嚴(yán)江天,曾 林,唐 倩,康文武,鄭燦磊,2,蘇振宏,梁鳳霞,4△

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065; 2.濟寧醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,山東 濟寧 272067;3.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435003;4.針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430065

糖尿病發(fā)病率逐年上升,預(yù)計將在2030年達(dá)到10.9%[1]。其中以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)為主,我國的T2DM患者占總糖尿病人群的90%以上,隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活方式的改變,T2DM的發(fā)病率逐年上升并呈現(xiàn)年輕化的趨勢[2]。同時,最新研究發(fā)現(xiàn)Covid-19患者在康復(fù)后患T2DM的可能性會大大增加[3-4]。

T2DM作為一種慢性持續(xù)性炎癥疾病,炎癥在其發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用[5-6]。高脂高糖等不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致腸道菌群紊亂,使得腸道上皮組織緊密連接被破壞,腸道通透性增加,腸道屏障功能受損[7]。腸道屏障功能損傷又會進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,LPS)進(jìn)入體循環(huán),誘發(fā)機體全身腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子的上調(diào),炎癥因子的上調(diào)進(jìn)一步誘發(fā)β細(xì)胞功能紊亂,造成胰島素抵抗,同時又會加劇腸黏膜屏障損傷,形成惡性循環(huán)。因此,修復(fù)腸道黏膜損傷、恢復(fù)腸屏障功能現(xiàn)已成為治療T2DM的新靶點,本研究旨在觀察電針對T2DM模型大鼠全身炎癥及小腸黏膜屏障功能的改善作用,以期為針刺防治T2DM的臨床應(yīng)用和后續(xù)機制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

6周齡SPF級SD大鼠18只體質(zhì)量160～200 g,購自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動物中心提供(動物合格證號:42010200006503)。動物房溫度20～25 ℃,濕度(50±10)%,光照時間為12 h,自由進(jìn)食與飲水,每籠5只,定期更換墊料并保證動物房清潔度達(dá)標(biāo)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機數(shù)字表法,將大鼠分為正常組、模型組與電針組,每組各6只。本實驗過程對動物的處置嚴(yán)格按照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》。本課題經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:HUCMS201904005)。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 中研太和牌針灸針(天津億朋醫(yī)療器械有限公司);HANS-LH202H型電針儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司);血糖儀(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);DR-3518G酶標(biāo)儀(無錫凱夫制藥有限公司);AXTG16G高速離心機(鹽城市安信實驗儀器有限公司);DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠);DYCZ-400D電泳儀槽(北京市六一儀器廠);Touch Imager成像系統(tǒng)(上海易孛特光電技術(shù)有限公司)。

1.2.2 試劑 鏈脲佐菌素(GC301002,武漢賽維爾生物科技有限公司);戊二醇固定液(BL-G014,南京森貝伽生物科技有限公司);LPS酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ARD40472,廣州奧瑞達(dá)生物科技有限公司);胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ARD40174,廣州奧瑞達(dá)生物科技有限公司);大鼠IL-6/TNF-αELISA試劑盒(PI328、PT516,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);大鼠D-乳酸(D-lacticacid,D-LA)/二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)ELISA試劑盒(RC-D907681、RC-D907054,天津睿創(chuàng)生物科技有限公司);大鼠單克隆ZO-1抗體(sc-33725,圣克魯斯生物技術(shù)有限公司);小鼠單克隆Occludin抗體(sc-133256,圣克魯斯生物技術(shù)有限公司);小鼠單克隆Claudin-1抗體(sc-166338,圣克魯斯生物技術(shù)有限公司);小鼠單克隆GAPDH抗體(60004-1-Ig,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);山羊抗小鼠IgG(H+L)(SA00001-1,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);山羊抗大鼠IgG(H+L)(SA00001-15,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.3 模型建立及評價標(biāo)準(zhǔn)

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機選取6只大鼠作為正常組,給予普通飼料(3.8 kcal/g,含70%碳水化合物,20%蛋白質(zhì),10%脂肪)喂養(yǎng)。其余大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合小劑量單次注射STZ制備T2DM模型[8-9]。給予高脂飼料(5.4 kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白質(zhì),46.5%脂肪)喂養(yǎng)8周,4周后大鼠禁食不禁水20 h,然后按大鼠體質(zhì)量35 mg/kg腹腔注射STZ。注射完成后72 h開始測血糖,凡隨機血糖水平在16.7 mmol/L以上,并維持2周以上者視為造模成功。

