73的單倍型 ?GRF4 ???ngr2 ?在第3個(gè)外顯子上具有2個(gè)SNP（1 187 T→A和1 188 C→A），在啟動(dòng)子上有3個(gè)SNP（-884 T→A，-847 C→T和-801 C→T）。 ?GRF4 ?不僅能調(diào)節(jié)銨根吸收，還能受到氮的調(diào)控。經(jīng)過分子生物學(xué)驗(yàn)證，GRF4蛋白不僅是一個(gè)正向調(diào)控植物碳-氮代謝的因子，可以促進(jìn)植物氮素代謝、光合作用以及生長(zhǎng)發(fā)育，而且GRF4蛋白也參與赤霉素信號(hào)傳遞途徑，能與DELLA蛋白互作。結(jié)果證明，GRF4蛋白與水稻生長(zhǎng)抑制因子DELLA蛋白相互之間的調(diào)節(jié)賦予了植物生長(zhǎng)與碳-氮代謝之間的穩(wěn)態(tài)。

生長(zhǎng)素是植物生長(zhǎng)必需激素，氮素利用效率也受生長(zhǎng)素相關(guān)基因的調(diào)控。Zhang等[28]利用秈稻品種華粳秈74和粳稻品種IRAP9雜交構(gòu)建CSSL（染色體片段置換系）群體，通過調(diào)查15N標(biāo)記的NO-3吸收速率，并進(jìn)行QTL定位，發(fā)現(xiàn) ?qDNR1 ?位點(diǎn)，進(jìn)一步精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)得到1個(gè)參與生長(zhǎng)素合成基因 ?DNR1 ?。該基因存在明顯的秈粳差異，秈稻 ?DNR1 ?基因的啟動(dòng)子-1 728到-1 209位置上缺失長(zhǎng)度為520 bp的片段，該片段的缺失導(dǎo)致了 ?DNR1 ?的表達(dá)量下降，從而促進(jìn)了氮的吸收和同化，在中度氮肥施用情況下，可有效提高水稻產(chǎn)量。 ?DNR1 ?基因通過影響生長(zhǎng)素合成，促進(jìn)ARF基因表達(dá)，調(diào)控氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用RSA（Root system architecture，根系結(jié)構(gòu)）不同和氮敏感性不同的秈稻品種華粳秈74和粳稻品種IRAT261雜交構(gòu)建后代群體，通過圖位克隆得到 ?RNR10 ?基因[29]。該基因編碼的F-box蛋白，可以與DNR1互作，RNR10對(duì)K53殘基進(jìn)行單泛素化修飾，使DNR1更加穩(wěn)定不易降解，從而負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素的積累。同樣，該基因具有顯著的秈粳差異，秈稻中該基因內(nèi)含子存在604 bp長(zhǎng)度的插入片段，啟動(dòng)子上3 496 bp長(zhǎng)度的片段發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，使秈稻氮素利用效率提高。 ?DNR1和RNR10 ?的基因克隆以及相互作用，為生長(zhǎng)素參與氮素利用效率提供了基因資源，并為解釋秈粳間氮素利用效率差異提供了更多證據(jù)。

氮素不僅影響水稻根系生長(zhǎng)，還影響葉面積變化和纖維素含量。Gao等[30]以葉面積和纖維素含量為指標(biāo)，通過日本晴和9311雜交構(gòu)建的CSSL群體，檢測(cè)到1個(gè)位于1號(hào)染色體的QTL，通過圖位克隆，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi) ?MYB61 ?是導(dǎo)致表型變化的基因，該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子作用于下游的 ?GRF4 ?基因，調(diào)控水稻纖維素合成和氮素利用。遺傳分析發(fā)現(xiàn)， ?MYB61 ?具有明顯的秈粳分化。秈稻中的單倍型具有更高的轉(zhuǎn)錄水平，在減氮的條件下，氮素利用效率更高。

以上研究結(jié)果對(duì)于解釋部分優(yōu)異材料的氮高效原因起到了關(guān)鍵作用，但雙親本QTL定位存在不足，如群體構(gòu)建時(shí)間較長(zhǎng)和檢測(cè)等位基因數(shù)量少等，研究人員嘗試?yán)米匀蛔儺惾后w快速克隆水稻氮素利用相關(guān)基因。

