車燦梅

（廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 530011）

葡萄糖是一種碳水化合物，其重要性是不言而喻的。葡萄糖產(chǎn)量較大，運用范圍較廣，是一種常見的單糖，也叫做右旋糖，它廣泛存在于生物體內(nèi)用以維持人體的基本生理功能。無論是藥品行業(yè)、食品行業(yè)還是科學研究領(lǐng)域，葡萄糖含量的測定都是基礎(chǔ)技術(shù)，也是重要的工作環(huán)節(jié)，有關(guān)工作人員需要結(jié)合不同的藥品性質(zhì)選擇合適的檢測方法。如果葡萄糖含量過多，可能會引發(fā)人體中樞神經(jīng)紊亂，引發(fā)糖尿病、視網(wǎng)膜病癥和其他神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病。在方法的選擇過程中要考慮到成本和經(jīng)濟因素，有些方法雖然準確性較高，但是耗費的成本較多，只適合實驗室使用，不適合大規(guī)模投入樣品檢測，具體方法種類和步驟的篩選需要根據(jù)實際情況來決定。

1 DNS 檢測法

使用DNS 檢測藥品中葡萄糖含量可以采用直接滴定的形式。有些雙糖和多糖不具有自動還原的特性，可以加入酸水解法展開還原處理，把多糖還原成單糖再進行成分的測定。在DNS 方法使用的過程中，要科學地計算還原糖和總糖的數(shù)量，還原糖一般會儲存在堿性環(huán)境中，在加熱之后可以產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)并產(chǎn)生多種衍生物。例如在果3，5-二硝基水楊酸發(fā)生還原反應(yīng)之后會變硬、變熱，完成還原糖的供熱效果，之后會形成3-氨基-5-硝基水楊酸，這種產(chǎn)物顏色和之前相較有了一定的變化。在某種程度上，還原糖的含量會影響到其產(chǎn)物顏色的深淺，二者之間的關(guān)系可以依照朗伯比爾定律來測算，在使用DNS 測定方法的時候，如果出現(xiàn)其他有色物質(zhì)說明樣品含量較高，增加了吸光度[1]。有些學者經(jīng)過研究可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和磷鉬雜多酸之間會產(chǎn)生化學反應(yīng)，并進而產(chǎn)生有色衍生物，由此可以判定葡萄糖質(zhì)量濃度和吸光度之間存在關(guān)系，這種關(guān)系是線性的，當然這樣的檢測方法經(jīng)常被運用在注射液的檢測中。在堿性環(huán)境和條件之下，利用DNS 方法可以檢測藥品中少量的葡萄糖含量，葡萄糖本身具有較強的還原性，形成Ag 元素之后可以把三價鐵還原成二價鐵離子，如果使用介質(zhì)的酸堿度保持在5 以下，那么二價鐵可以和鄰菲羅啉直接產(chǎn)生化學反應(yīng)，絡(luò)合物的顏色是橘紅色。

2 試劑檢測法

試劑檢測法的別稱是費林試劑法，費林試劑較為常見，屬于氧化劑的一種，它的主要成分是甲液和乙液，在采用費林試劑法展開葡萄糖含量的測定時需要將甲液和乙液混合在一起形成氫氧化銅，這種化學物質(zhì)會產(chǎn)生絡(luò)合物酒石酸鉀銅。采用次甲基藍進行滴定的過程中，如果顏色變成藍色并溶于溶液，發(fā)生氧化還原反應(yīng)后會變成透明無色狀態(tài)[2]。菲林試劑法可以采用還原糖展開滴定，使用還原糖的時候可以使其中的銅離子發(fā)生還原反應(yīng)，還原反應(yīng)發(fā)生之后再次使用甲基藍變成無色透明狀的液體，這時滴定工作就可以結(jié)束。由此可見，在檢測過程中，使用費林試劑法會使溶液的顏色發(fā)生改變。在藥品加工生產(chǎn)過程中，很多工作人員會采用費林試劑法進行葡萄糖含量的測定，這種方式較為標準，也能夠達到行業(yè)要求。除了藥品企業(yè)外，很多食品生產(chǎn)企業(yè)或發(fā)酵行業(yè)也會采用費林試劑法來檢測葡萄糖的含量，利用手工滴定的形式測定葡萄還原糖的百分比。目前費林試劑法在世界藥品加工產(chǎn)業(yè)的使用歷史已經(jīng)超過了70 年，它的優(yōu)勢是顯著的，操作起來較為便捷，步驟簡單，可以人工來完成，但其缺點也不容忽視，那就是容易受到外界變量的影響，工作人員調(diào)配試劑的實際濃度、滴定過程的加樣量、手工搖動的速度、力度以及手掌的溫度都有可能會對準確性造成負面干擾。除此之外，可以采用全自動還原糖測定儀的方法進行檢測，它的檢測原理和費林試劑的方法是相同的，這種方法從某種程度上來說是依照費林試劑的原理進行了改進和加工，對光電轉(zhuǎn)換設(shè)置展開聯(lián)合應(yīng)用。在具體試劑滴定的過程中可以檢測透光率的具體數(shù)值，其使用根據(jù)應(yīng)當是電壓變化曲線，要對檢測儀器展開系統(tǒng)控制，確定滴定的終點。在還原糖達到滴定終點時要展開全自動控制，從而使還原糖的含量被測定出來，這種方式測定過程較為簡單，并且能夠改進費林試劑由于手工滴定造成的不穩(wěn)定因素。

