聶 萍,李 虎,朱宏濤,胡建國

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科,重慶 400010)

纖維化是多種臨床疾病的共同病理特征,常引起肺、肝及子宮等器官功能不全,導致臨床不良轉歸。研究表明,纖維化是組織損傷后修復反應失調的結果[1],和正常的傷口愈合反應機制基本相同,涉及多重病理生理反應過程:組織損傷后,成纖維細胞激活并分泌炎癥細胞因子,啟動傷口愈合反應;修復過程中,結締組織形成與沉積,細胞外基質(extracellular matrix,ECM)持續(xù)積累,導致組織破壞、器官功能障礙甚至衰竭;炎癥原因持續(xù)存在時,免疫細胞產生持久的細胞因子和酶,促進肌成纖維細胞活性,上調ECM致纖維化,但其發(fā)生、發(fā)展的具體調控網(wǎng)絡尚不十分清楚。近年來,單細胞基因組學的應用使臨床在纖維化組織生物學和疾病機制的探索方面有了新的見解,國內外越來越多的相關研究表明自噬在纖維化中發(fā)揮了重要作用,這為發(fā)現(xiàn)治療纖維化的自噬靶點,研究針對性的有效治療藥物提供了重要證據(jù)。自噬首次在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn),在真核生物中高度保守,是真核生物降解蛋白質的主要途徑之一。細胞在饑餓或受到刺激時,通過降解和再循環(huán)細胞內長壽胞質蛋白和細胞器等物質,維持細胞穩(wěn)態(tài)的分解代謝過程[2]。根據(jù)物質進入溶酶體的途徑不同,自噬分為3類,即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[3]。自噬過程包含自噬的啟動、自噬前體的延伸、自噬體的形成、自噬體和溶酶體的融合及物質的降解和再循環(huán)5個步驟[4],雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、UNC-51-樣激酶1復合物(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和自噬相關基因(autophagy-related gene,ATG)等關鍵分子參與其中。目前,臨床對自噬的過程有了較為一致的認識,但纖維化中自噬的具體分子機制仍待進一步探索,本本將總結自噬信號通路在纖維化病變中的研究進展。

1 自噬與肺纖維化

肺纖維化與特發(fā)性肺纖維化、囊性肺纖維化疾病及硅肺等多種肺部疾病有關。發(fā)病過程中,肺泡上皮細胞破壞、成纖維細胞和肌成纖維細胞過度增殖及活化,導致ECM沉積,最終破壞正常肺組織的結構和功能。研究提示,自噬參與多種病因所致的肺纖維化,病因及環(huán)境等不同均可對纖維化產生影響,可通過多條信號通路調節(jié)上述過程,干預肺纖維化的進展。

