付少委,秦修遠(yuǎn)*,張卓然,李明亮,馮志遠(yuǎn),欒金玲,任瑋,程倩*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)2(北京市蛋白功能肽技術(shù)研究中心,北京,100015)3(酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 宜昌市營(yíng)養(yǎng)健康食品工程技術(shù)研究中心,湖北 宜昌,443003)

衰老是生命過(guò)程中的一種自然現(xiàn)象[1]。隨著生物體的不斷衰老[2],機(jī)體不僅會(huì)產(chǎn)生各種組織器官疾病[3],皮膚也會(huì)加速、加重老化,出現(xiàn)皮膚膠原流失、彈性下降、膚色暗沉等現(xiàn)象[4],嚴(yán)重影響生產(chǎn)建設(shè)核心人群的生活和工作體驗(yàn)。根據(jù)第一財(cái)經(jīng)商業(yè)數(shù)據(jù)中心(CBN Data)與聚劃算、強(qiáng)生聯(lián)合發(fā)布的《健康生活消費(fèi)趨勢(shì)報(bào)告》顯示,抗衰老產(chǎn)品已成為天貓等電商平臺(tái)食品、化妝品、保健品等快消品中最熱門(mén)的搜索詞匯之一,且對(duì)消費(fèi)人群的調(diào)查顯示,全年齡段消費(fèi)者對(duì)抗衰老產(chǎn)品均具有強(qiáng)烈需求。

長(zhǎng)期人口干預(yù)研究、實(shí)驗(yàn)室調(diào)查和動(dòng)物研究表明,皮膚老化受到內(nèi)源性因素調(diào)控和外源性因素影響。內(nèi)源性老化主要受到內(nèi)在因素基因組和激素等調(diào)控[2],而外源性老化與外在環(huán)境紫外線和環(huán)境污染等因素均相關(guān)。同時(shí),組織及細(xì)胞內(nèi)部的炎癥、氧化及糖化反應(yīng)也會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成不同程度的損傷[5]。晚期體內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)累積會(huì)消耗細(xì)胞天然存在的等抗氧化成分,產(chǎn)生更多的活性氧(reactive oxygen species,ROS);此外,糖基化也可與細(xì)胞表面受體結(jié)合,被激活后觸發(fā)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路,引發(fā)炎癥反應(yīng)和原有細(xì)胞因子的表達(dá)[6]。隨著各項(xiàng)研究的報(bào)道,人們逐漸認(rèn)識(shí)到營(yíng)養(yǎng)膳食因素與皮膚之間的關(guān)系[7],在飲食模式更健康的人群中,面部細(xì)紋和皺紋更少[8-9],或是皮膚色素變化更少[10],皮膚萎縮和干燥情況更少[11]。因此,尋找有效預(yù)防皮膚衰老發(fā)展的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)方式,對(duì)于延緩炎癥和氧化等途徑引起的衰老具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

