孟英，肖根發(fā)

1 贛南醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，江西贛州 341001；2 贛南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科；3 贛南醫(yī)科大學(xué)心腦血管疾病防治教育部重點實驗室

肺動脈高壓（PAH）是一種慢性進(jìn)行性疾病，具有高病死率，其病理生理學(xué)改變主要是肺血管重構(gòu)，該過程涉及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（PVECs）增生、肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）過度增殖和遷移、外膜成纖維細(xì)胞增生以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等［1］。隨著對PAH研究的深入，目前研究發(fā)現(xiàn)炎癥免疫反應(yīng)也與PAH的發(fā)病密切相關(guān)［2］。這些病理生理學(xué)異常改變會促使肺動脈管壁增厚、管腔狹窄，進(jìn)而引起肺血管阻力增加、肺動脈壓持續(xù)升高，最終導(dǎo)致右心室擴(kuò)張、右心功能衰竭甚至死亡。右心導(dǎo)管檢查是診斷PAH的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有有創(chuàng)性，存在檢查風(fēng)險大、患者依從性差及短時間不能重復(fù)檢查等缺點。近年來，靶向治療已應(yīng)用于PAH的治療，但患者預(yù)后仍然較差。轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA，是連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組生物功能之間的紐帶。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠揭示基因在特定生理或病理狀態(tài)下的表達(dá)水平和模式，從而深入了解基因在生物體內(nèi)的功能和調(diào)控機(jī)制。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法主要包括基于雜交的基因芯片技術(shù)（又稱為DNA微陣列，DNA microarray）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)步和成本的降低，RNA-seq逐漸取代傳統(tǒng)DNA microarray，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究［3］。本研究對與PAH發(fā)生發(fā)展及診治有關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)研究作一綜述，為探討PAH的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療提供依據(jù)。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PAH發(fā)病中的應(yīng)用

1.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在肺動脈血管重構(gòu)中的應(yīng)用

1.1.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PVECs功能障礙中的應(yīng)用 PVECs功能障礙會引起血管重構(gòu)，是導(dǎo)致PAH發(fā)生的關(guān)鍵［4］。首先，內(nèi)皮細(xì)胞（EC）位于血管最內(nèi)層，直接接受血流沖擊和各種致病因素的刺激，從而誘導(dǎo)EC增殖能力及通透性升高，并通過分泌各種因子引起炎癥和免疫細(xì)胞募集，激活細(xì)胞凋亡抵抗［5-6］。其次，PVECs功能失調(diào)可引起上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），該過程是以內(nèi)皮細(xì)胞喪失功能并獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型（如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞）為特點［7］。2015年，GU等［8］首次通過DNA microarray的方法比較了慢性血栓栓塞性PAH（CTEPH）患者與健康對照人群PVECs中的lncRNA、mRNA表達(dá)譜，并構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；結(jié)果顯示，與健康對照人群相比，CTEPH患者PVECs中有185個lncRNA表達(dá)異常，其中差異最大的4個lncRNA分別是NR_036693、NR_027783、NR_033766和NR_001284，這些異常的lncRNA可能是與CTEPH發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的激活物或抑制物。

RODOR等［9］對SU5416/缺氧誘導(dǎo)的PAH小鼠和正常對照小鼠肺EC進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了222個差異表達(dá)基因；同時，該研究對PVECs進(jìn)行了RNA-seq分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD74表達(dá)上調(diào)與MHC-Ⅱ基因有關(guān)，CD74/MHC-Ⅱ復(fù)合物參與了PAH的形成過程，且CD74敲低可以影響PVECs的增殖和屏障功能，為PAH潛在候選治療藥物的開發(fā)提供了新靶點。HE等［10］對缺氧性肺動脈高壓（HPH）誘導(dǎo)后的小鼠肺部EC亞群進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果篩選出羥基前列腺素脫氫酶（Hpgd）、Npr3和Fbln2三個關(guān)鍵基因，最終選擇Hpgd進(jìn)行后續(xù)驗證；通過對人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（hPVECs）進(jìn)行不同時間的缺氧處理發(fā)現(xiàn)，Hpgd表達(dá)呈時間依賴性降低。因此，臨床上可以通過監(jiān)測hPVECs中Hpgd表達(dá)情況，以此反映PAH病情，并用于指導(dǎo)后續(xù)治療。最近研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解蛋白烯醇酸酶1（ENO1）可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路參與PAH的血管重構(gòu)。SHI等［11］采用RNA-seq篩選出缺氧處理后PVECs的差異表達(dá)基因，并使用ENO1抑制劑恢復(fù)了缺氧誘導(dǎo)的PVECs功能障礙，提示靶向抑制ENO1過表達(dá)可改善PAH的血管重構(gòu)，有希望成為新的PAH治療靶點。MONTEIRO等［12］同樣通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)PTBP1通過介導(dǎo)lncRNA_MIR503HG在EMT中發(fā)揮作用，從而參與PAH的肺血管重構(gòu)。因此，PVECs功能紊亂在PAH的早期發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，深入了解PVECs在肺血管重塑中的作用對于PAH的預(yù)防、診斷及治療均具有重要意義。