自噬活性減弱可促進肺纖維化。成纖維細胞CD148缺失小鼠暴露于博來霉素后,肺間質進一步增厚,增加p-PI3K、p-絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)、p-mTOR、p62的表達,減少LC3-Ⅱ的表達。此外,降低自噬通過增強p62/核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號軸來調節(jié)促纖維化基因的表達。該研究表明,CD148缺陷通過調節(jié)轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)/PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬,積累p62,并激活NF-κB導致纖維化進展[5]。瘦素處理后增加了A549細胞中α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(collagenase Ⅰ,COL1)和p62的表達,減少LC3的表達,也通過激活PI3K/Akt/mTOR通路參與自噬減弱,促進肺纖維化。上調PI3K/Akt通路可致mTOR激活增加,進而抑制自噬促進肺纖維化。此外,該信號通路還與WNT、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、TGF-β等一同參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展[6]。博來霉素暴露小鼠用鞣花酸治療后,降低了纖維化百分比;博來霉素處理后7/14 d后WNT3a、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)過表達,鞣花酸抑制了這一過表達效應;進一步實驗發(fā)現(xiàn)鞣花酸明顯降低了氯喹、巴菲霉素A1引起的p62表達增加,提高了WNT3a誘導的自溶體水平,促進了ATG16L1、LC3-Ⅱ及芐氯素1(Beclin1)的表達,Western blot顯示實驗組細胞中mTOR、核糖體S6(ribosome protein subunit 6,S6RP)磷酸化水平降低。這些結果提示鞣花酸可通過抑制WNT/mTOR信號通路,誘導自噬形成促進纖維化[7]。富亮氨酸重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)在人和小鼠纖維化肺及Ⅱ型肺泡上皮細胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells,AT2)中明顯下調,與對照組比較,實驗組p62累積量明顯增加,LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉化受損,自噬空泡減少,自噬嚴重受損;Western blot表明LRRK2缺失后細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活性明顯下降,提示LRRK2缺失可通過降低ERK、JNK信號通路損傷自噬參與纖維化的進程[8]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是細胞防御應激損傷的重要機制,蘇木精-伊紅染色發(fā)現(xiàn)博來霉素暴露小鼠肺部結構嚴重損傷,逆轉錄實時熒光定量PCR、Western blot顯示肺纖維化小鼠和肺成纖維細胞中LC3、Beclin1與Nrf2表達下降,Keap1與p62表達增加。研究提示Keap1/Nrf2通路參與自噬過程進而調控纖維化[9]。同樣,百草枯誘導的纖維化模型使用Nrf2抑制劑后,肺纖維化的作用影響減弱,表明Nrf2途徑參與自噬,減輕百草枯誘導的大鼠肺纖維化[10]。

部分研究表示自噬活性增強可促進肺纖維化。阿奇霉素治療后降低了成纖維細胞的COL1A1基因表達,阿奇霉素還能明顯降低前COL1A1蛋白、α-SMA蛋白和纖維連接蛋白(fibronectin,FN)表達,誘導LC3B陽性細胞積累并增加LC3-Ⅱ和p62表達,自噬活性降低,提示抑制自噬可發(fā)揮抗肺纖維化作用[11]。高氧損傷肺小鼠中觀察到肺間質增厚、肺組織纖維化增多和CX3C基序趨化因子受體1(CX3C motif chemokine receptor 1,CX3CR1)蛋白及mRNA上調。同時暴露于高氧環(huán)境的慢-CX3CR1小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、CD11b表達明顯增加,p62表達明顯降低,且CX3CR1定位于CD11b陽性細胞,使用Akt抑制劑后逆轉了上述改變。研究提示過表達CX3CR1可經Akt通路激活自噬加重纖維化[12]。

2 自噬與肝纖維化

病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及膽汁淤積等各種肝臟慢性疾病可引起肝細胞外基質異常增生和慢性肝損傷,引起肝纖維化,最終導致肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌。自發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟溶酶體并提出自噬這一概念以來,有關肝臟自噬方面的研究取得了較大進展。研究發(fā)現(xiàn),自噬與肝細胞代謝穩(wěn)態(tài)相關,自噬的紊亂、功能障礙在肝細胞病理改變和肝臟疾病中發(fā)揮作用[13],提示自噬可能成為肝纖維化治療的新方向。肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程復雜,涉及通路及細胞群繁多。肝星狀細胞是纖維化形成的關鍵細胞,受刺激后激活成為成纖維性的肌成纖維細胞,遷移到受損部位并分泌促炎、促纖維因子[14],提示自噬涉及肝纖維化作用機制中多條通路。

自噬活性增加可減少肝纖維化發(fā)生。小p97/VCP相互作用蛋白(small p97/VCP-interacting protein,SVIP)定位于肝細胞中,饑餓大鼠SVIP表達增加、自噬激活,減輕四氯化碳誘導的肝纖維化,ATG、Beclin1的表達與SVIP過表達呈正相關,推斷激活自噬可抑制肝纖維化。姜黃素能減少肝纖維損傷中的纖維結節(jié)和恢復肝細胞形態(tài),增加Beclin1、LC3、ATG7蛋白的表達。實驗中發(fā)現(xiàn),姜黃素上調腺苷5′-單磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)蛋白和mRNA表達,降低PI3K/Akt/mTOR表達。研究提示,姜黃素激活自噬抗肝纖維化過程可能與AMPK/PI3K/Akt/mTOR信號通路有關[15]。高脂飲食促進非酒精性脂肪性肝病形成,異甜菊醇鈉明顯減少了肝病面積,改變了肝形態(tài),第10周時COL1、COL3、TGF-β及α-SMA表達恢復到基線水平;進一步發(fā)現(xiàn)異甜菊醇鈉逆轉了沉默信息調節(jié)因子2相關酶1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1,SIRT1)、p-AMPK,表明異甜菊醇鈉通過AMPK/SIRT1途徑增強自噬調控肝纖維化[16]。