2 基于全基因組關(guān)聯(lián)分析的水稻氮素利用相關(guān)基因克隆

隨著二代測(cè)序成本降低，結(jié)合水稻種質(zhì)資源的多樣性，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析 （Genome Wide Association Study，GWAS）成為快速克隆水稻氮素利用相關(guān)基因的有效方法。Tang等[31]利用117份來(lái)自世界各地的具有極端氮響應(yīng)的地方品種，結(jié)合GBS（隨機(jī)測(cè)序式基因型檢測(cè)）和Imputation（預(yù)測(cè)）方法檢測(cè)其多態(tài)性，連續(xù)3年調(diào)查不同氮素處理下的株高、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量，克隆到硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)子OsNPF6.1，該轉(zhuǎn)運(yùn)子負(fù)責(zé)硝酸根的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，其優(yōu)勢(shì)單倍型的氨基酸序列第160位氨基酸由甘氨酸變成天冬氨酸，水稻對(duì)硝酸根吸收能力更強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)單倍型具有更高的 ?OsNPF6.1 ?基因表達(dá)水平，是因?yàn)閮?yōu)勢(shì)單倍型品種的 ?OsNPF6.1 ?啟動(dòng)子具有4個(gè)CACG元件，可以被調(diào)控水稻氮素高效利用的轉(zhuǎn)錄因子OsNAC42結(jié)合，而劣勢(shì)單倍型品種只有2個(gè)CACG元件，該研究結(jié)果在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上解釋了 ?OsNPF6.1 ?優(yōu)勢(shì)單倍型以及 ?OsNPF6.1 ?基因表達(dá)量高的原因。

利用同一群體， ?OsNLP4 ?和 ?OsGS1;1 ?基因相繼被發(fā)現(xiàn)[32-33]， ?OsNLP4 ?基因具有8個(gè)SNP，優(yōu)勢(shì)單倍型HapB具有更高的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)下游基因OsNiR具有更高的轉(zhuǎn)錄激活能力。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)不同品種中 ?OsNLP4 ?下游的OsNiR基因啟動(dòng)子上的NRE（硝酸鹽響應(yīng)元件）數(shù)量存在差異，NRE數(shù)量的增加提高植株對(duì)亞硝酸鹽的耐受性，并提高分蘗數(shù)，最終影響產(chǎn)量和氮素利用效率[32]。Liu等[33]發(fā)現(xiàn) ?OsGS1;1 ?基因通過可變剪切產(chǎn)生2種轉(zhuǎn)錄本，均可編碼具有活性的谷氨酰胺合成酶，優(yōu)勢(shì)單倍型HapB中的轉(zhuǎn)錄本OsGS1;1b具有更高的谷氨酰胺合成酶活性，可以提高水稻氮素利用效率，影響直鏈淀粉含量。在同一群體中4個(gè)基因（ ?OsNPF6.1，OsNAC42，OsNLP4和OsGS1;1 ?）的發(fā)掘驗(yàn)證了GWAS對(duì)于氮素利用相關(guān)基因的發(fā)掘能力，為快速鑒定與氮素利用有關(guān)的新基因提供了性狀（株高、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量）借鑒和經(jīng)驗(yàn)。

分蘗是氮素影響水稻發(fā)育的直觀表型，隨著氮肥施用量的增加，水稻分蘗呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。Liu等[34]利用來(lái)自世界各地的110份種質(zhì)資源，通過TRN（分蘗氮響應(yīng)）表型鑒定到1個(gè)氮素利用相關(guān)基因 ?OsTCP19 ?，該基因通過調(diào)控下游DLT 基因的表達(dá)負(fù)調(diào)控水稻分蘗，其優(yōu)勢(shì)單倍型啟動(dòng)子上缺失了29 bp長(zhǎng)度的片段，該優(yōu)勢(shì)單倍型在Aus稻中占比較高，通過近等基因系發(fā)現(xiàn)，該優(yōu)勢(shì)單倍型可有效提高水稻分蘗、產(chǎn)量和氮素利用效率。

