DOI：10.16601/j.cnki.issn2096-7330.2024.01.016"文章編號(hào)：2096-7330（2024）01-0126-05

摘"要：2磷是果樹生長不可或缺的重要營養(yǎng)元素之一，對果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要影響。本研究收集了全國最重要的沃柑種植地廣西武鳴地區(qū)8個(gè)典型村莊的土壤，測定其土壤基本理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)土壤整體偏酸性，土壤肥沃，有機(jī)質(zhì)含量極高，這類土壤比較利于沃柑等柑橘的生長。土壤中的全磷含量：862.54～3318.14mg/kg，其中Ca2-P作為容易被轉(zhuǎn)化為植物吸收利用形態(tài)的無機(jī)磷，其占總無機(jī)磷比在7.68%～22.28%之間。此外，有兩個(gè)村莊的土壤偏堿性，土壤中的難溶性Ca10-P占總無機(jī)磷比高達(dá)33.53%，對其土壤中的無機(jī)解磷菌進(jìn)行分離，測定其分泌的低分子量有機(jī)酸主要為草酸、酒石酸、甲酸、琥珀酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸和乙酸。該研究對了解喀斯特地區(qū)土壤肥力和磷循環(huán)，篩選高效解磷菌緩釋土壤磷肥具有重要意義。

關(guān)鍵詞：武鳴；無機(jī)磷；解磷菌；有機(jī)酸

中圖分類號(hào)：S153.6； TS262.6""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0引言

廣西武鳴地區(qū)作為全國最重要的水果種植基地之一，其土壤中的磷在果樹呼吸和光合作用以及氮素代謝過程中發(fā)揮著重要作用[1]。植物根際通常只能以HPO42-和H2PO4-的形式吸收土壤中的磷[2]，雖然土壤中的無機(jī)磷（Pi）占總磷比例較大，但其含量通常仍低于10 μmol/L[3]。為了獲取更高的產(chǎn)品和品質(zhì)，人們開始大量使用磷肥，然而其中只有10%～30%的磷肥能夠被植物吸收利用[4]，大部分的磷將通過雨水徑流到江河湖泊中造成水體富營養(yǎng)化，此外，還有一部分磷將會(huì)被土壤固定形成鋁結(jié)合的磷酸鹽（Al-P），鐵結(jié)合的磷酸鹽（Fe-P）和鈣結(jié)合的磷酸鹽（Ca-P）等難溶性磷[5-6]，被耕作土壤固定的磷含量足夠全球作物使用約100年[7]。研究表明，被土壤固定的磷形態(tài)受土壤pH影響，其中Al-P和Fe-P在酸性土壤中占Pi比例較大，Ca-P是偏堿性的石灰性土壤中磷酸鹽的主要形態(tài)[8]。Ca-P 形態(tài)存在的磷酸鹽還可細(xì)分為水溶性的磷酸一鈣（Ca-P） 、枸溶性的磷酸二鈣（Ca2-P）和磷酸八鈣（Ca8-P）以及難溶性的磷灰石（Ca10-P），他們的熱力學(xué)穩(wěn)定性逐漸增加，其中 Ca-P和Ca2-P的有效性較高，容易釋放出磷酸根離子，Ca8-P 為緩效性磷源，而Ca10-P 最難溶解，只能作為一種潛磷源。

由于施入土壤中的磷有效性較低，植物發(fā)展出一系列抵御低磷脅迫的方式，其中一種為在根際分泌大量低分子量（檸檬酸、蘋果酸、草酸和酒石酸等）[9-10]。土壤溶液中的有機(jī)酸濃度范圍通常在0.1～100 μmol/L之間，然而植物根際附近濃度能超過50000 μmol/L[11]。有機(jī)酸滲入土壤可導(dǎo)致植物根際界面土壤酸化，螯合難溶性磷酸鹽中鈣、鋁、鐵等金屬離子，釋放出磷酸根離子[12]，提高植物根際界面磷含量和有效磷濃度，進(jìn)而增加作物對磷的吸收和產(chǎn)量。