3 高效液相色譜檢測方法

高效液相色譜檢測（HPLC）是把試劑分成不同的組別同時注入色譜柱之中，觀察流動相和固定相之間的表現(xiàn)狀態(tài)，區(qū)分不同組別的溶解度，檢測及滲透作用和吸附作用，并以此來做出數(shù)值判斷。色譜柱包含不同的組別，每一個組別的移動速度都是不同的，在距離移動后，不同的組別可以實現(xiàn)相互剝離，這一過程中的色譜柱會按照不同的順序流出。接下來工作人員可以采用信號檢測燈或其他檢測設(shè)備進行檢測，確定不同組別的譜峰值，譜峰值的計算需要包括保留時間和保留面積的計算，也可以采用外標法展開定量檢測。有些學者把高效液相色譜法運用在藥品高果糖漿葡萄糖含量的檢測工作中，選擇水作為流動相，將水的流速設(shè)定為每分鐘1mL，檢測時也可以采用外標法或者視差折光方法[3]。在以上數(shù)值的規(guī)定范圍之內(nèi)，經(jīng)過實驗可以發(fā)現(xiàn)葡萄糖的線性均勻程度比較好，葡萄糖的R 值是0.9997，回收率是99.6%，而果糖的數(shù)值則不同，除了葡萄糖之外，蔗糖、麥芽糖和乳糖含量的檢測都可以采用高效液相色譜法。具體檢測時可以利用水超聲波把樣品浸泡其中，之后再應(yīng)用Hypersil NH2柱進行分離處理，同樣是以水作為流動柱，利用激光蒸發(fā)光散射檢測儀進行含量對比和檢測，計算葡萄糖、蔗糖、麥糖和乳糖的線性范圍值。在鹽酸氨基葡萄糖膠囊中檢測葡萄糖含量依然可以采用高效液相色譜法，具體檢測可以選擇Diamonsil TM C8 Column 色譜柱，同時把硫酸銨作為流動相，速度設(shè)置在每分鐘0.6mL，波長設(shè)置為200，溫度保持在40℃以下。通過分析檢測數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，樣本依然存在線性關(guān)系，回收率可以超過99%，將高效液相色譜法運用在氨基葡萄糖的檢測過程中，可以聯(lián)合采用Waters Carbohydrate色譜柱，以此為基礎(chǔ)，利用蒸發(fā)光散射檢測儀進行峰值檢測，根據(jù)峰面成績進行數(shù)值計算和公式分析，做好線性回歸比對，進樣量保持在2.0～12ug 之間的時候二者之間存在不錯的線性關(guān)系，回收率也可以高達96%。

目前，隨著高效液相色譜法本身技術(shù)的不斷發(fā)展，這種方式在更大的范圍中得到了推廣和使用。離子色譜法是高效液相色譜法其中的一個分支，它的運用較為常見，有關(guān)使用儀器和工具設(shè)備也處在快速運行與發(fā)展階段。有些學者開辟了創(chuàng)新檢測觀念，利用高效陰離子做好交換脈沖安培檢測，這一檢測方式可以同時檢測八種單糖和兩種以上的糖醛酸，大大提高了檢測效率。同時，高效液相色譜法在經(jīng)過創(chuàng)新后還可以檢測多糖水解液的糖含量以及木材半纖維素水解液中的單糖含量，具體檢測時可以采用CarboPacPA20 陰離子作為交換柱，分離柱中含有多種以上的單糖，接下來再采用2mmol/L 的NaOH 溶液做好單糖脫洗處理。在脫洗過程中，流速可以設(shè)置為每分鐘0.5mL，時間長度要超過30 分鐘，在測定過程中要采用合適的處理環(huán)境和處理手段。