另有研究提示,自噬活性降低可減輕肝纖維化。消退素D1(resolvin D1,RVD1)處理后減少四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維小鼠中肝組織的破壞和膠原增生;使用RVD1后增加了p62的表達,降低了肝纖維小鼠和肝星狀細胞中LC3-Ⅱ、Beclin1水平與多種ATG的mRNA水平;進一步研究提示RVD1增加p-Akt、p-mTOR的表達,Akt、mTOR抑制劑處理后p62水平降低,Beclin1、LC3-Ⅱ水平提高。研究證實RVD1可通過激活Akt/mTOR信號通路來抑制自噬減輕肝纖維化[17]。丙二醇海藻酸鈉硫酸鈉能減少肝纖維化評分及α-SMA、COL1蛋白和mRNA的表達;對比CCl4和經膽管結扎(bile duct ligation,BDL)組,實驗組小鼠和肝星狀細胞中Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、信號轉導及轉錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)含量未見明顯改變,Beclin1、p-STAT3明顯減少,p62明顯增加,提示丙二醇海藻酸鈉硫酸鈉可抑制JAK/STAT通路發(fā)揮抗自噬作用,從而減輕肝纖維化[18]。對比BDL、CCl4組,實驗中見芹菜素處理組匯管區(qū)結構正?；?纖維組織和細胞排列紊亂明顯減少;芹菜素逆轉了BDL、CCl4組中Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的增加與p62的降低,同時逆轉了TGF-β1、Sma和Mad相關蛋白3(Sma-and Mad-related protein 3,Smad3)的激活與p38的磷酸化、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors α,PPARα)的減少。結果提示芹菜素可通過下調TGF-β1/Smad3和p38/PPARɑ途徑抑制自噬與肝纖維化的進展[19]。

3 自噬與腎纖維化

腎纖維化是慢性腎小球腎炎、間質性腎病及糖尿病腎病等多種慢性腎臟疾病終末期的基本病理變化。腎單位損傷后成纖維細胞增生、肌成纖維細胞形成、ECM過度生成沉積,致腎小球硬化、血管硬化和腎小管間質纖維化[20]。損傷狀態(tài)下的腎臟細胞面臨缺氧、氧化應激、內質網(wǎng)應激、線粒體損傷及營養(yǎng)耗竭等多種應激,這些應激均參與自噬的激活[21]。既往研究提示,腎纖維化過程常與腎臟固有細胞自噬相關,但自噬在腎纖維化的不同細胞和疾病中作用不同[22]。隨著對自噬相關探究進一步的深入,越來越多的研究證實自噬通過不同通路影響腎纖維化進程。