1.4 干預(yù)方法

參照《實驗針灸學(xué)》[10]和中國針灸學(xué)會制定大鼠實驗動物常用穴位名稱與定位[11]選取大鼠雙側(cè)“足三里”“三陰交”“腎俞”“脾俞”進(jìn)行針刺。針刺前使用自制鼠衣對大鼠進(jìn)行固定,并剃除針刺部位毛發(fā)。針刺采用0.30 mm×13 mm一次性無菌針直刺3～5 mm。電針組大鼠同側(cè)“足三里”“三陰交”接HANS-LH202H型電針儀,連續(xù)波,頻率15 Hz,電流2 mA,電針20 min/d,每周3次,隔日1次,共治療8周。以上采取的穴位選取、刺激頻率、電針時間和療程根據(jù)文獻(xiàn)報道綜合決定[12-14]。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 大鼠空腹血糖檢測 于干預(yù)前后測量并記錄各組大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG),檢測前各組大鼠禁食不禁水12 h,取大鼠尾尖血用魚躍血糖儀測量并記錄FBG。

1.5.2 血清各項生化指標(biāo)檢測 干預(yù)結(jié)束后,大鼠禁食不禁水12 h,采用2%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,用一次性采血針快速扎入心間處,見有回血后迅速將另外一頭扎入促凝管中,3 000 r/min離心15 min后取上層血清,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測血清中空腹胰島素(Fasting insulin,FINS)及TNF-α、IL-6、LPS、D-LA和DAO含量,并計算胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR);HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。嚴(yán)格參照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測各項指標(biāo)。

1.5.3 小腸組織上皮超微結(jié)構(gòu)觀察 采用透射電鏡觀測大鼠小腸上皮超微結(jié)構(gòu)。取位于胃下3～6 cm的小腸組織,用眼科剪去除小腸組織上的脂肪組織和結(jié)締組織,經(jīng)PBS沖洗后于冰上操作。用預(yù)冷的手術(shù)刀片將小腸組織切成0.5 mm×1 mm×3 mm大小,放入預(yù)冷的2.5%戊二醇中固定48 h,再用1%鋨酸后固定2 h,梯度乙醇脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片(50 nm),3%醋酸鈾與硝酸鉛雙染色,室溫干燥過夜,透射電鏡下觀察并采集圖像。

1.5.4 小腸組織ZO-1、Occludin蛋白檢測 取各組大鼠小腸組織50 mg制備蛋白樣本。蛋白樣本采用BCA法測定濃度后,沸水浴加熱10 min使蛋白變性并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。牛奶封閉2 h后,4 ℃搖床孵育一抗過夜(ZO-1 1∶500;Occludin 1∶1 000;Claudin-1∶1∶1 000;GAPDH 1∶10 000)。次日,根據(jù)一抗來源種屬孵育相應(yīng)二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h。配置ECL化學(xué)發(fā)光試劑,用Touch Imager成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行曝光顯色。用Image Pro軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR比較

與正常組比較,模型組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR比較

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量比較

與正常組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠TNF-α、IL-6含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量比較

2.3 各組大鼠血清LPS、D-LA和DAO含量比較

與正常組比較,模型組大鼠LPS、D-LA和DAO含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠LPS、D-LA和DAO含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清LPS、D-LA和DAO含量比較

2.4 各組大鼠小腸組織超微結(jié)構(gòu)比較

正常組大鼠小腸緊密連接完整,橋粒數(shù)量較多;模型組大鼠小腸緊密連接不完整,橋粒數(shù)量減少;電針組緊密連接完整、橋粒正常。見圖1。

注:箭頭指向為緊密連接。圖1 各組大鼠小腸黏膜上皮超微結(jié)構(gòu)觀察(5 000×)

2.5 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin與Claudin-1蛋白表達(dá)水平比較