4 分光光度檢測法

運用分光光度法測定葡萄糖的含量能夠達到較高的準確度，其檢測的過程如下：首先是要配制溶液，配置顯色劑的時候可以選擇3，5－二硝基水楊酸7g左右，在其中加入水溶解之后將其放到棕色試劑瓶之中，再取用80g 左右的氫氧化鈉，同樣用水溶解后配制成氫氧化鈉溶液，轉(zhuǎn)移到含有3，5－二硝基水楊酸的棕色瓶之中，接下來再加入丙三醇50g左右搖晃均勻，放置冷卻。配置系列標準溶液的時候需要將葡萄糖放在烘箱中烤干，之后放在干燥器最終保存，以備使用。烘好的葡萄糖選擇10g 左右加入水溶解轉(zhuǎn)至容量瓶；其次是要選擇測量的波長。用吸量管選取2mL 左右配置好的濃度溶液，分別加入25mL 左右的容量瓶，再加入3，5－二硝基水楊酸溶液，用蒸餾水稀釋到刻度線左右，搖晃均勻，采用水浴加熱法兩分鐘，等待其自然冷卻，實驗對照組可以采用未加入葡萄糖溶液的試劑，每隔20nm 左右測試吸光度一次[4]。根據(jù)實驗可以發(fā)現(xiàn)，最大的吸收波長大致為500nm 左右，但是分光光度檢測儀最佳的吸收范圍在0.8a 以下，因此最大吸收波長應(yīng)當為540nm。接下來需要確定DNS 顯色試劑量，顯色試劑可以稍稍多添加一些，但如果加入太多也容易引起副作用，可以選擇25mL 的容量瓶，加入1mL 左右濃度不同的葡萄糖標準溶液隔水加熱，再等到自然冷卻。相同條件下不加葡萄糖的溶液作為對照組，在540nm 的條件下檢測吸光度值。根據(jù)實驗可以觀察到，DNS 顯色試劑用量和吸光度數(shù)值呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，用量增大吸光度值也會上升。但是DNS用量繼續(xù)加大時，一旦超過了1.5mL，吸光度值就不再上升，反而趨于平緩，因此DNS 的實際用量標準應(yīng)當確定為1.5mL 左右。以上工作完成后要進行的是葡萄糖標準工作曲線的繪制，按照標準曲線回歸方程繪制關(guān)系圖，根據(jù)關(guān)系圖可以發(fā)現(xiàn)，DNS 試劑在反應(yīng)之后的吸光度值和葡萄糖濃度之間存在線性關(guān)系，有關(guān)工作者可以根據(jù)標準曲線法來測試不同藥品和未知溶液中的葡萄糖。葡萄糖雙極產(chǎn)生電化學反應(yīng)，這樣的方式可以讓葡萄糖的轉(zhuǎn)化率被計算出來，接下來再把電解液進行濃度稀釋，獲得最佳條件下的吸光度數(shù)據(jù)。除此之外，還要利用葡萄糖標準液和DNS 試劑展開重復(fù)性實驗，當葡萄糖溶液和顯色劑反應(yīng)液濃度相同的時候，波長540nm 節(jié)點處吸光度標準值偏差較小，證明此數(shù)值具有不錯的重復(fù)價值，準確率較高。

5 生物傳感器檢測法

在使用生物傳感器檢測的時候，可以利用葡萄糖氧化酶產(chǎn)生催化反應(yīng)，在這一反應(yīng)過程中，葡萄糖可以變成過氧化氫，過氧化氫酶也就是HRP 可以對雙氧化物產(chǎn)生催化作用，在具體的反應(yīng)層工作狀態(tài)中，還原態(tài)電介質(zhì)可以發(fā)生氧化還原，反應(yīng)之后工作電壓會降低，氧化碳介質(zhì)也會隨即發(fā)生還原電流。這一過程主要是對還原電流展開檢測，檢測的數(shù)值就可以計算出葡萄糖的濃度。在常用的薄膜金電極的基礎(chǔ)之上，有些學者可以利用氧化還原聚合物展開處理，氧化還原聚合物相對于傳統(tǒng)的電子轉(zhuǎn)移來說工作效率較高，也可以根據(jù)固定酶結(jié)合生物傳感器設(shè)備對低濃度的葡萄糖進行微量元素檢測[5]。處理固定酶的過程中可以利用光聚合方法和交聯(lián)方法，在傳感器的支配過程中可以采用交聯(lián)法將其運用在少量葡萄糖測定中，穩(wěn)定性較強，優(yōu)勢是顯著的。也有些學者混合了石墨粉和環(huán)氧樹脂運用在傳感器檢測中，這一端作為陽極，陰極的配置則選用鈦基RuO2/TiO2涂層，利用浸漬涂膜法提高GOD 的固定和響應(yīng)速度，擴大了線性檢測數(shù)值的覆蓋范圍，檢測結(jié)果趨向于穩(wěn)定并且準確性較高。在傳感器的設(shè)備制備過程中，如果選用電極材料可以很好地控制成本，經(jīng)濟性較強，因此擁有不錯的發(fā)展前景。

除此之外，如果把納米銀和金復(fù)合顆粒相互混合可以制作成復(fù)合固定化酶膜基質(zhì)，利用GOD 進行凝膠法固定處理，形成葡萄糖生物傳感器，這種生物傳感器運用在葡萄糖檢測中顯著提高了電極響應(yīng)的流量，從這里可以看出納米顆粒效應(yīng)的作用是顯著的。

6 結(jié)語

測量藥品中葡萄糖的含量有多種方法，各種檢測方法都有自身的相關(guān)特征以及優(yōu)缺點。常用的方法有DNS 檢測法、試劑檢測法、高效液相色譜檢測法等，具體使用何種方式需要根據(jù)實際情況而定。在葡萄糖含量檢測未來發(fā)展的過程中，不僅需要對現(xiàn)在已有的檢測方法進行更新完善，而且還要不斷地加強研發(fā)力度，開發(fā)出更加高效、經(jīng)濟且精準的檢測方法。