有機(jī)氮可有效提升水稻氮素利用效率。Guo等[13]發(fā)現(xiàn)，水稻不同亞群對(duì)于天冬氨酸的吸收水平不同，粳稻的吸收速率約為秈稻的1.5倍，對(duì)水稻中不同的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列進(jìn)行基因內(nèi)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn) ?LHT1 ?基因與表型關(guān)聯(lián)程度高。根據(jù)3個(gè)SNP可以將 ?LHT1 ?分成兩種單倍型，其中type1在粳稻中存在，具有更高的 ?LHT1 ?基因表達(dá)量和天冬氨酸吸收速率，type2在秈稻中存在，具有較低的 ?LHT1 ?基因表達(dá)量和天冬氨酸吸收速率。

關(guān)聯(lián)分析克隆氮素利用相關(guān)基因，并解釋其變異，有效拓寬了水稻不同亞群的利用，不局限于秈稻和粳稻的差異，且自然變異群體可以檢測(cè)到多個(gè)氮素利用相關(guān)基因，結(jié)合優(yōu)異單倍型，更容易鑒定氮高效利用品種資源。

3 利用突變體克隆水稻氮素利用相關(guān)基因

谷氨酸在水稻氮素吸收利用過程中起到關(guān)鍵作用，GOGAT（谷氨酸合酶）負(fù)責(zé)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸。Yang等[35]通過一個(gè)水稻細(xì)胞分裂素異常反應(yīng)突變體abc1，克隆到水稻Fd-GOGAT基因，該基因在氮素同化和碳氮平衡中起到關(guān)鍵作用，遺傳變異分析結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)內(nèi)含有5個(gè)非同義變異，在水稻亞群中具有明顯的秈粳分化。Wang等[36]后續(xù)利用再突變的方式，將突變體abc1表型恢復(fù)，并篩選到了表型恢復(fù)的突變體are1，ARE1是1個(gè)葉綠體定位蛋白，突變后葉片葉綠素含量升高，衰老延遲，可以使水稻產(chǎn)量提升10%～20%。遺傳變異分析結(jié)果表明，在18%的秈稻和48%的aus稻中 ?ARE1 ?基因序列中被插入長(zhǎng)度6 bp的片段，使得該基因表達(dá)量降低，水稻產(chǎn)量升高。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在ghd7突變體中， ?ARE1 ?的表達(dá)量升高。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄抑制因子Ghd7可以與 ?ARE1 ?的啟動(dòng)子和第1個(gè)內(nèi)含子結(jié)合，抑制 ?ARE1 ?的表達(dá)， ?Ghd7 ?的優(yōu)勢(shì)單倍型和 ?ARE1 ?的優(yōu)勢(shì)單倍型在東亞和南亞氮肥施用少的地方具有相對(duì)較高的比例，可以提高氮素利用效率和水稻產(chǎn)量[37]。有研究結(jié)果表明，DELLA蛋白在氮素利用中起到關(guān)鍵作用[27]。Wu等[38]利用EMS誘變，得到1個(gè)分蘗數(shù)量減少，對(duì)氮肥供應(yīng)量變化不敏感的突變體ngr5。通過圖位克隆，發(fā)現(xiàn)NGR5是水稻響應(yīng)氮素的正調(diào)控因子，含有APETALA2（AP2）結(jié)構(gòu)域，與PRC2蛋白復(fù)合物互作，通過介導(dǎo)組蛋白H3K27me3甲基化修飾水平來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，最終調(diào)控水稻的分蘗等生長(zhǎng)發(fā)育性狀。研究還發(fā)現(xiàn)，NGR5與DELLA蛋白互作，DELLA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合赤霉素受體GID1（Gibberellin Receptor），抑制赤霉素介導(dǎo)的NGR5蛋白降解，增加NGR5蛋白穩(wěn)定性。遺傳分析發(fā)現(xiàn)， ?NGR5 ?基因含有5種單倍型，其中Hap2單倍型與 ?NGR5 ?高轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，具有更高的分蘗數(shù)和田間產(chǎn)量，高產(chǎn)秈稻品種桂朝2號(hào)屬于Hap2單倍型。

