曠珊珊，張耀文，趙 娜，楊藝欣，解繼勝

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）是一種常見但慢性的全身性代謝性疾病，嚴重影響女性的生活質(zhì)量。隨著全球預(yù)期壽命的延長，PMOP 已成為主要的公共衛(wèi)生問題［1］。女性絕經(jīng)期有其特殊的生理特點，例如，中醫(yī)中的“天癸竭”癥狀與更年期女性雌激素合成和分泌逐步減少等所導(dǎo)致的機體變化相似，而更年期雌激素合成和分泌減少是導(dǎo)致 PMOP 的主要原因［2］，這一時期的婦女容易出現(xiàn)腎功能障礙和肝郁?！案斡簟笔墙^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的特殊機制。［3］，故 疏 肝 理 氣 是PMOP 治 療 中 必 須 重 視 的 環(huán)節(jié)。肝虛不藏血，筋弱不激骨，肝主筋司運動，骨痹的發(fā)病與肝臟關(guān)系密切。逍遙丸具有疏肝解郁療效，然而逍遙丸治療骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）的具體作用機制尚不明確。因此，在本研究中，為了給闡明OP 治療的作用機制提供參考，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測了OP 治療的潛在靶點通路，根據(jù)預(yù)測結(jié)果著手于AGEs/RAGE 信號通路關(guān)鍵蛋白 rage、IL-6 的表達，以及成骨細胞早期特異性標志物堿性磷酸酶（ALP）和骨細胞外基質(zhì)的主要成分COL-1觀察 OP 對小鼠骨組織的治療效果，并通過動物實驗驗證了預(yù)測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL /6 小鼠，年齡10～12 周、SPF 級、體重（22±2） g ，購自廣東省維通利華有限公司（SCXK（粵）2022-0063），飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF 級動物實驗中心（許可證號：SYXK 桂2022-0004），實驗動物的生長溫度保持在24 ℃～26 ℃，相對濕度保持在55%～60%。實驗過程嚴格遵守動物實驗中心以及使用指南進行，研究方案獲得了右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的批準（批號：2022101502）。

1.2 實驗試劑

75%酒精、戊巴比妥鈉、生理鹽水、逍遙丸（購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）、4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1110）；RAGE 抗體（稀釋比例1∶300 Rabbit： bs-4999R）、IL6 抗體（稀釋比例1∶300 Rabbit： bs-0782R）、COL-1 抗體（稀釋比例1∶200 Rabbit： bs-10423R）、ALP 抗體（稀釋比例1∶200 Rabbit： A0514）、免疫顯色試劑（MaxVision-HRP 鼠/兔）（ KIT-5030 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、Ultra DAB 顯色試劑盒（ DAB-4033 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、蘇木精-伊紅（ HE）染色試劑盒（G1120，索萊寶）；熒光倒置顯微鏡（2015236500，Leica DMI3000B）。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

通過參考近幾年的文獻資料，選擇利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫［4］對“逍遙丸”藥物成分及相關(guān)靶點進行了搜集與分析，篩選出口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18［4］的有效成分，搜集其相關(guān)靶標，而后，使用關(guān)鍵詞“osteoporosis”在Gene-Cards 等數(shù)據(jù)庫［5］中收集了“骨質(zhì)疏松癥”的疾病靶點，并通過刪除重復(fù)靶點在 Unitprot 數(shù)據(jù)庫中進行了歸一化處理。然后，使用在線制圖工具 Venny 2.1.0 生成韋恩圖，以獲得藥物-疾病交叉靶點，使用生物信息學(xué)分析軟件 Cytoscape 3.6.1［6］繪制活性成分、成分相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，其中，“節(jié)點”分別代表成分、靶點，“邊”代表節(jié)點之間的相互關(guān)系。最后利用DAVID數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病交叉靶點進行了GO 及KEGG富集分析［6］，即基于不同的分類思想而儲存的基因相關(guān)功能。而后，利用 imageGP 在線繪圖軟件繪制了氣泡圖，對前 20 個 GO 生物功能和前 30 個KEGG 信號通路富集結(jié)果進行可視化分析，并將富集結(jié)果按P值從低到高進行排序。