1.1.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PASMCs增殖、遷移中的應(yīng)用 PASMCs過度增殖和遷移所引起的肺血管重構(gòu)是PAH發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［1］。近年來有研究通過DNA microarray發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下過表達(dá)尿路上皮癌相關(guān)1基因（UCA1）與生長抑制因子家族成員5（ING5），可通過競爭人異質(zhì)性細(xì)胞核核糖核蛋白Ⅰ（hnRNPⅠ）來促進(jìn)原代肺動脈平滑肌細(xì)胞（HPASMCs）增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致PAH進(jìn)展［13］。一項關(guān)于lncRNA數(shù)據(jù)的研究顯示，缺氧暴露的PASMCs中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達(dá)升高，并可能是受到HIF-1α的調(diào)控，敲低MALAT1可抑制PASMCs體外增殖和遷移，減輕PAH小鼠的右心室肥厚［14］。LUO等［15］通過RNA-seq檢測了正常和HPH大鼠的差異表達(dá)mRNA，結(jié)果顯示二氧化硫（SO2）通過Dkk1/Wnt信號通路抑制PASMCs的增殖和遷移，從而減輕缺氧誘導(dǎo)的肺小動脈重構(gòu)。此外，有研究對18例IPAH患者和17例健康對照人群的肺動脈血管進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPAH患者PASMCs和成纖維細(xì)胞中PAX相互作用蛋白1反義RNA1（PAXIP1-AS1）表達(dá)異常；PAXIP1-AS1可通過靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白paxillin表達(dá)和磷酸化，從而調(diào)節(jié)PASMCs增殖、遷移和細(xì)胞凋亡抵抗［16］。ZHENG等［17］對野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，結(jié)果篩選出PVECs、PASMCs、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Tregs）中差異表達(dá)的N6-甲基腺苷RNA甲基化（m6A）調(diào)節(jié)因子，提示m6A調(diào)節(jié)因子參與了PAH的發(fā)生發(fā)展，可能是PAH診斷和治療的生物標(biāo)志物之一。LV等［18］分析了常氧和缺氧條件下PVECs、PASMCs和周圍細(xì)胞（PCs）中的lncRNA轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，結(jié)果顯示在缺氧條件下lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1（TUG1）在PASMCs、PCs中表達(dá)升高，而在PVECs中表達(dá)降低；生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，lncRNA-TUG1可能通過靶向調(diào)節(jié)miR-145-5p，促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，從而加速肺血管重構(gòu)。WANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，PAH患者和HPH小鼠肺血管中TUG1高表達(dá)，TUG1敲低可阻止PAH的進(jìn)一步發(fā)展。環(huán)狀RNA（circRNAs）可以調(diào)節(jié)各種生物過程，包括細(xì)胞增殖過程。SUN等［20］采用RNA-seq篩選出與HPH相關(guān)的circRNA和靶基因，結(jié)果表明circ-Grm1通過RNA結(jié)合蛋白FUS蛋白抑制Grm1表達(dá)，從而促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移，參與PAH的發(fā)生發(fā)展。因此，臨床上可以通過靶向調(diào)節(jié)PASMCs中的相關(guān)基因表達(dá)來逆轉(zhuǎn)PAH的血管重構(gòu)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在肺組織炎癥免疫中的應(yīng)用肺部血管周圍炎癥反應(yīng)程度與肺血管重構(gòu)密切相關(guān)，故炎癥細(xì)胞在PAH的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要。XIAO等［21］采用RNA-seq分析了MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示炎癥因子Svop、Ercel、Erfe、Dlk1、ccl1、ccl2、ccl20表達(dá)上調(diào)，并提出失調(diào)的炎癥/免疫和神經(jīng)活性配體—受體相互作用可能參與了PAH的發(fā)生發(fā)展。AREG是編碼雙調(diào)蛋白的關(guān)鍵內(nèi)皮因子，AREG/EGFR軸參與了許多炎癥疾病的發(fā)病。有研究對PAH小鼠PVECs的全轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，AREG及其受體EGFR在EC中表達(dá)缺失，引起PAH中炎癥細(xì)胞募集，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)［22］。ZHANG等［23］通過對肺組織轉(zhuǎn)錄組的生物信息學(xué)分析顯示，miR-483靶向調(diào)節(jié)多個與PAH相關(guān)的炎癥基因，包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、TGF-β受體2（TGFBR2）、β-catenin、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和內(nèi)皮素1（ET-1）等，提示miR-483可能成為治療PAH的新靶點。

