李莊琦，薛千蓉，練秀霞，文 歡，鄺楊君，張俊清，李海龍，王舒婷

（1.熱帶藥物創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心；海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室；海口市黎族醫(yī)藥重點實驗室；海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口570100；2.海南普利制藥股份有限公司，海南 海口 570100）

高良姜為姜科山姜屬植物高良姜（Alpinia officinarumHance）的干燥根莖，味辛，性熱，歸脾、胃經(jīng)，具有溫胃止嘔、散寒止痛的功效［1］。最早記載于《名醫(yī)別錄》［2］，廣泛分布于我國廣西、海南、廣東等省區(qū)。高良姜素從姜科植物高良姜的干燥根莖中分離而得，作為一種天然的黃酮類化合物是高良姜的主要活性成分［3］。近年來藥理研究表明，其具有抗胃潰瘍、抗胃腸道出血、抗腫瘤、抗炎等作用［4-7］。廣藿香為唇形科植物廣藿香（Pogostemon cablin（Blanco） Benth），辛溫，歸脾胃、肺經(jīng)。最早記載于《名醫(yī)別錄》［2］，廣泛分布于廣東、廣西及海南等地。廣藿香酮是廣藿香的主要活性成分［8］。藥理研究表明，廣藿香酮具有化濕、解暑、止嘔、調(diào)節(jié)胃腸道、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［9-12］，且藿香正氣軟膠囊在臨床上曾被用于治療糖尿病胃輕癱［13］。2020版《中國藥典》記載，高良姜溫胃平逆，行氣導(dǎo)滯，廣藿香芳香化濁，和中止嘔。兩味中藥均歸于脾胃經(jīng)，二者配伍針對糖尿病胃輕癱功效協(xié)同且相輔相成。課題組目前正在采用現(xiàn)代藥理學(xué)技術(shù)進行高良姜-廣藿香配伍溶液針對糖尿病胃輕癱的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制研究。研究表明，配伍有高良姜、廣藿香兩味中藥的胃病膠囊對寒凝氣滯所致胃脘疼痛療效尤好，并具有溫胃散寒、理氣止痛之功效［14，15］。因此，本研究采用現(xiàn)代色譜技術(shù)，從薄層色譜鑒別、主要指標(biāo)性成分含量測定等方面較系統(tǒng)研究高良姜-廣藿香溶液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為高良姜-廣藿香今后的健康產(chǎn)品及新藥研發(fā)、中西醫(yī)結(jié)合臨床治療疾病奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ULtiMate 3000 液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-20D 暗箱式紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；良平儀器FA2204 電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；梅特勒XS105DU電子分析天平（梅特勒公司）；高效薄層硅膠板GF254（青島海洋化工廠分廠、上海盛亞化工有限公司、煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠分廠、青島鼎康有限公司、青島海浪硅膠干燥劑有限公司）。

1.2 試劑與試藥

高良姜素對照品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，純度≥98.0%），廣藿香酮對照品（阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98%）；高良姜配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），廣藿香配方顆粒（廣東一方制藥有限公司）；水為超純水，甲醇、磷酸都為色譜純，其余試劑都為分析純。

1.3 方法

1.3.1 高良姜-廣藿香配伍溶液薄層鑒別項的建立 配伍溶液的制備：稱取高良姜、廣藿香配方顆粒，各0.5 g，加入5 mL 乙酸乙酯超聲10 min，離心溶解后取上清液，作為高良姜素薄層鑒別用的配伍溶液。稱取高良姜、廣藿香配方顆粒，各0.5 g，加入2 mol/L 氫氧化鈉溶液3 mL，用2 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至2.0，再用6 mL 溫度為60℃～90℃的石油醚提取，振搖分取石油醚層，濃縮至0.5 mL，作為廣藿香酮薄層鑒別用的配伍溶液。

對照品溶液的制備：精密稱定高良姜素對照品，加乙酸乙酯配制濃度為4.00 mg/mL 的高良姜素對照品溶液。精密稱定廣藿香酮對照品，加石油醚配制濃度為3.50 mg/mL 的廣藿香酮對照品溶液。

