楊 飛,張亞銘,周潮平,汪大田,高 斌,馬 軍,湯代彬,袁建偉,王宇翔

(安慶市立醫(yī)院普外科,安徽安慶 246000)

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程,染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability,CIN)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的主要分子通路[1-2]。CIN是散發(fā)性結(jié)直腸癌的主要原因,而MSI被認(rèn)為是Lynch綜合征的遺傳誘因,同時(shí)其也參與了散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展,具有MSI的結(jié)直腸癌約占所有結(jié)直腸癌的15%[3]。MSI是錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)蛋白功能缺陷導(dǎo)致的結(jié)果,可以通過PCR檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)或免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)的表達(dá)來判斷,二者檢測(cè)結(jié)果的一致性可以達(dá)到95%以上,而免疫組織化學(xué)臨床簡(jiǎn)便易行,檢測(cè)成本低,較為容易開展[4-5]。檢測(cè)結(jié)直腸癌的MMR蛋白的狀態(tài)對(duì)于Lynch綜合征的診斷及結(jié)直腸癌的治療有重要作用。人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)2屬于ErbB/HER酪氨酸激酶家族,是多種癌癥的癌基因和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物,也是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)[6]。Ki-67是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的特異性指標(biāo),與腫瘤細(xì)胞增殖活性及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān),在各種研究中,Ki-67的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的相關(guān)性目前尚無定論[7-8]。

目前,國內(nèi)大部分醫(yī)院對(duì)結(jié)直腸癌常規(guī)行免疫組織化學(xué)來了解MMR蛋白表達(dá)情況,但大樣本量報(bào)道較少,且尚無同時(shí)檢測(cè)MMR蛋白、HER2和Ki-67的研究報(bào)道。本研究旨在探討MMR蛋白、HER2和Ki-67在可切除結(jié)直腸癌中的表達(dá)并揭示其與臨床病理特征的關(guān)系,為結(jié)直腸癌的臨床診療提供一定的參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年10月至2022年5月于本院普外科行手術(shù)治療的559例結(jié)直腸患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸腺癌;(2)臨床及病理資料完整;(3)有足夠的原發(fā)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè);(4)檢測(cè)結(jié)果包括MMR蛋白、HER2和Ki-67表達(dá)情況。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前接受新輔助化療、放療、免疫治療或分子靶向治療等抗腫瘤治療;(2)診斷時(shí)合并其他原發(fā)惡性腫瘤;(3)診斷為結(jié)直腸癌原位癌、鱗狀細(xì)胞癌或腺鱗癌。559例患者中男324例,女235例,年齡26～89歲,平均(68.01±10.41)歲,其中直腸癌患者248例,左半結(jié)腸癌患者142例,右半結(jié)腸癌患者169例。

1.2 方法

1.2.1資料收集

收集患者的臨床及病理資料,包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤大體類型、組織學(xué)分型(腺癌、黏液腺癌或印戒細(xì)胞癌)、組織學(xué)分級(jí)、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期及MMR蛋白、HER2、Ki-67的表達(dá)情況,TNM分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control,UICC)第8版TNM分期系統(tǒng)。

1.2.2結(jié)果判斷

(1)MMR蛋白表達(dá)判讀標(biāo)準(zhǔn):MLH1、MSH2、PMS2、MSH6表達(dá)均定位于細(xì)胞核,細(xì)胞核不著色即為表達(dá)缺失,細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒則判斷為陽性表達(dá)。其中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6任意蛋白表達(dá)缺失判定為表達(dá)缺陷(deficient mismatch repair,dMMR),4個(gè)蛋白均陽性表達(dá)判定為表達(dá)完整(proficient mismatch repair,pMMR)。(2)HER2表達(dá)判讀標(biāo)準(zhǔn):HER2表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞膜,根據(jù)染色結(jié)果評(píng)分為0、+、++、+++,其中0為腫瘤細(xì)胞無膜染色或<10%腫瘤細(xì)胞著色,+為≥10%腫瘤細(xì)胞團(tuán)微弱或隱約可見膜染色,++為≥10%腫瘤細(xì)胞團(tuán)有弱至中等強(qiáng)度的基底側(cè)膜、側(cè)膜染色,+++為≥10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜強(qiáng)染色[9]。因本院病理科前期未開展FISH檢測(cè),故本研究收集的病例中HER2++未行FISH檢測(cè)。(3)Ki-67表達(dá)判讀標(biāo)準(zhǔn):Ki-67表達(dá)定位于細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒視為陽性,根據(jù)染色結(jié)果評(píng)分為0、+、++、+++,其中0為陽性細(xì)胞數(shù)<10%;+為弱陽,即陽性細(xì)胞數(shù)10%～<25%;++為中等陽性,即陽性細(xì)胞數(shù)25%～≤75%;+++為強(qiáng)陽性,即陽性細(xì)胞數(shù)>75%。所有免疫組織化學(xué)結(jié)果均經(jīng)兩名高年資病理醫(yī)師共同判讀確認(rèn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,比較采用χ2檢驗(yàn);采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析相關(guān)性,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)情況