1.4 動物模型的建立

實驗小鼠經(jīng)7 d 適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為4 組，分別為假手術(shù)組（Sham）、模型組（Ovx）、逍遙丸高濃度組及低濃度組。實驗小鼠以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，采用75%乙醇進行局部消毒，通過雙側(cè)卵巢摘除法給模型組與藥物組小鼠造模，假手術(shù)組切除卵巢附近少量脂肪組織作為對照。術(shù)后對小鼠給予大慶霉素消毒3 d 預(yù)防感染。

1.5 給藥方法

根據(jù)徐叔云主編《藥理實驗方法學(xué)》，進行人與動物劑量換算，逍遙丸以成人9 g 為1 劑的量，則小鼠中劑量為9 g/60 kg×9.1=1.365 g/kg，低劑量為0.683 g/kg，高劑 量為2.73 g/kg，每組8 只，每日1次，連續(xù)喂藥12 周。假手術(shù)組和模型組每天接受一次生理鹽水，生理鹽水量根據(jù)動物體重而定，每日1次，持續(xù)12 周。

1.6 HE 染色

根據(jù)說明書操作，將卵巢樣本進行染色并拍照觀察；小鼠股骨經(jīng)EDTA 脫鈣脫鈣液處理1 月后，對小鼠股骨進行 HE 染色。

1.7 Micro CT

將不同組別小鼠的股骨標本周圍的肌肉和韌帶剔除，并在4%多聚甲醛中固定24 h，骨組織晾干后送右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 Micro-CT 室進行骨組織掃描，以獲得三維顯微 CT 數(shù)據(jù)。

1.8 免疫組化

將保存的小鼠蠟塊進行6 μm 厚連續(xù)性切片，以70 ℃～72 ℃烤片30～60 min 為宜，脫蠟8 min/3 缸，梯度乙醇3 min/每缸，流水沖洗1 min，蒸餾水中浸泡待用，而后高壓修復(fù)，蒸餾水清洗后3%過氧化氫室溫孵育，蒸餾水清洗干凈，PAP 筆畫圈，PBS 清洗3 min/3 次，一抗過夜，PBS 緩沖液沖洗，滴加二抗室溫孵育15 min，PBS 緩沖液洗3 min/3 次，DAB 現(xiàn)配現(xiàn)用，孵育3～5 min，自來水終止，再HE 復(fù)染，鹽酸酒精液分化，氨水返藍，流水沖洗3 min，梯度乙醇脫水，每缸3 min，透明3 min，中性樹膠固封。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用 Prism 9 軟件進行分析，以均數(shù)±標準差（±s） 表示，多組間比較使用方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逍遙丸活性成分及作用靶點

根據(jù)OB≥30% 且DL≥0.18 的標準 ，用TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行篩選，得到逍遙丸活性成分122個。其 中 薄 荷9 個，當 歸2 個，白 芍6 個，白 術(shù)4 個，柴胡11 個，茯苓6 個，甘草82 個，生姜2 個，見表1。

表1 部分中藥成分Tab 1 Some components of traditional Chinese medicine

2.2 “中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，獲得了OP 靶點1 225個，將有效成分靶點與疾病靶點的交叉點繪制成韋恩圖，如圖所示1。根據(jù)OP 靶點與逍遙丸活性成分的相互作用，采用 Cytoscape 軟 件構(gòu)建 “中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示逍遙丸中甘草、薄荷、生姜等多種活性成分可調(diào) 節(jié) 多 個 靶 點，如CAMKMT、GSK3B、PTGS1、ESR1 等，體現(xiàn)了逍遙丸其多靶點、多成分協(xié)同調(diào)控OP 的作用。

2.3 GO 功能及 KEGG 通路富集分析

在GO 富集分析中，可視化結(jié)果如圖3 所示，共得到條目 1 358 個，其中包括 25 個CC 條目、85 個MF 條目、1 248 個 BP 條目。根據(jù)GO 功能分析結(jié)果預(yù)測，重點靶點主要與外部刺激的反映、對細胞外刺激的反映、對營養(yǎng)水平的反映等有關(guān)。 如圖4所示為KEGG 富集分析結(jié)果，可富集得到 114 個信號通路，主要包括AGES/RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路和MAPK 信號通路等，提示逍遙丸可通過多條信號通路對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮治療作用。