酵母提取物是一種天然安全的活性物質(zhì),作為天然調(diào)味料或者油類(lèi)食品的抗氧化劑在食品工業(yè)中有廣泛應(yīng)用[12]。隨著研究的不斷深入,酵母提取物因獨(dú)特的功效[13],已作為一種新型的化妝品原料,應(yīng)用于高檔化妝品中。酵母提取物中富含氨基酸、多肽及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),氨基酸是人體必需的物質(zhì),可以被皮膚輕松吸收,有助于保濕和修復(fù)皮膚屏障,改善皮膚狀態(tài);多肽可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的新陳代謝,讓皮膚變得更加光滑有彈性,并能抑制黑色素的產(chǎn)生。此外,酵母提取物中還含有維生素A、C、E等成分,這些成分具有抗衰老、抗氧化和美白等作用。有研究表明酵母提取物可以通過(guò)抑制或競(jìng)爭(zhēng)的形式降低多酚氧化酶的活性,減少黑色素的形成,并可以抑制B16黑素瘤細(xì)胞中黑素的形成,但對(duì)其增殖無(wú)顯著抑制作用[14]。成纖維細(xì)胞可以不斷產(chǎn)生膠原蛋白、透明質(zhì)酸、彈性纖維等支撐皮膚年輕態(tài)的物質(zhì),令皮膚看起來(lái)光滑有彈性,而來(lái)源于米酒酵母提取物有促進(jìn)成纖維HS68細(xì)胞增殖的功效[15]。研究表明酵母提取物表現(xiàn)出的多種活性多數(shù)都與其含有的谷胱甘肽(glutathione,GSH)相關(guān)[16]。GSH是一種重要的抗氧化劑,由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成,是廣泛存在于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)的同時(shí)具有谷氨酸基和巰基的小分子活性三肽,其結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸殘基含有一個(gè)活潑的巰基,具有強(qiáng)親核特性,可以對(duì)抗活性氧、結(jié)合親電子物質(zhì)或其他氧化代謝產(chǎn)物,具有清除自由基、增強(qiáng)抗氧化物酶活性、提高機(jī)體抗氧化防御能力等重要生理功能[17-19]。GSH有利于皮膚美容和抗衰老,機(jī)體補(bǔ)充GSH(250 mg/d)能夠積極影響皮膚性能,在口服GSH 12周期間,受試者皮膚黑色素指數(shù)、紫外斑(皮膚色素)、局部位置皺紋數(shù)量等衰老指標(biāo)均低于安慰劑組,且皮膚彈性增加的趨勢(shì)也更優(yōu)[20-21]。

鮮有關(guān)于食用酵母提取物有助于改善皮膚衰老的研究報(bào)道。因此,本研究以D-半乳糖誘導(dǎo)建立衰老動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將不同劑量的酵母提取物喂養(yǎng)小鼠一段時(shí)間后,稱(chēng)量體重監(jiān)測(cè)小鼠生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)情況,并利用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色技術(shù),考察血清和皮膚組織中的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo),利用Western Blot檢測(cè)氧化應(yīng)激調(diào)控蛋白的相對(duì)含量,探究食用酵母提取物對(duì)衰老小鼠皮膚老化抗氧化水平的改善作用,為酵母提取物在皮膚抗衰老、美容等功能方向的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母提取物FHG-1(利用高谷胱甘肽酵母進(jìn)行發(fā)酵、洗滌、高壓均質(zhì)破壁、酶解、分離、濃縮以及干燥得到樣品),安琪紐特股份有限公司;雄性ICR小鼠[SCXK(京)2019-0010;NO.110324220100569744],斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),默克公司;NRF-2 Polyclonal Antibody,Proteintech中國(guó)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀,美國(guó)貝克曼;Millipore Elix 15純水儀,默克化工有限公司;ST2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì),奧豪斯儀器(常州)有限公司;EL104電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;80-2離心沉淀器,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;79-1磁力加熱攪拌器,國(guó)華電器有限公司;WB-10L1恒溫水浴鍋,德國(guó)Memmert公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建小鼠皮膚衰老模型和實(shí)驗(yàn)分組

采用D-半乳糖頸背部皮下注射法致小鼠皮膚衰老模型。雄性ICR小鼠,體重(25±5) g,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、陽(yáng)性組(GSH)、酵母提取物低劑量組(LYE)、酵母提取物中劑量組(MYE)、酵母提取物高劑量組(HYE),除對(duì)照組和模型組每組24只外,其余各組12只。適應(yīng)性培養(yǎng)3 d后,對(duì)照組每天灌胃生理鹽水0.2 mL/只,連續(xù)70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射無(wú)菌生理鹽水0.2 mL/只,連續(xù)42 d。模型組每天灌胃生理鹽水0.2 mL/只,連續(xù)70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無(wú)菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續(xù)42 d。GSH:每天灌胃20 mg/kg還原型谷胱甘肽0.2 mL/只,連續(xù)70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無(wú)菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續(xù)42 d。LYE組:每天灌胃85 mg/kg酵母提取物0.2 mL/只,連續(xù)70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無(wú)菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續(xù)42 d。MYE組:每天灌胃170 mg/kg酵母提取物0.2 mL/只,連續(xù)70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無(wú)菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續(xù)42 d。HYE組:每天灌胃340 mg/kg酵母提取物0.2 mL/只,連續(xù)70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無(wú)菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續(xù)42 d。每周稱(chēng)量1次體重。從第71天起,取小鼠糞便,以異氟烷麻醉小鼠,采用眼球摘除放血法處死小鼠,取眼眶血及皮膚組織。劑量選擇[22]設(shè)置依據(jù)為人(以60 kg計(jì))每日攝入GSH的梯度為50、100、200 mg,將GSH折算酵母提取物為417、834、1 668 mg,即對(duì)應(yīng)低劑量、中劑量、高劑量。采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人劑量換算公式(1),得到小鼠灌胃劑量為85、170、340 mg/kg。