在對(duì)NH+4影響水稻根系生長(zhǎng)的研究中，Xie等[39]通過EMS誘變，得到1個(gè)對(duì)銨鹽超敏感的突變體rohan，并克隆其突變基因ASL。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ASL可以顯著增強(qiáng)水稻根系對(duì)銨鹽的耐受性，顯著提高水稻的產(chǎn)量和氮素利用效率。進(jìn)一步分析ASL基因的自然變異，發(fā)現(xiàn)該基因在秈稻和粳稻之間具有明顯的分化，ASL基因共有37個(gè)SNP，其中錯(cuò)義突變SNP（Chr3：10847318，A→G）導(dǎo)致編碼的賴氨酸變?yōu)榫彼?，SNPG植株根系對(duì)NH+4敏感性高于SNPA植株。在高氮誘導(dǎo)下，SNPA植株的ASL表達(dá)水平更高，對(duì)NH+4的耐受性更強(qiáng)。

4 利用反向遺傳學(xué)克隆水稻氮素利用相關(guān)基因

Fan等[40]發(fā)現(xiàn)NRT2.3是1個(gè)對(duì)pH值敏感的硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)子，其可變剪切體OsNRT2.3b主要在韌皮部表達(dá)，并在胞質(zhì)側(cè)具有調(diào)節(jié)基序，能通過pH傳感機(jī)制開啟或關(guān)閉硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性。在水稻中過表達(dá) ?OsNRT2.3b ?，可以使水稻對(duì)氮素的利用效率提高40%。同時(shí)，Xie等[41]發(fā)現(xiàn)，相比于Indica Ⅰ， ?OsNRT2.3 ?在Indica Ⅱ進(jìn)化過程中受到了選擇。Fan等[40]試驗(yàn)數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了這一結(jié)果。Zhang等[42]在前人研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探究 ?OsNRT2.3 ?的功能，發(fā)現(xiàn) ?OsNRT2.3 ?的等位基因 ?HTNE-2 ?發(fā)生SNP變異（距離ATG 111 bp的C堿基和距離ATG 7 bp的T堿基），導(dǎo)致OsNRT2.3b蛋白水平增加，使水稻在受到高溫脅迫時(shí)具有更高產(chǎn)量，為抗高溫和氮高效利用育種改良提供了基因資源。

5 展 望

挖掘水稻氮素利用相關(guān)基因是提高水稻產(chǎn)量和減少氮肥施用量的關(guān)鍵，研究者利用雙親QTL檢測(cè)、GWAS等方法克隆到多個(gè)水稻氮素利用相關(guān)基因。然而，水稻基因組極為復(fù)雜，基因組包含了大量基因，其中涉及到氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化和再利用的基因有數(shù)百個(gè)，在水稻染色體上還存在結(jié)構(gòu)變異[43]。因此，鑒定和解析與水稻氮素利用相關(guān)的基因是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，需要高通量測(cè)序或者單細(xì)胞測(cè)序等先進(jìn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行基因篩選和功能研究。同時(shí)，還需要根據(jù)已克隆的與氮高效利用有關(guān)的基因進(jìn)一步地構(gòu)建水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括氮素信號(hào)感知、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和代謝途徑調(diào)控等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

水稻氮素利用還受到環(huán)境因素的影響[44-45]，如土壤氮含量和氣候條件等，環(huán)境因素使得研究水稻氮素利用相關(guān)基因的遺傳機(jī)制更加困難。因此需要多年多點(diǎn)、大規(guī)模和更精準(zhǔn)的種植結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證，從而獲取更全面的數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確的結(jié)果[46]。目前研究多使用低產(chǎn)親本日本晴、中花11等作為背景親本，與實(shí)際生產(chǎn)上所用的水稻品種有較大差異，如何用已克隆的優(yōu)異單倍型改善現(xiàn)有的種植品種性狀也是需要關(guān)注的重點(diǎn)。