然而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，植物根際界面存在大量微生物，有機(jī)酸首先由這些微生物分泌[12]。Sperber等[13]早在1957年研究發(fā)現(xiàn)從土壤中分離的溶磷細(xì)菌能夠產(chǎn)生富馬酸、乳酸、羥基乙酸、琥珀酸等有機(jī)酸。土壤中解磷菌種類繁多，且受土壤性質(zhì)和植物種類的影響[14]，目前已報(bào)道的解磷微生物可分為39個(gè)屬、89種以及數(shù)以萬計(jì)的解磷菌株[15]。而低分子量有機(jī)酸主要由無機(jī)解磷菌釋放，常見分泌的低分子量有機(jī)酸包括草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸等[16-17]。

廣西南寧市武鳴區(qū)地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，為典型的喀斯特地貌，石灰性土壤分布廣泛，而該地區(qū)主要作物為沃柑等適合種植于偏酸性土壤環(huán)境中的作物。因此，了解武鳴地區(qū)典型土壤的磷形態(tài)，確定其中石灰性土壤中解磷菌分泌的低分子量有機(jī)酸種類，對了解喀斯特地貌區(qū)土壤磷素特別是無機(jī)磷的存在形態(tài)具有重要意義，同時(shí)也能為外源施加有機(jī)酸肥料提供理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1土樣采集

土樣采集于武鳴地區(qū)板增村、岜巖村、河馬村、板鄧村、板陸村、嶺腳村、定志村和小雷艾村8個(gè)村莊，采用“S”取樣法，在“S”曲線上選取四個(gè)取樣點(diǎn)，去除凋落物層后選取10 cm深度處土樣。將同一采樣點(diǎn)的土樣混勻風(fēng)干后，過200目網(wǎng)篩去除根系、石塊、植物殘骸，隨后將每個(gè)地區(qū)過篩后的4個(gè)土樣均勻混合，編號(hào)標(biāo)記為1，2，3，4，5，6，7，8。

1.2土壤理化性質(zhì)的測定

土壤堿解氮用堿解擴(kuò)散法[18]；土壤pH用電位法（水土比2.51，即25 mL H2O 10 g土樣）；土壤速效鉀用1 M醋酸銨-火焰光度法[19]；有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量-外加熱法測定[20]；土壤磷酸酶用磷酸苯二鈉比色法[21]；土壤全磷用NaOH熔融法測定[22]。土壤無機(jī)磷分級（Fe-P、Al-P、O-P、Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P）用顧益初-蔣柏藩法測定[23]。

1.3無機(jī)解磷細(xì)菌培養(yǎng)基的配制

無機(jī)解磷菌固體培養(yǎng)基：① 葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，瓊脂20 g，蒸餾水900 mL；② 磷酸三鈣 0.1 g/L。pH 調(diào)至7.0 ～ 7.5。將溶液：①加熱溶解后與懸濁液;②一起105℃滅菌30 min。取27 mL溶液：①與3 mL懸濁液;②混勻即為固體培養(yǎng)基。使用前，用三蒸水將磷酸三鈣充分清洗，去除可溶性磷酸鹽。

無機(jī)解磷菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，磷酸鈣10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0 ～7.5，105℃滅菌30 min。

1.4解磷菌的分離與純化

從8個(gè)地區(qū)取10 g的堿性土樣于錐形瓶中，加入90 mL無菌水，制備10-1 g·mL-1土壤稀釋液后，放入搖床，在30℃、轉(zhuǎn)速225 r/min下振蕩30 min后取出，于無菌操作臺(tái)靜置分層。取1 mL0.1 g/mL土壤稀釋液（母液）稀釋至0.01 g/mL，混勻。按照同樣的方法配置一系列濃度梯度懸浮液：10-3 、10-4、10-5、10-6（ g/mL）土壤稀釋液。取土壤稀釋液各100 μL，用無菌涂棒將樣品均勻涂于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上，在25～28℃倒置培養(yǎng)3～7天，選取培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯溶磷圈的菌落，即為解磷菌。用接種環(huán)以無菌操作沾取單個(gè)菌落，在新的無菌培養(yǎng)基平板表面上以平行劃線的方式接種，進(jìn)行純化，直到得到純種為止（3～5次）。