2.4 去卵巢小鼠模型建立及評價

2.4.1 摘除卵巢組織 在小鼠背部兩側(cè)的雙側(cè)縱切口處摘取粉紅色卵巢進行HE 染色，如果在顯微鏡下能清楚地看到初級卵泡、次級卵泡等，則表明卵巢已順利摘除。結(jié)果見圖5。

2.4.2 卵巢組織摘除前后 Micro-CT 對比 與Sham 組小鼠相比，Ovx 組小鼠的股骨骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不完整，骨髓腔部分空虛，骨皮質(zhì)變薄。Sham組小鼠的股骨骨小梁數(shù)量豐富、連續(xù)性好、骨髓腔縮小。結(jié)果見圖6。

2.4.3 卵巢組織摘除前后骨組織結(jié)構(gòu)變化 HE 染色結(jié)果顯示，在Sham 組小鼠的股骨組織中，骨小梁排列緊密、連續(xù)性好、各骨小梁之間縫隙較小、罕見斷裂、骨髓腔大小正常。與 Sham 組相比，Ovx 組小鼠的股骨排列稀疏，骨小梁斷裂嚴重，連續(xù)性被破壞，骨髓腔明顯增大，呈典型骨質(zhì)疏松改變。結(jié)果見圖7。

2.5 逍遙丸干預(yù)后結(jié)果

2.5.1 逍遙丸對小鼠行為學(xué)影響 本次試驗期間，除OVX 組外，其余小鼠生活習(xí)性正常，毛發(fā)顏色正常，活動能力強，健康狀況良好；每只小鼠的尿液和糞便在模型實驗后一周內(nèi)恢復(fù)正常，未出現(xiàn)小鼠咬傷，創(chuàng)口感染，胃腸道梗阻，縫合線脫落，切口皮膚壞死或小鼠死亡；灌胃試驗中沒有出現(xiàn)腹部水腫和喉穿孔；整個試驗期間小鼠的飲食，生活，精神狀態(tài)均較好。模型組（Ovx 組）易脫毛，毛的顏色變暗，活動度降低，反射變長，排泄增加，進食飲水減少。

2.5.2 藥物干預(yù)后小鼠影像學(xué)指標檢測 與Sham組相比，OVX 組小鼠股骨的骨小梁稀疏、斷裂、骨皮質(zhì)變薄。與OVX 組相比，高劑量逍遙丸組小鼠骨小梁少許斷裂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)恢復(fù)，骨髓腔部分縮小程度明顯，而低劑量逍遙丸組雖然有骨小梁增多，骨髓腔縮小，但仍有骨小梁斷裂現(xiàn)象；假手術(shù)組骨小梁結(jié)構(gòu)更具連續(xù)性和完整性。結(jié)果見圖8。

2.5.3 藥物干預(yù)后小鼠病理切片HE 染色 Sham組股骨組織結(jié)構(gòu)致密、為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且排列規(guī)則、骨髓腔大小正常且連續(xù)性強，鄰近骨小梁間的間距相對較小。與Sham 組相比，OVX 組股骨皮質(zhì)和骨松質(zhì)均出現(xiàn)缺損，骨小梁減少，間隙變大，連續(xù)性中斷，結(jié)構(gòu)變稀疏，骨髓腔增寬，骨皮質(zhì)變薄。逍遙丸（高，低）組組小鼠股骨中骨小梁的結(jié)構(gòu)較模型組基本完好、間距縮小、連接增加，骨髓腔縮小、結(jié)構(gòu)更致密。結(jié)果見圖9。

2.5.4 藥物干預(yù)后各組的免疫組化結(jié)果 免疫組化的結(jié)果顯示，ALP，COL-1，IL-6 以及 RAGE 蛋白的表達陽性反應(yīng)為骨組織上呈棕黃色或者黃色顆粒。在藥物干預(yù)下，藥物組的ALP，COL-1 陽性顆粒表達增多，IL-6，RAGE 陽性顆粒減少。藥物組的 ALP 的平均光密度值均高于模型組，逍遙丸（高，低）組有顯著性差異（P＜0.05）。藥物組的COL-1 的平均光密度值高于模型組，逍遙丸（高，低）組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。藥物組的IL-6 的平均光密度值均低于模型組，逍遙丸（高，低）組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。藥物組的RAGE 平均光密度均低于模型組，其中，逍遙丸（高，低）組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果見圖10。