與正常組比較,模型組大鼠小腸組織中ZO-1、Occludin與Claudin-1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠小腸組織中ZO-1、Occludin與Claudin-1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)中本無糖尿病這一病名,但根據(jù)其癥狀可將其歸為“消渴”“脾癉”等范疇。同時認(rèn)為糖尿病的發(fā)生與飲食、情志和氣候等因素有關(guān),主要是由于肺、脾和腎三臟的功能失調(diào),導(dǎo)致氣血津液的異常代謝?！端貑枴て娌≌撈谒氖摺份d:“帝曰:有病口甘者,病名為何?何以得之?岐伯曰:此五氣之溢也,名曰脾癉……肥者令人內(nèi)熱,甘者令人中滿,故其氣上溢,轉(zhuǎn)為消渴?！闭J(rèn)為本病的誘因在飲食不節(jié),根源在于脾胃,逐步發(fā)展為“消渴”。糖尿病早期消渴,以陰虛燥熱為主,煎灼津液,傷津耗氣致脾腎兩虛,日久脾虛及腎,腎陰虛火旺。故中醫(yī)治療糖尿病主要是以調(diào)節(jié)肺、脾和腎三臟為核心,健脾補腎、益氣養(yǎng)陰,調(diào)和氣血津液,消除痹阻,恢復(fù)正常代謝。故本研究選取腎俞、脾俞二穴相配伍,調(diào)理脾腎;選取足三里、三陰交,以扶正培元、益氣養(yǎng)陰。

STZ是目前制備糖尿病模型運用最為廣泛的藥物,但單一使用STZ誘導(dǎo)對注射劑量把控要求較高,造模成功率不穩(wěn)定且死亡率較高[15]。因此,本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合單次小劑量注射STZ制備T2DM模型大鼠,一方面通過高脂飲食造成大鼠胰島素抵抗,一方面通過小劑量注射STZ對大鼠胰島β細(xì)胞造成輕度破壞,在提高造模成功率、降低死亡率的同時,也更加符合人類T2DM的發(fā)病機制[16]。

由LPS誘發(fā)的系統(tǒng)性炎癥是包括T2DM在內(nèi)的代謝性疾病發(fā)病機制的重要因素[17],體循環(huán)中LPS的增加能夠引起多種組織炎癥,并最終導(dǎo)致胰島素抵抗[18-19]。腸黏膜屏障正是防止LPS進(jìn)入體循環(huán)的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。因此,改善腸道黏膜屏障功能,降低腸道通透性,減少腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物如LPS進(jìn)入血液循環(huán),目前被認(rèn)為是改善T2DM等代謝性疾病的新治療策略[20]。腸黏膜屏障主要由腸上皮細(xì)胞及其緊密連接等組成。緊密連接在維持腸道黏膜屏障的正常功能方面起著重要作用。閉鎖蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudins)和閉合小環(huán)蛋白(ZO-1、ZO-2及ZO-3)等是緊密連接的主要組成。這些蛋白協(xié)同作用,維持腸道上皮細(xì)胞穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性,減少腸道大分子和微生物通過腸壁進(jìn)入內(nèi)環(huán)境[21]。正常情況下,緊密連接并非是靜止不動的,當(dāng)腸上皮細(xì)胞受到細(xì)菌和毒素等的侵?jǐn)_時,緊密連接可發(fā)生移位阻止這些有害物質(zhì)進(jìn)入,避免腸道細(xì)胞損傷。當(dāng)腸道機械屏障遭到破壞時,細(xì)菌和毒素會侵入腸道細(xì)胞并引起多種細(xì)胞炎癥因子的釋放,從而導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,電針能恢復(fù)T2DM大鼠小腸上皮緊密連接的完整性,并上調(diào)ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白表達(dá),從而修復(fù)T2DM大鼠的腸黏膜屏障。

除此之外,還能通過腸道通透性來評價腸黏膜屏障功能的完整性。在正常生理狀態(tài)下,血液中的LPS、D-LA和DAO活性較低。然而,當(dāng)腸上皮細(xì)胞或緊密連接結(jié)構(gòu)受損時,腸道屏障的完整性會喪失,導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞通透性增加,細(xì)菌易位,從而大量釋放LPS、D-LA和DAO進(jìn)入血液循環(huán)[22-23]。因此,血清中的D-LA、DAO和LPS濃度變化可以作為間接反映腸道屏障功能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,電針能下調(diào)T2DM大鼠血清中LPS、D-LA和DAO的含量,提示電針能夠降低腸道通透性,恢復(fù)大鼠腸道屏障功能。

綜上所述,電針“足三里”“三陰交”“脾俞”“腎俞”能夠降低T2DM大鼠空腹血糖,減輕大鼠全身炎癥及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),其機制可能與下調(diào)血清中LPS、D-LA和DAO的含量,降低腸道通透性,恢復(fù)小腸上皮細(xì)胞緊密連接,上調(diào)ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白表達(dá)有關(guān)。