楊利 張浩明 喬緒穩(wěn) 陳瑾 鄭其升 程海衛(wèi)

摘要： ?本研究利用基因工程方法將抗口蹄疫病毒（FMDV）納米抗體Nb205和抗雞醛化紅細胞（cRBC）納米抗體NbRBC48的基因片段連接，構(gòu)建雙特異納米抗體Nb205-48，其相對分子質(zhì)量為3.5×104，能同時與FMDV和cRBC反應(yīng)。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原檢測的血凝方法，該方法檢測靈敏度為1 μg/ml，與其他病毒無交叉反應(yīng)，且批內(nèi)和批間重復(fù)性好。分別采用血凝法和夾心ELISA方法對3批次FMDV抗原進行了檢測，二者檢測結(jié)果基本吻合。本研究建立了基于雙特異納米抗體Nb205-48的血凝檢測方法，該方法具有較好的靈敏度、特異性和重復(fù)性，且簡便、快捷、成本低，其檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的FMDV定量檢測方法的檢測結(jié)果相關(guān)性好，為檢測口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程中FMDV抗原的含量提供了新方法。

關(guān)鍵詞： ?口蹄疫病毒； 雙特異性納米抗體； 血凝檢測法

中圖分類號： ?S852.65 ???文獻標識碼： A ???文章編號： ?1000-4440（2024）03-0514-08

Establishment of haemagglutination detection method for quantification of foot and mouth disease virus based on bispecific nanobodies

YANG Li1，2， ZHANG Hao-ming1，2， QIAO Xu-wen1，2， CHEN Jin1，2， ZHENG Qi-sheng1，2， CHENG Hai-wei1，2

（1.Institute of Veterinary Immunology & Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals/Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety， Nanjing 210014， China； 2.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China）

Abstract： ??In this study， the gene fragments of the nanobody Nb205 against foot-and-mouth disease virus （FMDV） and the nanobody NbRBC48 against chicken aldehyde red blood cell （cRBC） were connected by genetic engineering method to construct the bispecific nanobody Nb205-48. Its relative molecular weight was 3.5×104， and it could react with FMDV and cRBC simultaneously. A new hemagglutination method for the detection of FMDV antigen was established successfully by using Nb205-48. The detection sensitivity of this method was 1 μg/ml， and it had no cross-reaction with other viruses. In addition， the intra-batch and inter-batch repeatability was good. Three batches of FMDV antigen were detected by hemagglutination method and sandwich ELISA method， and the results were similar. In this study， a novel hemagglutination method based on bispecific nanobody Nb205-48 was established. The method had good sensitivity， specificity and repeatability， and was simple， fast and low cost. The detection results were well correlated with the results of traditional FMDV quantitative detection methods. The method constructed in this study provides a new method for detecting the content of FMDV antigen in the production of foot-and-mouth disease vaccine.

Key words： ?foot and mouth disease virus； bispecific nanobodies; haemagglutination detection method

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的人畜共患病。該病毒可以通過消化道、呼吸道等途徑在70多種偶蹄動物（豬、牛、羊等）間快速傳播，造成巨大經(jīng)濟損失[1]。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類傳染病之首。

疫苗接種是防控該病最有效的措施，免疫動物抵御FMDV的能力與疫苗的質(zhì)量密切相關(guān)。依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》，F(xiàn)MDV疫苗質(zhì)量控制的首要指標是疫苗中有效抗原含量。FMDV疫苗中有效抗原含量測定的方法主要包括雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[2-3]、蔗糖密度梯度離心法（Sucrose density gradient ltracentrifugation，SDG）[4]以及高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography，HPLC）[5]等。但此類方法操作繁瑣、成本較高，且對實驗室硬件條件以及操作人員經(jīng)驗均有較高要求，因此不適用于一般實驗室。血凝方法因為操作簡便、對設(shè)備和工作人員要求低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于基層實驗室[6-8]，由于FMDV沒有血凝性，無法使用血凝方法進行檢測。近年來有文獻報道，利用雙功能分子或雙特異抗體可以實現(xiàn)紅細胞的交聯(lián)和凝集，并成功建立可用于檢測人體免疫缺陷病毒1型（HIV-1）[9]、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）[10]和豬圓環(huán)病毒（PCV2）[11]的血凝方法。本研究擬利用抗FMDV和抗醛化雞紅細胞（Chicken red blood cells，cRBCs）的納米抗體構(gòu)建一種新型雙特異納米抗體（Bispecific nanobody）Nb205-48，建立一種可用于檢測FMDV抗原的血凝方法，并對該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性進行鑒定，為口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程中FMDV抗原含量的檢測提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