559例結(jié)直腸癌患者中43例(7.7%)為dMMR,見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)情況

2.2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者的MMR蛋白、HER2和Ki-67表達(dá)情況比較

559例結(jié)直腸癌患者中HER2 +++為8例(1.4%),Ki-67 +++為251例(44.9%)。不同年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、腫瘤大體類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的結(jié)直腸癌患者dMMR表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同腫瘤大體類型的結(jié)直腸癌患者HER2 ++/+++表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同組織學(xué)分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期的結(jié)直腸癌患者Ki-67 +++表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者的MMR蛋白、HER2和Ki-67表達(dá)情況比較

2.3 MMR蛋白與HER2和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,MMR蛋白與HER2、Ki-67表達(dá)均無相關(guān)性(P>0.05),見表3。

表3 MMR蛋白與HER2和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析[n(%)]

3 討 論

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,基于國家癌癥中心最新數(shù)據(jù),2016年中國的結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居第2,死亡率位居第4,較前有上升趨勢(shì)[10]。結(jié)直腸癌對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大威脅,了解其臨床病理特點(diǎn),可為臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。

MMR基因啟動(dòng)子的高甲基化導(dǎo)致散發(fā)性結(jié)直腸癌,而MMR或EpCAM基因的胚系突變與Lynch綜合征相關(guān),通過PCR檢測(cè)MSI或免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMR蛋白表達(dá)既可以篩查Lynch綜合征,又可以指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者的藥物使用,如5-氟尿嘧啶和程序性死亡受體-1(programmed cell death protein-1,PD-1)抑制劑[11]。若沒有分子實(shí)驗(yàn)室,診斷結(jié)直腸癌合并MSI通常依賴于MMR蛋白的免疫組織化學(xué)染色。本研究使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)559例結(jié)直腸癌MMR蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)dMMR占比為7.7%,與國內(nèi)幾項(xiàng)大樣本量研究[4,12]結(jié)果相一致,但低于歐洲[13],說明不同地域、種族MMR蛋白表達(dá)水平存在差異。本研究顯示,不同年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、腫瘤大體類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的結(jié)直腸癌患者dMMR表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與文獻(xiàn)[3,13]報(bào)道基本一致,具有典型的微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(microsatellite instability-high,MSI-H)的臨床和病理特征。目前,關(guān)于MMR狀態(tài)的性別分布存在爭(zhēng)議,LIANG等[14]研究表明dMMR在女性中更常見,而ARORA 等[15]研究則發(fā)現(xiàn)男女之間無差異,這與本研究結(jié)果一致。

在本研究dMMR患者中,以MLH1、PMS2聯(lián)合表達(dá)缺失(48.8%)最為常見,其次為MSH2、MSH6聯(lián)合表達(dá)缺失(18.6%)和PMS2單獨(dú)表達(dá)缺失(14.0%),這與XU等[3]研究結(jié)果一致。在結(jié)直腸癌中MLH1缺失是最常見的,多見于散發(fā)性病例,而由于PMS2與MLH1形成異源二聚體,因此MLH1的缺失也會(huì)導(dǎo)致PMS2的丟失。MLH1和PMS2同時(shí)缺失是dMMR結(jié)直腸癌最常見的類型,多由鋸齒狀病變通過鋸齒狀途徑進(jìn)展為結(jié)直腸癌,與MLH1啟動(dòng)子甲基化和BRAF突變相關(guān)[16]。MLH1啟動(dòng)子甲基化或胚系突變還可以導(dǎo)致PMS2的單獨(dú)突變,可以解釋本研究中的PMS2的高比例單獨(dú)表達(dá)缺失[17]。約70%的Lynch綜合征患者中發(fā)現(xiàn)MLH1和MSH2突變,由于MSH2與MSH6形成異源二聚體,因此MSH2的缺失也會(huì)導(dǎo)致MSH6的丟失,MSH2和MSH6的同時(shí)缺失在Lynch綜合征中很常見[18]。對(duì)本研究dMMR病例進(jìn)一步進(jìn)行胚系突變檢測(cè)或MLH1啟動(dòng)子甲基化、BRAF突變檢測(cè),能識(shí)別散發(fā)性結(jié)直腸癌和Lynch綜合征,應(yīng)特別鼓勵(lì)這部分患者進(jìn)行Lynch綜合征的遺傳咨詢和檢測(cè)。