HED(mg/kg)=Animal does (mg/kg)×Animal Km/Human Km

(1)

1.3.2 小鼠體重監(jiān)測(cè)

每周對(duì)各組飼養(yǎng)的小鼠進(jìn)行稱(chēng)重,記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.3 皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察

小鼠皮膚固定:將取下的新鮮小鼠皮膚組織置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液中固定,注意存放的EP管中不留空氣。石蠟切片制作:流水沖洗固定的組織,分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、80%、90%各級(jí)乙醇溶液各脫水30 min,再分別經(jīng)95%、100%乙醇各脫水2次,20 min/次。取出脫水的組織置于V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1的混合液15 min,之后再浸入二甲苯兩次,15 min/次直至組織呈現(xiàn)透明狀態(tài)。取出透明的組織放入V(二甲苯)∶V(石蠟)=1∶1的混合液15 min,之后再浸入石蠟2次,60 min/次。透蠟后,將組織置于事先備好的純石蠟蠟?zāi)?進(jìn)行包埋,待凝固后用切片機(jī)切片。脫蠟復(fù)水:將完整的石蠟切片浸入二甲苯中2次,每次20 min,之后用無(wú)水乙醇浸潤(rùn)2次,每次5 min。再用75%乙醇溶液脫蠟5 min后,用蒸餾水浸潤(rùn)。HE染色:切片置于蘇木精染色5 min,蒸餾水洗凈多余染液,10 g/L鹽水溶液分化10 s,繼續(xù)蒸餾水漂洗,以體積分?jǐn)?shù)0.6%氨水浸泡至返藍(lán),蒸餾水流動(dòng)沖洗數(shù)10 s。再將切片置于體積分?jǐn)?shù)85%乙醇和95%乙醇溶液中依次脫水,放入伊紅染液中染色5 min。脫水封片:經(jīng)HE染色切片放入無(wú)水乙醇中脫水3次,每次5 min,再放入正丁醇中5 min,再放入二甲苯中2次,每次5 min直至透明。將切片稍晾干,以中性樹(shù)膠封片。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

利用試劑盒取小鼠血液樣本檢測(cè)血清GSH-Px、MDA、SOD情況。

1.3.5 小鼠皮膚組織調(diào)控蛋白的表達(dá)

將小鼠皮膚組織在RIPA裂解液中徹底均質(zhì),4 ℃低溫離心獲得總蛋白,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后,加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液,高溫水浴5 min變性蛋白質(zhì)。用100 g/L SDS-PAGE對(duì)20 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行取樣,并轉(zhuǎn)移到PVDF上,使用50 g/L脫脂乳粉封閉2 h。洗凈PVDF膜,4 ℃下一抗孵育過(guò)夜,洗凈后,二抗孵育2 h,通過(guò)強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)最終顯示蛋白質(zhì)條帶,并使用Image J圖像分析軟件進(jìn)行蛋白相對(duì)定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 2023進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用ANOVA 單因素分析,P>0.05為無(wú)顯著性差異,P≤0.05為差異性顯著,P≤0.01為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化情況