高良姜素薄層鑒別方法：依據(jù)2020 年版《中國藥典》薄層色譜法進行試驗，取對照品溶液、配伍溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，石油醚-乙酸乙酯（5∶3）為展開劑，展開，取出并晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，置于105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視［16］。

廣藿香酮薄層鑒別方法：依據(jù)2020 年版《中國藥典》薄層色譜法進行試驗，對照品溶液、配伍溶液各4 μL，分別點于同一高效薄層硅膠板上，石油醚-乙酸乙酯（5∶1）為展開劑，展開，取出并晾干，以5%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑，加熱至斑點顯色清晰即可［16］。

專屬性試驗：分別吸取高良姜素或廣藿香酮對照品溶液、高良姜-廣藿香配伍溶液及空白溶液（乙酸乙酯或石油醚），點于同一硅膠G 薄層板（或高效硅膠G 薄層板）上，按上述高良姜素和廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分的薄層鑒別方法進行專屬性試驗，記錄薄層色譜圖。

穩(wěn)定性試驗：按上述高良姜素和廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分的薄層鑒別方法，分別制備高良姜素或廣藿香酮對照品溶液、高良姜-廣藿香配伍溶液及空白溶液（乙酸乙酯或石油醚），制備后于0、2、4、6 d分別吸取高良姜素或廣藿香酮對照品溶液、高良姜-廣藿香配伍溶液、空白溶液（乙酸乙酯或石油醚）各溶液4 μL，點于硅膠G 薄層板或高效硅膠G 薄層板上，記錄薄層色譜圖。

耐用性試驗：選擇相同點樣方式、不同廠家薄層板的試驗方法進行考察，高良姜素的薄層鑒別試驗選擇青島海洋化工廠分廠G 硅膠板、青島鼎康有限公司G 硅膠板以及青島海浪硅膠干燥劑有限公司G 硅膠板3 個廠家；廣藿香酮的薄層鑒別試驗選擇青島海洋化工廠分廠GF254 硅膠板、上海盛亞化工有限公司GF254 硅膠板及煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司GF254 硅膠板3 個廠家，點樣后記錄薄層色譜圖。

高良姜-廣藿香配伍溶液薄層鑒定：取高良姜、廣藿香配方顆粒，根據(jù)“配伍溶液制備方法”配制以上2 味中藥1∶1 的配伍溶液10 批，按照以上薄層鑒別方法點樣，記錄薄層色譜圖。

1.3.2 高良姜-廣藿香配伍溶液高效液相色譜法含量測定項的建立 配伍溶液的制備：精密稱定高良姜和廣藿香配方顆粒各1.0 g，置容量瓶中，加入5 mL 甲醇，密塞并稱定質(zhì)量，超聲10 min 后放冷，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，靜置后取上清液，濾過，取續(xù)濾液［16，17］，即得高良姜-廣藿香配伍溶液。

混合對照品溶液制備：分別精密稱取高良姜素、廣藿香酮對照品，加甲醇配制成含高良姜素4.40 mg/mL 及廣藿香酮3.02 mg/mL 的混合對照品溶液。

色譜條件：Ultimate XB-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸（B），檢測波長為310 nm，梯度洗脫（0～5 min，45% A；5～15 min，45% A→55% A；15 min～25 min，55%A；25～45 min，55% A→90% A；45～50 min，90%A；50～55 min，90% A→45% A；55～60 min，45%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL［18，19］。

專屬性試驗：依次吸取空白溶液（甲醇）、配伍溶液及混合對照品溶液各10 μL，按照色譜條件進樣并記錄色譜圖［18］。

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對照品溶液，配制高良姜素質(zhì)量濃度分別為：10、20、100、200、500、1 000 μg/mL 的6 個濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；廣藿香酮質(zhì)量濃度分別為：10、20、80、160、320、640 μg/mL 的6個濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進樣10 μL［18］，記錄色譜圖。