不同品種水稻對(duì)氮素的利用效率不同，這與其遺傳背景密切相關(guān)。因此，在研究水稻氮素利用相關(guān)基因變異的同時(shí)，需要考慮到不同品種之間的遺傳多樣性，并進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析和群體遺傳學(xué)研究，以揭示品種間的差異和遺傳機(jī)制。目前已克隆到多個(gè)與氮素利用相關(guān)的基因[47-48]，后續(xù)可以結(jié)合不同水稻品種進(jìn)行單倍型分析，進(jìn)一步發(fā)掘、驗(yàn)證這些基因的優(yōu)異單倍型，為氮素高效利用新品種選育提供氮高效利用的優(yōu)異單倍型資源。前期研究發(fā)現(xiàn)的氮高效利用優(yōu)異單倍型普遍存在于秈稻中，如 ?OsNRT1.1B-IR24 ?、 ?OsNR2-9311 ?、 ?OsNPF6.1HapB ?、 ?GRF4ngr2 ?和 ?NGR5 ?- ?Hap2 ?等。然而，粳稻中同樣具有豐富的氮高效種質(zhì)資源，后續(xù)研究可以圍繞粳稻地方種質(zhì)資源進(jìn)行氮素利用相關(guān)基因的發(fā)掘和驗(yàn)證，加快粳稻氮高效利用育種進(jìn)程。

目前研究主要對(duì)水稻與氮素利用有關(guān)的表型如株高、分蘗等進(jìn)行分析，較少分析氮含量直接指標(biāo)，如不同時(shí)期、不同部位氮含量的測(cè)定，氮含量直接指標(biāo)可以更有效地反映氮素在水稻體內(nèi)不同時(shí)期、不同部位的變化情況，并且結(jié)合關(guān)聯(lián)分析形成動(dòng)態(tài)的位點(diǎn)分析，既可以為氮素利用相關(guān)基因的克隆提供更多的位點(diǎn)，又可為氮高效利用育種的精準(zhǔn)改良提供更精確的位點(diǎn)。

水稻氮素利用相關(guān)基因的研究有著廣闊的發(fā)展前景，隨著基因編輯技術(shù)等技術(shù)的不斷進(jìn)步，可以更精確地研究和編輯水稻氮素利用相關(guān)基因。同時(shí)，組學(xué)研究結(jié)合大數(shù)據(jù)和人工智能等技術(shù)，可以更深入地挖掘水稻基因組中與氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化和再利用有關(guān)的基因，加速氮素利用相關(guān)基因的鑒定和功能驗(yàn)證，從而縮短氮高效利用品種的育種周期。挖掘水稻氮素利用相關(guān)基因，研究水稻氮素利用的分子調(diào)控機(jī)制，培育氮高效利用水稻品種對(duì)于推動(dòng)中國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保障國(guó)家糧食安全都具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?SHI J X， AN G， WEBER A P M， et al. Prospects for rice in 2050[J]. Plant，Cell & Environment，2023，46（4）：1037-1045.

[2] GRUBER N， GALLOWAY J N. An earth-system perspective of the global nitrogen cycle[J]. Nature，2008，451：293-296.

[3] SCHULTE-UEBBING L F， BEUSEN A H W， BOUWMAN A F， et al. From planetary to regional boundaries for agricultural nitrogen pollution[J]. Nature，2022，610：507-512.

[4] HE W T， JIANG R， HE P， et al. Estimating soil nitrogen balance at regional scale in Chinas croplands from 1984 to 2014[J]. Agricultural Systems，2018，167：125-135.

[5] YIN Y L， ZHAO R F， YANG Y， et al. A steady-state N balance approach for sustainable smallholder farming[J]. PNAS，2021，118（39）：e2106576118.

[6] XU G H， FAN X R， MILLER A J. Plant nitrogen assimilation and use efficiency[J]. Annual Review of Plant Biology，2012，63：153-182.

[7] WEI J， ZHENG Y， FENG H M， et al. OsNRT2.4 encodes a dual-affinity nitrate transporter and functions in nitrate-regulated root growth and nitrate distribution in rice[J]. Journal of Experimental Botany，2018，69（5）：1095-1107.

[8] XIA X D， FAN X R， WEI J， et al. Rice nitrate transporter OsNPF2.4 functions in low-affinity acquisition and long-distance transport[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（1）：317-331.

[9] FAN X R， NAZ M， FAN X R， et al. Plant nitrate transporters：from gene function to application[J]. Journal of Experimental Botany，2017，68（10）：2463-2475.

[10] LI C， TANG Z， WEI J， et al. The OsAMT1. 1 gene functions in ammonium uptake and ammonium-potassium homeostasis over low and high ammonium concentration ranges[J]. Journal of Genetics and Genomics，2016，43（11）：639-649.