1.5解磷菌分泌的有機(jī)酸收集和測定

取菌株分別接種于30 mL的無機(jī)解磷菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃下200 ～ 250 r/min振蕩培養(yǎng)3天，5000 r/min離心分離后，采用高效液相色譜測定上清液有機(jī)酸種類。色譜條件：分析柱C18，4.6 mm × 250 mm；檢測波長214 nm；流動(dòng)相為0.04 mol/L磷酸水（pH 2.75）和甲醇，體積比為955，流速0.4 mL/min；柱溫為25℃。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：草酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等。測定前，待測樣和標(biāo)準(zhǔn)樣分別過0.22 μm濾膜去除雜質(zhì)，磷酸水及甲醇過0.45 μm濾膜去除雜質(zhì)，待測樣、標(biāo)準(zhǔn)樣、流動(dòng)相超聲脫氣30 min。

2結(jié)果與討論

采集的土樣整體呈磚紅色或黃棕色，2該類土壤一般有機(jī)物含量較高，如圖1所示。對土壤理化性質(zhì)包括pH、堿解氮、速效鉀、有機(jī)質(zhì)和磷酸酶活性分析發(fā)現(xiàn)（表1），土壤pH整體呈現(xiàn)弱酸性，只有兩個(gè)地區(qū)的土壤偏堿性。土壤有機(jī)質(zhì)含量平均值處于61.77±2.2 g/kg到113.62±6.55 g/kg之間，有機(jī)質(zhì)含量極高，可能由于柑橘等果樹種植過程中土壤會(huì)施加大量有機(jī)肥，導(dǎo)致土壤有機(jī)肥含量較高，同時(shí)武鳴地區(qū)土壤主要為黏土，土壤中的有機(jī)質(zhì)不易被雨水和灌溉水淋失，保肥較好。此外，土壤中堿解氮含量平均值處于91.89±3.55 mg/kg到154.63±11.61 mg/kg之間，含量較高，這與土壤中的高土壤有機(jī)質(zhì)含量相符，說明土壤供氮能力較強(qiáng)。土壤中的速效鉀含量處于309.43±28.9 mg/kg到1023.16±30.25 mg/kg，含量極高，可能是由于土壤采樣時(shí)間為12月份，此時(shí)土壤中還殘留大量未被植物吸收的鉀肥，故導(dǎo)致土壤速效鉀含量高。而土壤磷酸酶作為一類催化土壤有機(jī)磷和無機(jī)磷化合物轉(zhuǎn)化成植物可吸收利用形態(tài)的磷酸鹽的酶，采集土壤24小時(shí)的磷酸酶活性處于18.57±0.27 mg/kg到28.49±0.46 mg/kg。

磷素有效性主要取決于土壤中Pi的形態(tài)，土壤中的Pi可分為四類[24-25]： Ca-P，F(xiàn)e-P，Al-P和閉蓄態(tài)磷酸鹽（O-P）。從圖2a中可知，土壤全磷含量為：862.54 ～3318.14 mg/kg之間，其中河馬村土壤的全磷含量最低，板增村土壤全磷含量最高。對土壤中各形態(tài)磷測定發(fā)現(xiàn)，土壤中容易被植物吸收利用的Ca2-P含量處于26.2 ～178.8 mg/kg之間（圖2b），占總Pi的百分比為7.68%～22.28%（圖2c）。此外，土壤pH呈堿性的河馬村和小雷艾村的土壤中含有的難溶性Ca10-P占比最大，分別占總Pi含量比例為33.53%和28.87%，這與理論一致，即偏堿性土壤會(huì)促進(jìn)可溶性磷酸鈣轉(zhuǎn)化為難溶性形態(tài)[26]。此外，由于土壤整體呈酸性或弱堿性，土壤中由鐵、鋁質(zhì)膠膜所形成的閉蓄態(tài)O-P含量均較高，同時(shí)Al-P、Fe-P同樣較高，這與土壤中存在大量鐵鋁氧化物有關(guān)。