精密度試驗：取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次并記錄色譜圖。

穩(wěn)定性試驗：精密稱取供試品，配制配伍溶液，取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，分別在0、1、2、4、6、8、24 h 不同時間點進樣10 μL 測定［18］，記錄色譜圖。

重復(fù)性試驗：取同一批次高良姜和廣藿香顆粒，配制6 份配伍溶液，每份配伍溶液取10 μL 溶液測定［18］，記錄色譜圖。

加樣回收試驗：精密稱定高良姜、廣藿香顆粒各1.0 g，置容量瓶中，加入甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，靜置，后取上清液，濾過，取續(xù)濾液［16，17］即得高良姜-廣藿香配伍溶液。精密吸取9 份已知含量的配伍溶液，分別精密加入低、中、高不同的濃度混合對照品溶液，每個濃度梯度3 份，各取10 μL 溶液進樣測定［18］，記錄色譜圖、計算加樣回收率。

高良姜-廣藿香配伍溶液的含量測定：取10 批不同批次高良姜-廣藿香顆粒，配制配伍溶液，進樣測定并記錄色譜圖［18］。

2 結(jié)果

2.1 高良姜-廣藿香配伍溶液薄層色譜鑒別項結(jié)果

專屬性考察結(jié)果：由圖中可見，在與高良姜素對照品溶液（1 號）斑點相對應(yīng)的位置（Rf 為0.64），高良姜素薄層鑒別用的配伍溶液所呈現(xiàn)的斑點與對照品溶液顏色和位置一致，且空白溶液在相應(yīng)位置未出現(xiàn)相同顏色的斑點，表明該方法專屬性良好；廣藿香酮對照品溶液（1 號）斑點相對應(yīng)的位置（Rf 為0.59）廣藿香酮薄層鑒別用的配伍溶液所呈現(xiàn)的斑點與對照品溶液所呈現(xiàn)的顏色和位置一致，且空白溶液在相應(yīng)位置未出現(xiàn)相同顏色的斑點，表明該方法專屬性良好。見圖1、2。

圖1 高良姜素專屬性考察結(jié)果Fig 1 Specific results of galangin

圖2 廣藿香酮專屬性考察結(jié)果Fig 2 Specific results of pogostone

穩(wěn)定性考察結(jié)果：由圖中可見，取高良姜素薄層鑒別用的配伍溶液于0、2、4、6 d 點樣，斑點清晰可見，分離度較好，表明供試品溶液在6 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。見圖3。

圖3 高良姜素穩(wěn)定性考察結(jié)果Fig 3 Stability inspection results of galangin

由圖中可見，廣藿香酮薄層鑒別用的配伍溶液于0、2、4、6 d 點樣，斑點清晰可見，分離度較好，表明供試品溶液在6 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。見圖4。

圖4 廣藿香酮穩(wěn)定性考察結(jié)果Fig 4 Stability inspection results of pogostone

耐用性考察結(jié)果：采用不同廠家薄層板進行耐用性考察，在高良姜素薄層鑒別用的配伍溶液色譜圖中，與高良姜素對照溶液斑點相應(yīng)的位置，均顯示相同顏色的斑點，且斑點清晰可見，說明該薄層鑒定方法耐用性良好。見圖5。

圖5 耐用性考察結(jié)果Fig 5 Serviceability results

采用不同廠家薄層板進行耐用性考察，在廣藿香酮薄層鑒別用的配伍溶液色譜圖中，與廣藿香酮對照溶液斑點相應(yīng)的位置，均顯示相同顏色的斑點，且斑點清晰可見，說明該薄層鑒定方法耐用性良好。見圖6。

圖6 耐用性考察結(jié)果Fig 6 Serviceability results

高良姜-廣藿香配伍溶液的薄層鑒別：綜合性價比等考慮，選擇青島海洋化工廠分廠G 硅膠板及GF254 硅膠板。研究表明，與對照品斑點相應(yīng)的位置，2 種供試品溶液色譜圖中均顯示相同顏色的斑點。見圖7、8。