圖1 逍遙丸-骨質(zhì)疏松癥交集靶點及韋恩圖Fig 1 Xiaoyao pill-osteoporosis intersection targets and wayne diagram

圖2 逍遙丸治療骨質(zhì)疏松癥“有效成分 - 作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of "active ingredient-target" of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis

圖3 逍遙丸治療骨質(zhì)疏松癥作用靶點的 GO 分析Fig 3 GO analysis of the target of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis

圖4 逍遙丸治療骨質(zhì)疏松癥作用靶點的 KEGG 富集分析Fig 4 KEGG enrichment analysis of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis

圖5 卵巢樣本 HE 染色（20×）Fig 5 HE staining of ovarian samples （20×）

圖6 Sham 組和Ovx 組小鼠股骨 Micro-CT 掃描結(jié)果Fig 6 Micro-CT scan results of femur in Sham and Ovx mice

圖7 兩組小鼠骨骺端骨組織形態(tài)對比（10×）Fig 7 Comparison of epiphyseal bone tissue morphology between two groups of mice （10×）

圖8 逍遙丸治療后各組小鼠股骨顯微CT 比較Fig 8 Comparison of femoral micro-CT of mice in each group after Xiaoyao pill treatment

圖9 逍遙丸治療后各組小鼠股骨切片HE 染色結(jié)果（10×）Fig 9 HE staining results of femoral sections of mice in each group after Xiaoyao pill treatment （10×）

圖10 免疫組織化學(xué)法檢測逍遙丸對骨質(zhì)疏松小鼠 AGES/RAGE 信號通路及成骨標記基因蛋白表達的影響（40×）Fig 10 Immunohistochemistry to detect the effect of Xiaoyao pill on the protein expression of AGES/RAGE signaling pathway and osteogenic marker gene in osteoporosis mice （40×）

3 討論

PMOP 的主要病因為絕經(jīng)后婦女卵巢功能減退，雌激素減少分泌，骨礦物質(zhì)密度降低，從而引發(fā)了進行性骨流失，這是骨質(zhì)流失的主要原因，主要發(fā)生于中老年女性［7］。 因此，重要的是尋找可以改變或控制的因素以預(yù)防骨質(zhì)疏松癥［8］。

中醫(yī)對本病的病因病機及其治療研究日漸增多。骨痹的發(fā)生與肝有很大的聯(lián)系［9］。中醫(yī)理論認為，疏肝理氣，舒筋活絡(luò)，與四肢、肌肉和骨骼的強健密切相關(guān)，隨著年齡的增長，肝的藏血功能減退，精血生成不足，其次，中老年女性由于癸水耗損，容易出現(xiàn)肝氣郁結(jié)、陰火損傷，最終導(dǎo)致精血不足，或精血功能低下，骨絡(luò)失于濡養(yǎng)進而發(fā)生PMOP”［10］。提示在 PMOP 發(fā)病中，肝臟功能起著非常重要的作用。

傳統(tǒng)經(jīng)典婦科良藥逍遙丸以甘草、當歸、茯苓、芍藥、白術(shù)、柴胡等為主要原料，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，該方最早收錄于宋代《太平惠民和劑局方》。近年有報道稱其在體內(nèi)外均能刺激成骨細胞生成，而成骨細胞是骨的基石，人類骨骼系統(tǒng)生長發(fā)育與其活性及數(shù)量息息相關(guān)，成骨細胞隨年齡增加代謝逐漸降低，不敵骨吸收而終形成骨質(zhì)疏松癥。雷霞等［11］發(fā)現(xiàn)逍遙丸含藥血清對鼠成骨細胞株的增殖有明顯促進作用，成骨細胞作為骨形成的最重要的功能單元，其增殖和分化是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的重要手段，但其防治PMOP 具體作用機制尚不清楚。ALP 主要表達在骨鈣化區(qū)域，聯(lián)合水解酶作用磷酸酯釋放鈣以沉淀方式附著于膠原骨架上，有利于成骨［12］。骨代謝的微環(huán)境是骨基質(zhì)，其有機成分的90%為Ⅰ型膠原蛋白［13］。本文研究發(fā)現(xiàn)，藥物組小鼠免疫組化中ALP 及COL-1 蛋白表達水平均高于模型組，說明逍遙丸在改善骨質(zhì)疏松作用中可通過增加成骨基因指標來實現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，逍遙丸含藥血清體外可調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖與分化，且成骨細胞的增殖與雌激素受體密不可分［14］。雌激素可通過與雌激素受體結(jié)合直接作用于骨組織細胞，推動成骨細胞增殖和分化，促使破骨細胞凋亡并且抑制其活性，從而維持骨吸收與骨形成之間的平衡，保護骨組織［15］。本文研究中，Micro-CT 及HE 染色結(jié)果顯示去卵巢小鼠在逍遙丸干預(yù)后其骨質(zhì)程度相比于模型組明顯得到改善（骨小梁增多、斷裂減少、骨髓腔縮小明顯），因此推測逍遙丸可能是通過發(fā)揮雌激素樣骨保護作用增加成骨細胞活性，提高骨質(zhì)量從而增加ALP、COL-1 等成骨基因表達。