如表1所示,經(jīng)過(guò)4周喂養(yǎng)和6周造模,各組小鼠體重均有增加,模型組與空白組無(wú)顯著性差異,陽(yáng)性組和酵母組與模型組無(wú)顯著性差異。但與空白組相比,模型組小鼠體重有下降,而經(jīng)GSH或不同劑量的酵母提取物灌胃,小鼠體重較模型組均有增加,并且隨著酵母提取物的劑量增加而呈劑量依賴(lài),這說(shuō)明利用不同劑量的酵母提取物可以改善小鼠營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)情況。

表1 小鼠10周體重變化統(tǒng)計(jì)表 單位:g

2.2 皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

如圖1所示小鼠皮膚組織切片HE染色結(jié)果與空白組相比,模型組表皮層增厚明顯,棘層肥厚,真皮組織增厚,真皮乳頭減少,與表皮的連接緊密性下降,毛囊數(shù)量下降,皮脂腺分布異常,彈力纖維斷裂明顯,膠原纖維等結(jié)締組織增生明顯;陽(yáng)性組與空白組較為接近。經(jīng)過(guò)不同劑量的酵母提取物灌胃后,小鼠皮膚組織表皮層增厚情況有明顯改善。低劑量的酵母提取物灌胃組真皮層較模型組有恢復(fù),但彈力纖維仍斷裂或流失明顯,皮脂腺異常情況較嚴(yán)重,中劑量酵母提取物組與陽(yáng)性組接近,高劑量組皮脂腺雖然分布較少,但彈力纖維和膠原纖維恢復(fù)情況與陽(yáng)性組接近。

a-空白組;b-模型組;c-陽(yáng)性組;d-酵母低;e-酵母中;f-酵母高

2.3 小鼠血液抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

MDA含量、SOD以及GSH-Px是反映機(jī)體抗氧化能力的重要參數(shù)。如圖2～圖4所示,經(jīng)過(guò)D-半乳糖誘導(dǎo)的模型組小鼠,與空白組相比其血清MDA積累量顯著增加,GSH-Px活性升高,盡管SOD活性變化不顯著,但與空白組相比也有提升的作用。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的過(guò)氧化物,在體內(nèi)新陳代謝中起到重要作用,其含量的變化反映了機(jī)體組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[23],被視為細(xì)胞過(guò)氧化損傷程度的標(biāo)志物[24]。圖2結(jié)果表明,D-半乳糖引起小鼠血清產(chǎn)生氧化應(yīng)激,致使MDA釋放,而灌胃GSH的陽(yáng)性組能夠?qū)DA含量下降到空白組水平,灌胃不同劑量的酵母提取物對(duì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的小鼠有不同程度的影響。在低劑量條件下,小鼠血清MDA含量與模型組相比相差不大,說(shuō)明灌胃低劑量的酵母提取物對(duì)小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)未起到明顯的調(diào)節(jié)作用,而當(dāng)劑量提高一倍(中劑量)時(shí),MDA含量下降至與空白組同等水平,劑量再提高結(jié)果和中劑量相差不大,說(shuō)明灌胃中劑量的酵母提取物是小鼠調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)最合適的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給。

圖2 MDA含量變化情況Fig.2 The change of MDA content

如圖3和圖4所示,機(jī)體清除自由基的抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px等,這些酶構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)的防御系統(tǒng),可以通過(guò)一系列連鎖反應(yīng)來(lái)協(xié)調(diào)自由基的清除?？寡趸傅幕钚运綄?duì)于維持超氧自由基和H2O2的穩(wěn)定狀態(tài)具有重要作用,SOD能夠催化活性高的O2-變?yōu)槌蹶庪x子或者H2O2[25],GSH-Px可以分解H2O2和有機(jī)過(guò)氧化物(ROOH),這些是清除自由基的關(guān)鍵,并且能夠催化過(guò)氧化物與GSH反應(yīng),從而起到保護(hù)作用[26]。與空白組相比,模型組的SOD活性有增強(qiáng)的效果,但無(wú)顯著性差異;GSH-Px活性顯著升高,表明D-半乳糖的攝入激活了小鼠機(jī)體酶抗氧化防御系統(tǒng),主要以GSH-Px來(lái)防御氧化應(yīng)激。灌胃GSH及酵母提取物能夠有效調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng),特別是當(dāng)灌胃劑量達(dá)到中劑量時(shí),GSH-Px活性可恢復(fù)到空白組水平,并且當(dāng)劑量再升高時(shí),效果與中劑量無(wú)明顯差異。各實(shí)驗(yàn)組的SOD活性盡管無(wú)顯著性差異,但變化趨勢(shì)與GSH-Px活性一致。