HER2在乳腺癌和胃癌中都得到了很好的研究和臨床應(yīng)用,但對(duì)于HER2表達(dá)能否指導(dǎo)結(jié)直腸癌治療及評(píng)價(jià)預(yù)后尚未達(dá)成共識(shí),HER2在結(jié)直腸癌中的診斷價(jià)值也尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化。國外大樣本量研究發(fā)現(xiàn),HER2參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展,但HER2的過表達(dá)與患者總生存率和無病生存率無關(guān),HER2的預(yù)后價(jià)值仍存在爭(zhēng)議[19]。而本研究發(fā)現(xiàn),不同腫瘤大體類型的結(jié)直腸癌患者HER2 ++/+++表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有研究發(fā)現(xiàn),HER2在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率和臨床意義存在較大分歧,其報(bào)道的HER2陽性表達(dá)率為1%～50%,這與樣本量大小、標(biāo)本質(zhì)量和HER2陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)[20]。雖然本研究免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HER2表達(dá)嚴(yán)格按照指南界定[9],有8例(1.4%)為+++,但又由于有120例(21.5%)患者為++,對(duì)于這部分患者未行FISH檢測(cè),勢(shì)必影響研究結(jié)論。對(duì)于HER2與結(jié)腸直腸癌的生物學(xué)特征仍需進(jìn)一步研究,目前本課題組正在開展結(jié)直腸癌患者術(shù)前腸鏡小標(biāo)本及手術(shù)術(shù)后病理標(biāo)本HER2表達(dá)水平的前瞻性研究,以期闡釋這一類問題。

本研究結(jié)果顯示,不同組織學(xué)分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期的結(jié)直腸癌患者Ki-67 +++表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與其他研究[21-22]結(jié)果一致。有meta分析發(fā)現(xiàn),Ki-67的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后明顯相關(guān),其納入34項(xiàng)研究共6 180例結(jié)直腸癌患者,總生存率和無病生存率的合并風(fēng)險(xiǎn)比分別為1.54(P=0.005)、1.43(P=0.008),Ki-67的高表達(dá)預(yù)示著結(jié)直腸患者較差的總生存率和無病生存率[23]。

目前在結(jié)直腸癌領(lǐng)域缺乏對(duì)于MMR蛋白與HER2、Ki-67的聯(lián)合表達(dá)研究,本研究提示MMR蛋白的表達(dá)與HER2、Ki-67的表達(dá)在免疫組織化學(xué)蛋白表達(dá)水平上無相關(guān)性,這一結(jié)果說明三者在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中作用機(jī)制可能不同,需進(jìn)一步深入研究。對(duì)于晚期結(jié)直腸癌,同時(shí)檢測(cè)MMR蛋白和HER2,對(duì)于選用免疫治療或抗HER2靶向治療有指導(dǎo)意義。QIU等[24]采用二代測(cè)序檢測(cè)HER2基因突變或MSI-H的結(jié)直腸癌患者,發(fā)現(xiàn)攜帶HER2突變的MSI-H患者使用PD-1抑制劑的無進(jìn)展生存期明顯短于無HER2突變的患者。最近的一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于HER2陽性的難治性轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌,德曲妥珠單抗(DS-8201研究)顯示出強(qiáng)大和持久的抗腫瘤活性,其中包括接受過伊立替康和抗HER2靶向治療等兩種或兩種以上方法的患者[25]。在本研究中,dMMR患者未發(fā)現(xiàn)HER2 +++,因HER2 ++未行FISH檢測(cè),對(duì)于MMR蛋白和HER2在結(jié)直腸中的表達(dá)及意義尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究報(bào)道了行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者的dMMR檢出率及HER2、Ki-67表達(dá)陽性率,比較了三者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系,為進(jìn)一步的臨床治療及研究提供了基礎(chǔ)。但本研究也存在局限性:(1)未進(jìn)行MMR基因分析,故遺傳性和散發(fā)性病例的確切比例尚不清楚;(2)未對(duì)HER2 ++患者行FISH檢測(cè),僅從蛋白表達(dá)水平上探討二者相關(guān)性,存在一定的局限性;(3)本研究病例是近年來收集的,一些患者的隨訪時(shí)間不夠長,無法進(jìn)行生存分析,需進(jìn)一步的隨訪研究。