抑制自噬加速腎纖維化進程。丹酚酸B對器官纖維化有保護作用。加入丹酚酸B后,纖維化大鼠腎組織中LC3B、Beclin1表達上調,p62表達下調,膠原沉積明顯減少,提示丹酚酸B可激活自噬減輕腎纖維化[23]。Brahma相關基因1敲除能明顯改善單側輸尿管梗阻誘導的腎纖維化,抑制衰老相關蛋白的表達;過表達該基因增加了腎小管上皮細胞中β-catenin的核定位,提高了活性β-catenin及WNT/β-catenin信號轉導關鍵靶基因的蛋白質水平,同時減少了LC3-Ⅱ、Beclin1的表達;ICG-001干預后逆轉了上調的COL1、α-SMA等的表達。研究提示,經WNT/β-catenin通路抑制自噬,可誘導腎小管衰老引起腎纖維化發(fā)展[24]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可作為糖尿病潛在的治療靶點,腎纖維化小鼠和細胞模型中其表達均明顯下調。高糖處理細胞僅過表達SRY-box轉錄因子2重疊轉錄(SRY-box 2 overlapping transcript,SOX2OT),而lncRNA SOX2OT過表達和雷帕霉素預處理會增強LC3熒光強度和纖連蛋白、膠原蛋白表達,上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1水平,減少p62表達,Akt/mTOR活性進一步受抑制,提示lncRNA SOX2OT過表達能通過抑制Akt/mTOR通路促進自噬減輕腎纖維化[25]。

其他研究表明抑制自噬可減輕腎纖維化。衣康酸4-辛酯的實驗首次表明,單側輸尿管梗阻和腺嘌呤誘導的纖維化模型在衣康酸4-辛酯處理后可降低p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白及TGF-β表達,上調Smad7蛋白來抑制TGF-β/Smad通路激活,減少TGF-β1誘導細胞中纖維化相關蛋白表達;處理后人腎皮質近曲小管上皮細胞中LC3-Ⅱ水平降低,p62蛋白增加,表明抑制自噬可經TGF-β/Smad通路抑制腎纖維化[26]。

4 自噬與心肌纖維化

心肌纖維化是心肌梗死、心律失常及心肌病等多種心血管疾病的共同病理改變,也是心室重構的重要表現(xiàn)之一。其以多種病理因素影響下心肌成纖維細胞活化為肌成纖維細胞、心臟細胞外基質過度沉積為特征,最終導致心臟收縮和舒張功能障礙[27]。成纖維細胞激活為肌成纖維細胞是心肌纖維化的中心事件[28]。自噬可經多種方式調節(jié)心肌細胞重構和物質代謝,是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要過程[29]。

部分研究發(fā)現(xiàn),激活自噬可減輕心肌纖維化。槲皮素相關研究提示[30],心房顫動組miR-223-3p及p62/死骨片1(recombinant sequestosome 1,SQSTM1)表達明顯高于竇性心律組,叉頭框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)及ATG7、LC3B-Ⅱ表達明顯低于竇性組,且miR-223-3p表達與FOXO3表達呈負相關,表明槲皮素調節(jié)miR-223-3p靶向激活FOX03促進自噬,進而減輕大鼠心肌纖維化。芪參益氣丸與雷帕霉素發(fā)揮類似作用[31],實驗組大鼠心肌組織病理改變明顯減輕,Beclin1、LC3表達增加,p62表達收到抑制,影響自噬;此外,心肌Akt蛋白、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值呈劑量依賴性下降,提示可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路激活心肌自噬,達到抗心肌纖維化的目的。然而,另外有研究發(fā)現(xiàn),抑制自噬可減輕心肌纖維化,應用Calhex可通過抑制自噬-核苷酸結合寡聚化結構域樣受體含pyrin結構域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family,pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小體途徑,減輕了大鼠心肌梗死后的心肌炎癥和纖維化[32]。