1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PAH導(dǎo)致右心功能衰竭中的應(yīng)用 在PAH引起右心功能衰竭的過程中，早期心室因代償而肥厚，晚期因失代償而發(fā)生衰竭。右心功能衰竭是影響PAH預(yù)后的決定因素，盡管目前針對肺血管的治療已使PAH導(dǎo)致右心功能衰竭患者的癥狀有所改善，但患者生存率仍然較低［24］。研究發(fā)現(xiàn)，EMT通路和CTGF蛋白在PAH引起右心功能衰竭的過程中活性升高［25］。salubrinal是一種小分子，可以阻止真核翻譯起始因子2α（peIF2α）去磷酸化，從而延長細(xì)胞壽命。HE等［26］通過RNA-seq分析大鼠基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示peIF2α去磷酸化抑制劑salubrinal可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)PAH導(dǎo)致的右心功能衰竭。上述轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)研究有助于更好地了解PAH導(dǎo)致右心功能衰竭的分子機(jī)制，并為其治療提供新的靶點。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PAH診治中的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PAH診斷中的應(yīng)用 目前臨床上常用的PAH診斷方法是超聲心動圖和右心導(dǎo)管檢查。既往研究發(fā)現(xiàn)，超聲心動圖診斷PAH的敏感度和特異度均不高，分別為90%、75%。右心導(dǎo)管檢查是診斷PAH的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有有創(chuàng)性，不能成為常規(guī)篩查方法。隨著越來越多的研究試圖揭示PAH的發(fā)病機(jī)制，與以往的生化指標(biāo)和炎癥因子相比，轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)生物標(biāo)志物的特異性更高。WANG等［27］運(yùn)用DNA microarray技術(shù)發(fā)現(xiàn)HPH小鼠具有23個上調(diào)的circRNA和41個下調(diào)的circRNA，其中表達(dá)上調(diào)的hsa cric-004592和hsa cric-018351有望成為PAH早期診斷的生物標(biāo)志物。一項研究對359例特發(fā)性、遺傳性和藥物性相關(guān)的PAH患者和健康對照人群的全血細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序，結(jié)果篩選出了507個差異表達(dá)基因，在模型中驗證發(fā)現(xiàn)25個差異表達(dá)基因診斷PAH的敏感性為87%；并提出PAH的全血RNA特征與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，其中SMAD5表達(dá)降低可能會增加PAH的易感性，而SMAD5是TGF-β家族細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，提示SMAD5是PAH相關(guān)藥物開發(fā)的潛在靶標(biāo)［28］。PARK等［29］對PAH大鼠肺組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，68Ga-NOTA-MSA PET可以通過對巨噬細(xì)胞浸潤肺部的程度進(jìn)行成像，并以此幫助診斷PAH、監(jiān)測炎癥程度，有可能成為診斷PAH的新型指標(biāo)。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP2）是胰島素樣生長因子家族的重要成員，有研究采用RNAseq檢測肺PASMCs和PVECs中的IGFBP2 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示IGFBP2蛋白是由PASMCs分泌，并且在PAH肺組織中表達(dá)升高，與PAH嚴(yán)重程度和病死率密切相關(guān)，其診斷PAH的受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.76，是診斷PAH的潛在標(biāo)志物之一［30］。此外，XU等［31］收集了26例CTEPH患者和35例健康志愿者的全血樣本，并提取RNA來構(gòu)建文庫，結(jié)果顯示LINC00472、PIK3R6、SCN3A、TCL6診斷CTEPH的AUC分別為0.964、0.893、0.750、0.732。因此，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以為PAH的診斷提供有效的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在PAH治療中的應(yīng)用 目前，臨床上對于PAH的治療主要通過靶向藥抑制內(nèi)皮素途徑、增強(qiáng)前列環(huán)素（PGI2）和磷酸二酯酶5抑制劑途徑來糾正內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而改善癥狀和提高患者生存率［32］。同時，隨著關(guān)于PAH發(fā)病機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究不斷深入，一些新的治療靶點逐漸被發(fā)現(xiàn)。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF1）是一種參與炎癥浸潤和血管生成的趨化因子，而PAH小鼠血管壁細(xì)胞（平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的統(tǒng)稱）中的SDF1與血管肌肉化有關(guān)，靶向調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞中的SDF1表達(dá)有助于預(yù)防和（或）逆轉(zhuǎn)PAH病程，是PAH的新型治療靶點［33］。此外，芳香烴受體（AHR）是一種核受體/轉(zhuǎn)錄因子，可解除外源性物質(zhì)，并調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞的分化和功能。MASAKI等［34］研究發(fā)現(xiàn)，PAH中炎癥細(xì)胞浸潤以AHR依賴性的方式而發(fā)揮作用。因此，AHR在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，可能會成為治療PAH的一個有效靶點。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠全面揭示基因在生物體內(nèi)的功能和調(diào)控機(jī)制，不僅可以參與揭示PAH的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，還可以為其診治提供新的特異性診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點，對提高患者的生存質(zhì)量以及改善預(yù)后具有重要作用。