熊雄，薛晗玥，費延堻，王詩慧，謝普軍

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211800；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇南京 210042）

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000 年由Notomi 等[1]首次公開的一種核酸等溫擴增技術(shù)。該技術(shù)在靶標的6 個區(qū)域上設(shè)計4 條特異性引物，并利用具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶在等溫條件下進行反應(yīng)。自公開以來，LAMP 技術(shù)憑借快速、高效、特異性強等特點，在食品摻假檢測[2-3]、人類流行病檢測[4-5]、植物病害檢測[6-7]等方面已得到廣泛應(yīng)用。

LAMP 反應(yīng)需要使用多對引物，集中在體系時容易相互作用形成二聚體結(jié)構(gòu)。此外，內(nèi)引物的長度較長，導(dǎo)致自身錯配易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)[8]，最終產(chǎn)生非特異性擴增[9]。染料法等傳統(tǒng)方法無法區(qū)分由非特異性擴增導(dǎo)致的假陽性，造成結(jié)果誤判。而序列特異性檢測方法則是通過使用靶標特異性探針或修飾引物作為生物識別元件來進行結(jié)果判斷，能夠準確檢測出擴增子且不受非特異性產(chǎn)物的影響[10]。目前，基于LAMP 所設(shè)計的探針包括同化探針[11]、熒光雙向位移探針[12]、自淬滅探針[13]和分子信標[14-15]等。其中，自淬滅探針具有設(shè)計簡單、靈敏度高等特點，在LAMP 中逐漸受到關(guān)注[13]。

自淬滅探針是熒光基團修飾在內(nèi)引物或環(huán)引物3′端第2、3 位的寡核苷酸序列，其中內(nèi)引物和環(huán)引物以G、C 堿基結(jié)尾并盡可能保證3′端存在豐富的G 堿基[13]。自淬滅探針利用氧化電位低的堿基發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（photoinduced electron transfer，PET）淬滅熒光，僅當結(jié)合靶標后淬滅才會消失[16]。目前，由于自淬滅探針在反應(yīng)后陽性和陰性表現(xiàn)出肉眼無法區(qū)分的熒光，因此利用自淬滅探針進行LAMP 檢測的方法主要包括實時熒光或結(jié)合其他技術(shù)實現(xiàn)可視化。如Gadkar等[13]將環(huán)引物設(shè)計成自淬滅探針檢測水痘-帶狀皰疹病毒，反應(yīng)后根據(jù)實時熒光曲線判斷是否檢出靶標。而在可視化檢測中，Li 等[17]將自淬滅探針與聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）結(jié)合，反應(yīng)后根據(jù)是否出現(xiàn)具有熒光的聚沉物來實現(xiàn)結(jié)果判斷。

關(guān)于自淬滅探針背景熒光的研究，Nazarenko等[18-19]介紹了一種與自淬滅探針結(jié)構(gòu)類似的熒光標記鏈，其與互補序列結(jié)合后出現(xiàn)熒光淬滅，同時利用互補序列淬滅熒光設(shè)計了具有鈍端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光引物，實現(xiàn)了多重聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的可視化檢測。然而，在LAMP 的可視化研究中，利用互補序列降低自淬滅探針背景鮮見報道。

因此，本研究以自淬滅探針為研究對象，評估其背景熒光強度和淬滅效率，通過對比不同互補序列對自淬滅探針的淬滅效率，篩選得到設(shè)計簡單且淬滅效率高的互補序列。最終，構(gòu)建出具有低背景熒光的LAMP 體系，為實現(xiàn)基于自淬滅探針的LAMP 可視化檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BstDNA 聚合酶、100 mmol/L MgSO4、10×Thermo-Pol Buffer：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；dNTP預(yù)混液：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；自淬滅探針和引物合成：通用生物（安徽）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1010 掌上離心機：美國賽洛捷克公司；MS-100 恒溫混勻儀：杭州奧盛儀器有限公司；Gentier 96 全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)：西安天隆科技有限公司；F-4700 熒光分光光度計：日本Hitachi 公司；BleEye 藍光切膠儀（藍光LED，波長470 nm）：蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 互補序列的設(shè)計

5 種自淬滅探針來自前期研究，包括BIP-FAM[20]、ZJ-FAM[21]、R-FIP-FAM[17]、S-LB-6-FAM[22]和R-LBFAM[17]。該5 種自淬滅探針均可應(yīng)用于對應(yīng)物種的LAMP 擴增，滿足基于實時熒光的LAMP 檢測。同時，根據(jù)自淬滅探針的堿基排列順序進行反向互補得到互補序列[16]，并分別對互補序列進行引入錯配堿基、延長5′端、縮短5′端和縮短3′端的改造，具體見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences

1.3.2 熒光強度測定

將2.5 μL 的10×ThermolPol Buffer、2 mmol/L MgSO4、0.8 μmol/L 或0.4 μmol/L 的自淬滅探針（其中BIP-FAM、ZJ-FAM 和R-FIP-FAM 為0.8 μmol/L，S-LB-FAM 和RLB-FAM 為0.4 μmol/L）以及0.8 μmol/L 或0.4 μmol/L的互補序列混合，并使用無菌水補足20 μL。利用全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)收集35～97 ℃范圍內(nèi)的熒光，并對35 ℃的熒光強度進行記錄。