滅活O型FMDV抗原由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，3批次滅活O型FMDV抗原（FMDV-1、FMDV-2和FMDV-3，3批次獨立生產(chǎn)）由內(nèi)蒙古金宇集團提供，豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所保存；載體pET32a和pMD18-T、大腸桿菌DH5α和BL21購自Novagen公司；Anti-his鼠單抗及HRP羊抗鼠IgG（H+L）購自武漢博士德生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶及PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司；HisTrap HP親和層析柱購自Life Science公司；口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。cRBCs由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所制備；抗FMDV納米抗體Nb205[12]和抗cRBCs納米抗體NbRBC48[11]均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所篩選獲得。本研究所涉及到的PCR引物見表1。

1.2 雙特異納米抗體Nb205-48表達載體的構(gòu)建

1.2.1 NbFMDV-linker-NbRBC基因片段的擴增 ?通過連接肽將抗FMDV納米抗體的基因片段 ?Nb205 ?和抗cRBCs納米抗體的基因片段 ?NbRBC48 ?連接，擴增出NbFMDV-linker-NbRBC基因片段[11]。具體操作如下：以 ?Nb205 ?基因序列為模板，以NbFMDV-l（含酶切位點Nde Ⅰ）和NbFMDV-r（含部分連接肽序列）為引物，通過PCR擴增出NbFMDV-linker；以 ?NbRBC48 ?基因片段為模板，以NbRBC-l（含部分連接肽序列）和NbRBC-r（含酶切位點Not Ⅰ）為引物，通過PCR擴增出linker-NbcRBC。以NbFMDV-l和NbRBC-r為引物，采用重疊延伸PCR（Splicing overlap extension PCR，SOEPCR）將NbFMDV-linker和linker-NbRBC組裝成NbFMDV-linker-NbRBC。所有PCR產(chǎn)物均采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將菌落PCR鑒定為陽性的單克隆送至上海生工生物有限公司進行測序分析。將測序正確的擴增片段記為NbFMDV-linker-NbRBC。

1.2.2 pET32a- ?Nb205-48 ?表達載體的構(gòu)建 ?采用Nde Ⅰ和Not Ⅰ對NbFMDV-linker-NbRBC和載體pET32a進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段和載體pET32a利用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。隨機挑選單克隆，進行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定，將鑒定為陽性克隆送上海生工生物有限公司進行測序分析。將測序正確的克隆記為pET32a- ?Nb205-48 ?。

1.3 Nb205-48的表達與純化

將pET32a- ?Nb205-48 ?轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21接種到含終質(zhì)量濃度為100 μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床上培養(yǎng)。待菌液OD600為0.6～0.8時，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃恒溫搖床上誘導(dǎo)表達過夜。8 000 g離心20 min收集菌體，PBS（pH 7.2）重懸菌體后進行高壓破碎。將細菌破碎液12 000 g離心20 min，收集上清液。采用HisTrap HP對上清液進行親和純化。采用SDS-PAGE和Western Blotting鑒定表達產(chǎn)物及純化的Nb205-48。