鑒于石灰性土壤較強(qiáng)的固磷作用，其中難溶性磷含量較高，因此分離土壤為偏堿性的河馬村和小雷艾村地區(qū)土壤，通過平板初篩的方法篩選出其中的無機(jī)解磷細(xì)菌。采用以磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基，在兩種土樣中共篩選出八種能產(chǎn)生溶磷圈的菌株，部分形態(tài)如圖3所示，菌落形態(tài)呈圓形，具有溶磷能力的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生溶磷圈（如圖3中紅色圓圈）。

分泌有機(jī)酸是微生物溶解土壤中難被植物吸收利用磷的主要方式之一，因此，分離培養(yǎng)3天后的細(xì)菌培養(yǎng)液，利用高效液相色譜對其上清液中的低分子量有機(jī)酸進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，不同土壤中的無機(jī)解磷菌分泌的低分子量有機(jī)酸種類略有不同，主要以草酸、酒石酸、甲酸、琥珀酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸和乙酸為主（表2），其中所有菌株分泌物中均能檢測出酒石酸。

土壤磷循環(huán)以微生物活動(dòng)為中心，土壤中接種解磷菌能夠有效改善作物的磷素營養(yǎng)，研究表明，解磷菌的解磷作用與其代謝的低分子量有機(jī)酸密切相關(guān)，菌株之間分泌的有機(jī)酸種類和含量的差異會(huì)導(dǎo)致其解磷能力差異很大。在石灰性土壤中，檸檬酸和草酸對磷酸鹽的活化能力最強(qiáng)，其次是蘋果酸[27]，草酸能夠有效降低土壤中的鐵鋁氧化物含量[28]。因此，對于石灰性土壤，在研究解磷菌的溶磷過程中，應(yīng)篩選菌株②，對于含大量鐵鋁氧化物的土壤，應(yīng)從菌株①、②、③、④和⑦中篩選草酸分泌量較大的菌株，可利用單一或多種菌株進(jìn)一步研制生物菌劑，通過外源施加解磷菌肥以提高土壤的磷利用率。

3結(jié)語

通過分析廣西武鳴地區(qū)8個(gè)不同村莊的土壤發(fā)現(xiàn)，土壤整體偏酸性，這類土壤比較利于沃柑等柑橘的生長，且土壤均為粘土，土壤肥沃，有機(jī)質(zhì)含量極高。土壤中的全磷含量為862.54～3318.14 mg/kg，其中容易被植物吸收利用的Ca2-P含量占總Pi的百分比為7.68%～22.28%。由于偏堿性的河馬村和小雷艾村的土壤中含有的難溶性Ca10-P占比最大，考慮解磷菌分泌的有機(jī)酸能夠有效釋放土壤中被固定的磷，因此分離了這兩個(gè)村莊土壤中的解磷菌，利用高效液相色譜測定其分泌的低分子量有機(jī)酸主要為草酸、酒石酸、甲酸、琥珀酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸和乙酸。該研究能夠?yàn)橛袡C(jī)酸-礦物界面研究以及高效解磷菌的篩選提供數(shù)據(jù)支撐，對了解喀斯特地貌地區(qū)土壤肥力和利用微生物制作菌肥改良土壤具有重要意義。

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[責(zé)任編輯：黃天放]

收稿日期：2023-10-23

基金項(xiàng)目：ZK（國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（42207386）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2021KY0390）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210603012）

第一作者簡介：ZK（楊晶（1981—），博士，南寧師范大學(xué)副教授，研究方向：催化材料。

通信作者簡介：ZK（李猛（1991—），湖北咸寧人，植物營養(yǎng)學(xué)博士，研究方向：土壤磷循環(huán)（limeng_2016@126.com）。