5 自噬與胰腺纖維化

胰腺纖維化與多種慢性胰腺疾病的進展密切相關,是慢性胰腺炎、胰腺癌的共同病理學基礎。胰腺纖維化形成過程中,胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、腺泡細胞和巨噬細胞發(fā)揮重要作用。其中PSCs是關鍵細胞,受到理化等因素刺激后自噬活性增加,PSCs由靜息態(tài)轉變?yōu)榧せ顟B(tài),增殖為成纖維細胞,釋放細胞因子產生大量ECM致胰腺纖維化[33-34]。近年來,自噬在胰腺纖維化進程的研究尚不成熟,胰腺纖維化的額發(fā)生、發(fā)展中是否存在同其他組織纖維化中的相反情況及更多的信號通路有待考證,但自噬在胰腺纖維化發(fā)生、發(fā)展中確實發(fā)揮了重要作用。自噬增強可促進PSCs的激活進而促進胰腺纖維化。體外培養(yǎng)大鼠模型及PSCs中自噬活性增強,同時會檢測到α-SMA表達隨自噬的增強而增加;3-甲基腺嘌呤處理后可明顯降低PSCs中COL1/COL3、FN的表達,證實抑制自噬可阻止PSCs激活,從而達到抗胰腺纖維化作用。PSCs中過表達lnc-PFAR后增加α-SMA、COL1/COL3和FN的表達;結合放線菌素實驗并調節(jié)lnc-PFAR水平,發(fā)現(xiàn)lnc-PFAR通過結合miR-141前體,阻礙miR-141-5p成熟來調節(jié)miR-141-5p,進而促進視網(wǎng)膜母細胞瘤線圈蛋白1轉錄,增加ULK1表達,經ULK1誘導自噬活化進一步激活PSCs并加重胰腺纖維化[35]。柴胡皂苷A處理PSCs后,NLRP3炎性小體減少,ATG5、Beclin1、LC3B蛋白水平呈劑量依賴性降低;與對照組比較,AMPK表達減少,mTOR表達增加,逆轉了雷帕霉素預處理所致的mTOR和NLRP3下調并增加了LC3B-Ⅱ。實驗表明,柴胡皂苷A通過AMPK/mTOR信號通路抑制PSCs自噬和NLRP3炎癥小體,減輕胰腺纖維化[36]。

6 自噬與子宮內膜纖維化

子宮內膜纖維化是宮腔粘連的主要病理學變化。多種病因損傷子宮內膜基底層后造成子宮粘連或閉塞。這些改變最終表現(xiàn)為月經量減少、閉經、不孕及復發(fā)性流產等[37],嚴重影響患者的生理和生殖健康。關于宮腔粘連的發(fā)病機制目前仍不明確,但相關文獻提示TGF-β、NF-κB、WNT、JAK/STAT等多條信號通路參與其發(fā)病過程[38]。上述信號通路作為多種纖維化過程中的關鍵環(huán)節(jié)參與自噬,進而調控纖維化,因此,可以推測多種信號通路自噬在子宮內膜纖維化的發(fā)展中也有一定作用。

機械損傷所致的宮腔粘連小鼠中,LC3-Ⅱ表達減少,p62表達增加,自噬活性降低,內膜厚度增加,上調自噬活性后,內膜厚度減少,提示自噬活性與宮腔粘連形成有關[39]。研究顯示,與對照組比較,表達腎上腺髓質素2的宮內粘連小鼠子宮肥大僵硬,子宮組織中LC3B-Ⅱ降低,COL1A1、p-Akt Ser473、p-核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶表達降低,表明激活音猬因子后通過Akt/mTOR通路調控自噬,參與子宮內膜纖維化的發(fā)生[40]。上述內容提示自噬在子宮內膜纖維化進程中可能發(fā)揮著重要作用,但目前關于子宮內膜纖維化與自噬的研究較少,該病對女性生理和生殖健康造成極大影響,故積極探究自噬相關領域及機制,具有較大的臨床應用價值,可為未來治療宮腔粘連提供有力的證據(jù)。

7 小結與展望

大量研究證實,自噬參與多種器官纖維化病變的發(fā)生、發(fā)展。自噬在器官纖維化中發(fā)揮重要作用,以自噬為靶點來治療纖維化,能為患者帶來新的選擇,改善患者預后和生活質量。但是自噬在纖維化中的具體作用仍未十分明確,在肺、肝、腎等器官中,自噬對纖維化的影響都具有兩重性,不同器官、不同細胞及不同疾病等均可影響自噬在纖維化中的進展。同時,在肺纖維化、肝纖維化和腎纖維化研究相對成熟的基礎上,有關胰腺纖維化、心肌纖維化和子宮內膜纖維化的研究還相對缺乏,尤其是針對子宮內膜纖維化發(fā)病進程中相關機制的研究。