圖7 高良姜素薄層鑒別結(jié)果Fig 7 TLC results of galang

圖8 廣藿香酮薄層鑒別結(jié)果Fig 8 TLC results of pogoston

2.2 高良姜-廣藿香配伍溶液HPLC 分析方法含量測定項的結(jié)果

專屬性考察試驗：配伍溶液在混合對照品溶液高良姜素和廣藿香酮峰的保留時間處有色譜峰，而空白溶液在該保留時間未出現(xiàn)色譜峰，實驗結(jié)果表明所選溶劑對測定沒有干擾，說明本方法專屬性強。見圖9。

圖9 專屬性考察結(jié)果Fig 9 Specific results

線性關(guān)系考察試驗：以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X軸），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y 軸）進行線性回歸，得到高良姜素、廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分的回歸方程分別為：y=0.448 x+0.634 8，R2=0.999 0 和y =0.675 x-1.285 2，R2 = 0.999 9。結(jié)果表明：高良姜素、廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分分別在10.00～1 000.00 μg/mL、10.00～640.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖10。

圖10 線性關(guān)系考察結(jié)果Fig 10 Standard curve

精密度考察試驗：高良姜素和廣藿香酮混合對照品溶液連續(xù)6 次進樣，測得該2 種指標(biāo)性成分的峰面積，RSD 分別為0.63%和0.56%，符合要求，結(jié)果表明：該研究所建立的方法精密性良好。見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果Tab 1 Precision test results

穩(wěn)定性考察試驗：根據(jù)1.3.2 項配制高良姜-廣藿香配伍溶液，設(shè)置不同時間點進樣，檢測高良姜-廣藿香配伍溶液中高良姜素和廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分的峰面積，RSD 分別為1.82%、0.24%，符合要求。結(jié)果表明：該研究所建立的檢測方法穩(wěn)定可行。見表2。

表2 高良姜-廣藿香配伍溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 2 Stability test results

重復(fù)性考察試驗：根據(jù)1.3.2 項配制高良姜-廣藿香配伍溶液6 份分別進樣，其中高良姜素、廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分的平均濃度分別為283.550 5 μg/mL、67.013 9 μg/mL，RSD 分別為1.30%、0.89%，符合要求。結(jié)果表明：該研究所建立的檢測方法重復(fù)性良好。見表3。

表3 高良姜-廣藿香配伍溶液重復(fù)性試驗結(jié)果（μg/mL）Tab 3 Repeatability test results（μg/mL）

加樣回收試驗：根據(jù)1.3.2 項配制高良姜-廣藿香配伍溶液9 份，分別加入高良姜素、廣藿香酮高、中、低各3 份對照品，測得平均回收率分別為103.19%及100.87%、RSD 分別為0.93%及0.4%，符合要求；結(jié)果表明：該研究所建立的檢測方法回收率良好，準(zhǔn)確可靠。見表4。

表4 高良姜-廣藿香配伍溶液回收試驗結(jié)果（n=9）Tab4 Recovery rate test results（n=9）

用高良姜、廣藿香2 種顆粒劑1∶1 配伍，根據(jù)1.3.2 項配制高良姜-廣藿香溶液10 批，采用以上所建立的HPLC 分析方法，進行其中2 種指標(biāo)性成分的含量檢測。結(jié)果表明：高良姜-廣藿香配伍溶液中指標(biāo)性成分高良姜素、廣藿香酮含量平均值分別為292.14 μg/mL、76.85 μg/mL，以平均含量的80%為下限，規(guī)定高良姜-廣藿香配伍溶液中高良姜素的含量應(yīng)不低于233.71 μg/mL、廣藿香酮含量應(yīng)不低于61.48 μg/mL。見表5。

表5 高良姜-廣藿香配伍溶液中指標(biāo)性成分含量(μg/mL)Tab 5 Sample Content Determination(μg/mL)