1.4 間接ELISA鑒定Nb205-48的反應(yīng)原性

用碳酸鹽緩沖液（CBS）將新鮮的雞紅細胞稀釋至每1 ml 2×105個，加到96孔酶標板中37 ℃包被2 h，棄上清液后加入0.5%戊二醛室溫固定10 min，棄去固定液后加入含3%過氧化氫的甲醇溶液室溫1 h（淬滅內(nèi)源性過氧化物酶），PBST洗滌后用1%明膠-PBST封閉酶標板，PBST洗滌后備用。用CBS將FMDV稀釋至1 μg/ml后加到96孔酶標板中37 ℃包被2 h，PBST洗滌后用1%明膠-PBST封閉酶標板，PBST洗滌后備用。用PBST將Nb205-48稀釋到1 μg/ml后加入到上述制備好的酶標板中，另用Nb205、NbRBC48和PBS分別代替Nb205-48作為對照，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后向上述酶標板中加入1∶2 000稀釋的Anti-his鼠單抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后向上述酶標板中加入1∶10 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG （H+L），37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后向上述酶標板中加入TMB顯色液，室溫顯色10 min。用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，酶標儀上讀取450 nm處吸光值。

1.5 基于Nb205-48的血凝方法的建立

1.5.1 Nb205-48工作質(zhì)量濃度的確定 ?預(yù)先在血凝板上每孔加入25 μl FMDV（10 μg/ml）和25 μl cRBCs（每1 ml 2×105個細胞）。用PBS將Nb205-48稀釋至32.00 μg/ml、16.00 μg/ml、8.00 μg/ml、4.00 μg/ml、2.00 μg/ml、1.00 μg/ml、0.50 μg/ml和0.25 μg/ml。取25 μl稀釋后的Nb205-48加入到上述血凝板中，并用PBS代替Nb205-48作為對照，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育15 min，觀察血凝結(jié)果。引起cRBCs完全血凝時Nb205-48的最低質(zhì)量濃度為Nb205-48的工作質(zhì)量濃度。

1.5.2 靈敏度測定 ?用PBS將FMDV抗原稀釋至8.00 μg/ml、4.00 μg/ml、2.00 μg/ml、1.00 μg/ml、0.50 μg/ml和 0.25 μg/ml。取25 μl稀釋后的FMDV加入到血凝板中，再向每孔中加入25 μl cRBCs和25 μl Nb205-48，用PBS代替FMDV作為對照，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育15 min，觀察血凝結(jié)果。能引起cRBCs完全凝集時抗原最低質(zhì)量濃度為該方法的檢測靈敏度。

1.5.3 特異性試驗 ?在血凝板中加入25 μl FMDV、PCV2、PRRSV、PRV、PEDV和PBS，再向每孔中加入25 μl cRBCs和25 μl Nb205-48，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育15 min，觀察血凝結(jié)果，驗證該方法的特異性。

1.5.4 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗 ?用PBS將FMDV抗原稀釋至16.00 μg/ml、8.00 μg/ml、4.00 μg/ml、2.00 μg/ml、1.00 μg/ml、0.50 μg/ml和0.25 μg/ml。用同一批Nb205-48工作液對每個稀釋度的FMDV重復(fù)檢測3次，驗證該方法的批內(nèi)可重復(fù)性。用3批次Nb205-48工作液對每個稀釋度的FMDV重復(fù)檢測3次，驗證該方法的批間可重復(fù)性。

1.6 血凝法與夾心ELISA方法檢測結(jié)果的比較

將3批次滅活O型FMDV抗原（FMDV-1，F(xiàn)MDV-2，F(xiàn)MDV-3）梯度稀釋后分別采用本研究建立的基于Nb205-48的血凝方法和夾心ELISA方法進行檢測，對比分析2種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性。夾心ELISA方法具體操作如下：（1）將滅活O型FMDV抗原用PBS稀釋至1 μg/ml后，2倍梯度稀釋成5個梯度，作為標準品；將樣品FMDV-1，F(xiàn)MDV-2，F(xiàn)MEV-3抗原2倍梯度稀釋。（2）取出口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒中的已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板，以每孔50 μl向上述板中分別加入梯度稀釋后的標準品和樣品，以加入PBS代替標準品的孔為空白對照；37 ℃溫育60 min。（3）PBST洗板5次后，以每孔50 μl向ELISA板中加入口蹄疫O型豚鼠抗體工作液，37 ℃溫育30 min。（4）PBST洗板5次后，以每孔50 μl向ELISA板中加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，37 ℃溫育30 min。（5）PBST洗板5次后，將TMB底物A溶液和B溶液等體積混合后以每孔50 μl加入到ELISA板中，37 ℃溫育15 min。（6）每孔加入50 μl終止液終止反應(yīng)，在酶標儀上讀取OD450值。以FMDV抗原質(zhì)量濃度為橫坐標，OD450值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣品OD450值計算出樣品中FMDV抗原的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ??Nb205-48 ?的構(gòu)建、表達及鑒定