圖3 SOD活性變化情況Fig.3 The change of SOD activity

圖4 GSH-Px活性變化情況Fig.4 The change of GSH-Px activity

2.4 Western Blot蛋白定量結(jié)果

核因子紅血球相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作為細(xì)胞感受氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[27],外界的損傷因素能夠激活Nrf-2并使之轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而啟動(dòng)多種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)局部組織的抗氧化能力,有助于減輕外界損傷因素所造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度[28-29]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),可以通過(guò)活化特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Nrf-2來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù);當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí),親電物質(zhì)誘導(dǎo)一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白發(fā)生構(gòu)象變化而釋放Nrf-2或者通過(guò)誘導(dǎo)信號(hào)調(diào)節(jié)通路激活Nrf-2,進(jìn)而啟動(dòng)編碼抗氧化應(yīng)激蛋白的基因轉(zhuǎn)錄來(lái)保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[30]。如圖5所示,與空白組相比,模型組Nrf-2蛋白顯著降低,陽(yáng)性組和灌胃不同劑量酵母提取物組的Nrf-2蛋白含量顯著提升,其中中劑量的Nrf-2蛋白的含量較高,進(jìn)一步說(shuō)明中劑量的酵母提取物在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷時(shí),發(fā)揮重要的作用,同時(shí)也證實(shí)酵母提取物可以幫助機(jī)體上調(diào)Nrf-2蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù),免受氧化損傷,進(jìn)一步發(fā)揮抗衰老的作用。李萌茹[31]利用黃岑葉提取物調(diào)節(jié)Nrf-2信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá),Nrf-2是參與氧化還原反應(yīng)的敏感轉(zhuǎn)錄因子,也是反映細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指標(biāo)之一,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng),處于抗氧化應(yīng)激的中心地位,從Nrf-2信號(hào)通路著手進(jìn)一步探究黃岑葉提取物的抗衰老作用機(jī)制。

a-Nrf-2 Western Blot蛋白印跡結(jié)果;b-Nrf-2蛋白表達(dá)量

3 結(jié)論

本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)建立皮膚衰老動(dòng)物模型,以GSH作為陽(yáng)性對(duì)照,利用不同劑量的酵母提取物進(jìn)行干預(yù)后,檢測(cè)小鼠血液和皮膚組織。HE染色結(jié)果表明灌胃酵母提取物的小鼠皮膚組織表皮層增厚情況有明顯改善;酵母提取物實(shí)驗(yàn)組小鼠抗氧化酶效果有明顯提升,血清中的GSH-Px活性和MDA含量隨著酵母提取物劑量的增加,抗氧化水平也進(jìn)一步提高,逐漸趨于空白組水平,在中劑量時(shí)可達(dá)到陽(yáng)性組的水平;通過(guò)Nrf-2蛋白相對(duì)定量可知酵母提取物是通過(guò)上調(diào)Nrf-2蛋白來(lái)減輕衰老所造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)。綜上,食用酵母提取物主要是從減輕抗氧化應(yīng)激途徑進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)抗衰老作用,主要是從降低MDA等過(guò)氧化物和提升機(jī)體GSH-Px酶活性等抗氧化防御系統(tǒng)實(shí)現(xiàn),中劑量(170 mg/kg)酵母提取物具有較好的抗氧化效果。