在關(guān)于逍遙丸靶向基因與骨質(zhì)疏松癥之間的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，共發(fā)現(xiàn)有114 條 KEGG 通路。在前 30 條KEGG 通路中，按P值遞增最高的為AGES/RAGE 信號通路。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）是一組通過非酶促反應(yīng)形成的分子。這些化合物與多種與年齡相關(guān)的疾病有關(guān)，其中包含骨質(zhì)疏松癥［16］。越來越多的證據(jù)表明，AGEs 及其受體 （RAGE） 系統(tǒng)會引發(fā)氧化應(yīng)激，隨后在血管壁細胞、成骨細胞和破骨細胞中引起炎癥反應(yīng)，此外，AGEs 在有機骨基質(zhì)中的交聯(lián)可能對骨的抗斷裂性產(chǎn)生不利影響，說明AGEs 對肌肉骨骼疾病也具有有害作用［17］。據(jù)報道，AGEs 會降低破骨細胞和成骨細胞的分化和功能，并抑制膠原的交聯(lián)活性，導(dǎo)致骨脆性增強［18］，晚期糖基化終產(chǎn)物受體 （RAGE）是免疫球蛋白家族中的一種跨膜蛋白，具有多個配體，并參與許多慢性疾病，例如糖尿病和 OP。 越來越多的證據(jù)表明，RAGE 信號的激活會對骨重塑產(chǎn)生負面影響。其配體，如晚期糖基化終產(chǎn)物 （AGEs）、S100、β-淀粉樣蛋白 （Aβ） 和高遷移率組盒 1（HMGB1），已被充分證明它們可能負向調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和分化，并正向刺激破骨細胞生成通過激 活 RAGE 的 表 達［19］。鑒 于 AGES/RAGE 信 號通路在骨重建和成骨細胞分化中的重要作用及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)kegg 富集分析結(jié)果，選擇AGES/RAGE信號通路在動物實驗中進行蛋白檢測，揭示防治OP 藥物的作用機制，以期為骨質(zhì)疏松的治療提供新思路。本文采用免疫組化法檢測小鼠股骨切片中AGEs-RAGE 通路中RAGE 蛋白及下游因子IL6 的表達，結(jié)果顯示藥物組小鼠中RAGE 及 IL6蛋白表達水平均低于模型組，說明逍遙丸可通過抑制AGEs-RAGE 通路，阻止其惡性循環(huán)，從而促進成骨細胞增殖而預(yù)防 OP 發(fā)生發(fā)展。

通過背部去勢法為小鼠摘除雙側(cè)卵巢［20］，成功建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，并且，在逍遙丸的干預(yù)下，小鼠骨小梁數(shù)量、連接密度均見提高，提示逍遙丸對骨質(zhì)疏松癥有較好的療效作用。綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實驗證實，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠采用逍遙丸干預(yù)后可顯著改善骨代謝，增加骨礦含量與骨度，機制可能與抑制 AGEs-RAGE 通路以及增加成骨因子ALP、COL-1 活性相關(guān)。本研究為逍遙丸在治療OP 相關(guān)疾病方面的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

作者貢獻度聲明：

曠珊珊、趙娜、楊藝欣：對研究的思路或設(shè)計有關(guān)鍵貢獻并且參與了研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程，張耀文、解繼勝：起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。