[11] WU X Y， XIE X X， YANG S， et al. OsAMT1;1 and OsAMT1;2 coordinate root morphological and physiological responses to ammonium for efficient nitrogen foraging in rice[J]. Plant and Cell Physiology，2022，63（9）：1309-1320.

[12] LEE S， MARMAGNE A， PARK J， et al. Concurrent activation of OsAMT1;2 and OsGOGAT1 in rice leads to enhanced nitrogen use efficiency under nitrogen limitation[J]. Plant Journal，2020，103（1）：7-20.

[13] GUO N， HU J Q， YAN M， et al. Oryza sativa Lysine-Histidine-type Transporter 1 functions in root uptake and root-to-shoot allocation of amino acids in rice[J]. Plant Journal，2020，103（1）：395-411.

[14] TABUCHI M， SUGIYAMA K， ISHIYAMA K， et al. Severe reduction in growth rate and grain filling of rice mutants lacking OsGS1;1， a cytosolic glutamine synthetase1;1[J]. Plant Journal，2005，42（5）：641-651.

[15] REN Z H， GAO J P， LI L G， et al. A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter[J]. Nature Genetics，2005，37（10）：1141-1146.

[16] LI X M， CHAO D Y， WU Y， et al. Natural alleles of a proteasome α2 subunit gene contribute to thermotolerance and adaptation of African rice[J]. Nature Genetics，2015，47（7）：827-833.

[17] SI L Z， CHEN J Y， HUANG X H， et al. OsSPL13 controls grain size in cultivated rice[J]. Nature Genetics，2016，48（4）：447-456.

[18] YANO K， YAMAMOTO E， AYA K， et al. Genome-wide association study using whole-genome sequencing rapidly identifies new genes influencing agronomic traits in rice[J]. Nature Genetics，2016，48（8）：427-434.

[19] ZHAO K Y， TUNG C W， EIZENGA G C， et al. Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa[J]. Nature Communications，2011，2：467.

[20] ZHANG Y J， TAN L B， ZHU Z F， et al. TOND1 confers tolerance to nitrogen deficiency in rice[J]. Plant Journal，2015，81（3）：367-376.

[21] YANG X H， XIA X Z， ZHANG Z Q， et al. QTL mapping by whole genome re-sequencing and analysis of candidate genes for nitrogen use efficiency in rice[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：1634.

[22] YANG X H， NONG B X， CHEN C， et al. OsNPF3.1， a member of the NRT1/PTR family， increases nitrogen use efficiency and biomass production in rice[J]. The Crop Journal，2023，11（1）：108-118.

[23] SUN H Y， QIAN Q， WU K， et al. Heterotrimeric G proteins regulate nitrogen-use efficiency in rice[J]. Nature Genetics，2014，46（6）：652-656.

[24] HUANG X Z， QIAN Q， LIU Z B， et al. Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice[J]. Nature Genetics，2009，41（4）：494-497.

[25] HU B， WANG W， OU S J， et al. Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies[J]. Nature Genetics，2015，47（7）：834-838.

[26] GAO Z Y， WANG Y F， CHEN G， et al. The indica nitrate reductase gene OsNR2 allele enhances rice yield potential and nitrogen use efficiency[J]. Nature Communications，2019，10（1）：5279.

[27] LI S， TIAN Y H， WU K， et al. Modulating plant growth-metabolism coordination for sustainable agriculture[J]. Nature，2018，560：595-600.

[28] ZHANG S Y， ZHU L M， SHEN C B， et al. Natural allelic variation in a modulator of auxin homeostasis improves grain yield and nitrogen use efficiency in rice[J]. Plant Cell，2021，33（3）：566-580.

[29] HUANG Y Z， JI Z， TAO Y J， et al. Improving rice nitrogen-use efficiency by modulating a novel monouniquitination machinery for optimal root plasticity response to nitrogen[J]. Nature Plants，2023，9（11）：1902-1914.

[30] GAO Y H， XU Z P， ZHANG L J， et al. MYB61 is regulated by GRF4 and promotes nitrogen utilization and biomass production in rice[J]. Nature Communications，2020，11（1）：1-12.