3 討論

該研究就高良姜和廣藿香兩味中藥配伍溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行，為今后對以上兩味中藥研發(fā)產(chǎn)品質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。按照《中國藥典》目前對于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，一般選擇每味中藥一個特征性成分作為薄層鑒別項及含量測定項建立的指標(biāo)性成分。2020 版《中國藥典》中藥高良姜質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分選擇高良姜素、中藥廣藿香質(zhì)量控制指標(biāo)性成分選擇廣藿香醇，但是研究發(fā)現(xiàn)高良姜素、廣藿香醇兩種成分無法實現(xiàn)在一個色譜條件下出現(xiàn)。文獻研究表明：廣藿香酮也是廣藿香中主要活性成分［8］。經(jīng)過反復(fù)實驗研究發(fā)現(xiàn)廣藿香酮可以與高良姜素實現(xiàn)在一個色譜條件下出現(xiàn)。按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定科學(xué)性可行性的原則，該研究選擇高良姜素和廣藿香酮兩種單體成分作為高良姜和廣藿香兩味中藥配伍溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的指標(biāo)性成分合理可行，符合最新版《中國藥典》對于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

對于高良姜-廣藿香配伍溶液的質(zhì)量控制，在高良姜素的薄層鑒別項中，通過比較石油醚-乙酸乙酯、環(huán)己烷-乙酸乙酯、環(huán)己烷-丙酮等不同展開系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，展開劑為石油醚-乙酸乙酯（5∶3）時，被測成分（高良姜素）的斑點清晰，與其它成分完全分離。廣藿香酮的薄層鑒別項中，通過比較石油醚-乙酸乙酯、環(huán)己烷-丙酮、石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸等不同展開系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，展開劑為石油醚-乙酸乙酯（5∶1）時，斑點清晰，呈現(xiàn)的結(jié)果更佳。在含量測定方法的建立過程中，通過全波長掃描，顯示310 nm 波長下2個色譜峰峰形最好，故選擇 310 nm 為檢測波長；在樣品制備中，分別考察了乙醇、乙酸乙酯、甲醇為溶劑時樣品中高良姜素、廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分的含量，結(jié)果顯示，以甲醇為溶劑時2 種成分色譜峰峰面積最高；分別考察了0.1% 磷酸水溶液-甲醇、0.2%磷酸水溶液-甲醇、0.2 磷酸水溶液-乙腈3 種流動項系統(tǒng)的影響，結(jié)果以0.2%磷酸水溶液-甲醇為流動相時，高良姜素、廣藿香酮2 個指標(biāo)性成分色譜峰峰型及分離度良好，均符合要求。

本研究在進行專屬性、穩(wěn)定性及耐用性考察符合要求的的基礎(chǔ)上，建立了高良姜-廣藿香配伍溶液的薄層色譜鑒別項；同時，對高良姜-廣藿香配伍溶液中高良姜素、廣藿香酮2 種指標(biāo)性成分分析高效液相色譜法進行專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)度以及回收率進行考察，在符合要求的基礎(chǔ)上建立了該配伍溶液的高效液相色譜法含量測定項。綜上，已建立的高良姜-廣藿香配伍溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究方法，可用于高良姜-廣藿香配伍溶液的質(zhì)量控制，本研究為今后該兩味特色南藥健康產(chǎn)品及新藥研發(fā)、中西醫(yī)結(jié)合臨床治療疾病奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

作者貢獻度說明：

李莊琦：補充薄層色譜圖，處理數(shù)據(jù)，對論文進行修改；薛千蓉：設(shè)計實驗方案、負(fù)責(zé)薄層色譜實驗以及論文起草；練秀霞：負(fù)責(zé)含量測定方法學(xué)驗證并對數(shù)據(jù)進行分析；文歡、鄺楊君：負(fù)責(zé)實驗材料的購買和處理薄層色譜圖；張俊清：提供研究經(jīng)費、實驗儀器及場地；王舒婷，李海龍：指導(dǎo)實驗、指導(dǎo)論文攥寫及修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。