將 ?Nb205 ?和 ?NbRBC48 ?基因采用連接肽連接，成功構(gòu)建表達Nb205-48的重組菌pET32a- ?Nb205-48 ?（圖1）。重組菌pET32a- ?Nb205-48 ?經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和鎳柱親和純化最終獲得雙功能納米抗體Nb205-48。SDS-PAGE和Western Blotting鑒定結(jié)果顯示， ?Nb205-48 ?可在大腸桿菌中表達，其表達的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為3.5×104（圖2），符合預(yù)期。采用間接ELISA對Nb205-48與FMDV和cRBCs的反應(yīng)性能進行檢測，結(jié)果顯示Nb205-48可以同時與FMDV及cRBCs反應(yīng)，且反應(yīng)性能與Nb205和NbRBC48無明顯差異（圖3）。

2.2 血凝方法的建立

2.2.1 Nb205-48工作質(zhì)量濃度的確定 ?將梯度稀釋后的Nb205-48加入含F(xiàn)MDV和cRBCs的血凝板中進行血凝試驗，確定其工作質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)Nb205-48質(zhì)量濃度高于2 μg/ml時cRBCs完全凝集，當(dāng)Nb205-48低于2 μg/ml時cRBCs部分凝集或不凝集，表明Nb205-48最佳工作質(zhì)量濃度為2 μg/ml（圖4）。

2.2.2 靈敏度 ?將FMDV梯度稀釋后進行血凝試驗，測定該方法的靈敏度。結(jié)果顯示，當(dāng)FMDV質(zhì)量濃度高于1 μg/ml時，cRBCs完全凝集，低于1 μg/ml時cRBCs不凝集。說明能引起cRBCs完全凝集時FMDV的最低質(zhì)量濃度為1 μg/ml，因此該方法的檢測靈敏度為1 μg/ml（圖5）。

2.2.3 特異性 ?將FMDV、PCV2、PRRSV、PRV和PEDV分別加入血凝板中進行血凝試驗。結(jié)果顯示僅FMDV能凝集cRBCs，其他病毒不能凝集cRBCs（圖6），表明本方法具有較好的特異性。

2.2.4 批內(nèi)與批間重復(fù)性 ?采用同一批Nb205-48工作液對FMDV進行3次重復(fù)檢測，其檢測靈敏度均為1 μg/ml（圖7A）；采用不同批Nb205-48工作液對FMDV進行重復(fù)檢測，其檢測靈敏度均為1 μg/ml（圖7B），表明該方法具有較好的可重復(fù)性。

2.3 血凝法與夾心ELISA方法檢測結(jié)果比較

將3批次滅活O型FMDV抗原（FMDV-1、FMDV-2、FMDV-3）梯度稀釋后分別采用本研究建立的血凝法和夾心ELISA方法進行檢測。圖8為夾心ELISA的標準曲線，該曲線的R2=0.997 7＞0.995，表明夾心ELISA檢測結(jié)果準確。表2為夾心ELISA檢測3批次抗原在不同稀釋倍數(shù)下的結(jié)果，數(shù)據(jù)顯示3批次抗原的質(zhì)量濃度分別約為32 μg/ml、34 μg/ml、33 μg/ml。圖9為血凝法檢測3批次口蹄疫抗原的結(jié)果，可見FMDV-1、FMDV-2、FMDV-3在稀釋倍數(shù)≤32倍時出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，稀釋倍數(shù)為64倍時不出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，可判定FMDV-1、FMDV-2、FMDV-3的質(zhì)量濃度均≥32 μg/ml，這與夾心ELISA結(jié)果基本相符，表明血凝法的檢測結(jié)果與夾心ELISA方法的檢測結(jié)果相關(guān)性好。