[31] TANG W J， YE J， YAO X M， et al. Genome-wide associated study identifies NAC42-activated nitrate transporter conferring high nitrogen use efficiency in rice[J]. Nature Communications，2019，10（1）：5279.

[32] YU J， XUAN W， TIAN Y L， et al. Enhanced OsNLP4-OsNiR cascade confers nitrogen use efficiency by promoting tiller number in rice[J]. Plant Biotechnology Journal，2021，19（1）：167-176.

[33] LIU X L， TIAN Y L， CHI W C， et al. Alternative splicing of OsGS1;1 affects nitrogen-use efficiency， grain development， and amylose content in rice[J]. Plant Journal，2022，110（6）：1751-1762.

[34] LIU Y Q， WANG H R， JIANG Z M， et al. Genomic basis of geographical adaptation to soil nitrogen in rice[J]. Nature，2021，590：600-605.

[35] YANG X L， NIAN J Q， XIE Q J， et al. Rice ferredoxin-dependent glutamate synthase regulates nitrogen-carbon metabolomes and is genetically differentiated between japonica and indica subspecies[J]. Molecular Plant，2016，9（11）：1520-1534.

[36] WANG Q， NIAN J Q， XIE X Z， et al. Genetic variations in ARE1 mediate grain yield by modulating nitrogen utilization in rice[J]. Nature Communications，2018，9（1）：735.

[37] WANG Q， SU Q M， NIAN J Q， et al. The Ghd7 transcription factor represses ARE1 expression to enhance nitrogen utilization and grain yield in rice[J]. Molecular Plant，2021，14（6）：1012-1023.

[38] WU K， WANG S K， SONG W Z， et al. Enhanced sustainable green revolution yield via nitrogen-responsive chromatin modulation in rice[J]. Science，2020，367. DOI：10.1126/science.aaz2046.

[39] XIE Y M， LV Y D， JIA L T， et al. Plastid-localized amino acid metabolism coordinates rice ammonium tolerance and nitrogen use efficiency[J]. Nature Plants，2023，9（9）：1514-1529.

[40] FAN X R， TANG Z， TAN Y W， et al. Overexpression of a pH-sensitive nitrate transporter in rice increases crop yields[J]. PNAS，2016，113（26）：7118-7123.

[41] XIE W B， WANG G W， YUAN M， et al. Breeding signatures of rice improvement revealed by a genomic variation map from a large germplasm collection[J]. PNAS，2015，112（39）：5411-5419.

[42] ZHANG Y， TATEISHI-KARIMATA H， ENDOH T， et al. High-temperature adaptation of an OsNRT2.3 allele is thermoregulated by small RNAs[J]. Science Advances，2022，8（47）. DOI： 10.1126/sciadv.adc9785

[43] WANG C L， WANG J， LU J Y， et al. A natural gene drive system confers reproductive isolation in rice[J]. Cell，2023，186（17）：3577-3592.

[44] 趙彭輝，費(fèi)良軍，劉大有. 土表致密層形成下肥液膜孔灌入滲土壤水氮分布[J]. 排灌機(jī)械工程學(xué)報(bào)，2023，41（7）：709-715.

[45] 劉中良，高俊杰，陳 震，等. 氮肥減量配施有機(jī)肥對(duì)大白菜產(chǎn)量、品質(zhì)及氮肥利用率的影響[J]. 排灌機(jī)械工程學(xué)報(bào)，2022，40（11）：1138-1144.

[46] KHAIPHO-BURCH M， COOPER M， CROSSA J， et al. Genetic modification can improve crop yields——but stop overselling it[J]. Nature，2023，621：470-473.

[47] WANG W， HU B， YUAN D Y， et al. Expression of the nitrate transporter gene ??OsNRT1.1A/OsNPF6.3 ??confers high yield and early maturation in rice[J]. Plant Cell，2018，30（3）：638-651.

[48] YAN M， FAN X R， FENG H M， et al. Rice OsNAR2.1 interacts with OsNRT2.1， OsNRT2.2 and OsNRT2.3a nitrate transporters to provide uptake over high and low concentration ranges[J]. Plant， Cell & Environment，2011，34（8）：1360-1372. ???（責(zé)任編輯：成紓寒）