3 討 論

口蹄疫對畜牧養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，計劃免疫口蹄疫疫苗一直是防控該病的有效措施。疫苗中FMDV的含量決定了該疫苗的質(zhì)量和免疫效力，因此FMDV含量的測定對于該病的防控至關(guān)重要。

蔗糖密度梯度離心法（SDG）作為金標準是口蹄疫疫苗中FMDV抗原定量最廣泛使用的方法[13]，但該方法存在操作過程繁瑣，耗時耗力，通量低，重復(fù)性不佳等缺點[14]。為了提高定量結(jié)果的準確性和 可重復(fù)性，高效液相色譜 （HPLC）[15-16]被引入后已取代SDG。但該方法對樣品的純度要求較高，上機前需先對樣品進行蔗糖密度梯度離心純化。ELISA[3，17-20]雖然操作簡單、通量高、檢測時長短，但仍存在依賴高精度設(shè)備和有經(jīng)驗操作人員等缺點。血凝方法是一種基層獸醫(yī)工作人員在畜禽疾病診斷中廣泛應(yīng)用的快速檢測方法[21]，該技術(shù)具有受干擾因素（如環(huán)境溫度、紅細胞質(zhì)量、操作人員技術(shù)水平）影響小、操作簡便、耗時短、肉眼即可判讀檢測結(jié)果等優(yōu)點，一直被用于具有血凝活性病毒（如流感病毒）的檢測[22]。隨著雙功能分子的出現(xiàn)，血凝方法也被用于檢測無血凝性的病毒（如HIV、HBsAg、PCV2）。這種雙功能分子一般由抗紅細胞抗體和抗原分子或抗紅細胞抗體和抗體兩部分通過化學(xué)交聯(lián)或重組表達獲得[23]。傳統(tǒng)雙功能分子中的抗體一般為單鏈抗體，但是單鏈抗體相對分子質(zhì)量大，在表達時容易聚沉且產(chǎn)量低。納米抗體是目前已知的具有完整功能的最小抗原結(jié)合片段，因其相對分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性強、易可溶性表達等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于疾病治療和診斷試劑的研究[24]。

4 結(jié) 論

本研究將抗FMDV和cRBC的納米抗體融合表達構(gòu)建了雙特異納米抗體Nb205-48。SDS-PAGE及Western Blotting結(jié)果顯示 ?Nb205-48 ?能在大腸桿菌中可溶性表達，間接ELISA結(jié)果顯示Nb205-48與FMDV和cRBC均有較好的反應(yīng)性能。基于Nb205-48的雙特異性，本研究建立了用于FMDV檢測的血凝方法。通過試驗確定了該方法的靈敏度為1 μg/ml，特異介導(dǎo)FMDV凝結(jié)cRBC，與其他病毒無交叉反應(yīng)，且批內(nèi)和批間重復(fù)性好。分別采用本研究建立的血凝法和夾心ELISA方法對3批次O型FMDV抗原進行檢測，二者的檢測結(jié)果基本吻合，表明該血凝法有用于檢測FMDV含量的潛力。由于方法的局限性，本研究建立的血凝法靈敏度為1 μg/ml，不如夾心ELISA方法（0.06 μg/ml）。但該方法的檢測時間只有15 min，遠遠低于夾心ELISA方法（2 h 15 min）等傳統(tǒng)的FMDV檢測方法，可實現(xiàn)FMDV的快速高通量檢測。后續(xù)的研究工作中，我們還可以通過優(yōu)化融合表達方式和篩選親和力更高的納米抗體去提高該方法靈敏度。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建雙特異納米抗體，建立了可用于FMDV抗原檢測的血凝方法，該方法靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測方法的檢測結(jié)果相關(guān)性好，操作簡便，成本低，耗時短，為檢測口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程中FMDV抗原的含量提供了新方法。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）