全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)能夠測定的最低溫度為35 ℃，因此使用熒光分光光度計測定不同溫度混合體系熒光。將配制的20 μL 體系添加至480 μL 滅菌水中稀釋，充分混合。稀釋好的體系分別在-4 ℃、室溫、35 ℃和45 ℃內(nèi)處理30 min。熒光分光光度計的激發(fā)波長設(shè)置為470 nm，掃描速度為1 200 nm/min，光譜帶寬為10 nm，測定不同處理條件下的體系熒光強度。熒光淬滅效率（Kq，%）計算公式如下。

式中：A為起始自淬滅探針熒光強度；B為結(jié)合互補序列后的熒光強度。

1.3.3 LAMP 可視化反應(yīng)體系構(gòu)建

20 μL LAMP 反應(yīng)體系，各成分含量：內(nèi)引物FIP、BIP 各0.8 μmol/L，外引物F3、B3 各0.2 μmol/L，環(huán)引物L(fēng)F、LB、自淬滅探針R-LB-FAM 和互補序列R-LBFAM-HP4 各0.4 μmol/L，0.45 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，2 mmol/L MgSO4、8 UBstDNA 聚合酶、1 μL 虹鱒魚DNA（20 ng/μL），用無菌水補足20 μL。LAMP 擴增條件為63 ℃恒溫擴增60 min[3]。反應(yīng)結(jié)束后體系恢復(fù)至室溫，利用藍光切膠儀觀察體系熒光，判斷反應(yīng)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)利用Excel 和SPSS 27 軟件進行處理統(tǒng)計，并使用Duncan 法多重比較及差異顯著性分析，P＜0.05 認為具有顯著差異。采用Origin 2022 軟件繪制分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 互補序列對自淬滅探針熒光強度的影響

自淬滅探針與互補序列結(jié)合后熒光強度會發(fā)生降低[18]。為探究自淬滅探針熒光強度的影響因素，測定不同自淬滅探針的熒光強度及結(jié)合互補序列后的熒光強度變化，分析影響自淬滅探針熒光強度的原因。不同自淬滅探針和其互補序列結(jié)合的熒光強度見圖1。

圖1 不同自淬滅探針和其互補序列結(jié)合的熒光強度Fig.1 Fluorescence intensity of different self-quenching fluorogenic probes combined with their complementary sequences

由圖1 可知，根據(jù)Gadkar 等[13]所述方法設(shè)計的自淬滅探針均存在較高的背景熒光，表明基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的熒光淬滅效果較弱。其中，添加量相同時，BIP-FAM 熒光強度顯著高于R-FIP-FAM（P＜0.05），說明熒光基團修飾位置越靠近3′末端G 堿基，自淬滅探針的淬滅效果越強，背景熒光強度越低。而ZJ-FAM的熒光強度顯著高于R-FIP-FAM（P＜0.05），說明當3′末端為G 堿基時，自淬滅探針的熒光強度更低，G 的淬滅效果更好。

在添加與自淬滅探針完全互補的序列時（BIPHP1、ZJ-FAM-HP1、R-FIP-FAM-HP1、R-LB-FAM-HP1和S-LB-FAM-HP1），自淬滅探針的背景熒光均顯著降低（P＜0.05），與Nazarenko 等[18]的研究結(jié)果一致。可能的原因是當自淬滅探針與完全互補序列退火結(jié)合時，電子會沿著DNA 雙鏈進行傳輸，產(chǎn)生比單鏈DNA 狀態(tài)下更強的淬滅[23]。

ZJ-FAM-HP1、R-LB-FAM-HP1 和S-LB-FAM-HP1對自淬滅探針具有良好的淬滅效果，Kq分別為79.73%、71.87%和68.14%。然而，BIP-HP1 和R-FIP-HP1 對自淬滅探針的淬滅效率Kq分別僅為45.08%和43.44%。該結(jié)果表明互補序列對熒光基團修飾在3′端第2 位的自淬滅探針淬滅效果更強，印證了Nazarenko 等[18]關(guān)于熒光基團距離3′末端GC 堿基對距離越遠淬滅效率低的結(jié)論。而對于同樣修飾在熒光基團3′端第2 位的自淬滅探針而言，由推導(dǎo)公式可得具有高背景熒光的自淬滅探針，添加互補序列后可對其表現(xiàn)出高淬滅效率。

由于自淬滅探針BIP-FAM 背景熒光信號高，且BIP-HP1 對其淬滅效率低。因此，選擇互補序列BIPHP1，進行改造和后續(xù)試驗。

2.2 互補序列上的堿基錯配對自淬滅探針熒光強度的影響

互補序列上的堿基錯配對自淬滅探針熒光強度的影響見圖2。

圖2 互補序列上的堿基錯配對自淬滅探針熒光強度的影響Fig.2 Effect of base mispairing on complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

如圖2 所示，調(diào)整BIP-HP1 中與熒光基團修飾位點T 配對的堿基A 為T，C 和G，分別得到互補序列BIP-HP-1tbT、BIP-HP-1tbC 和BIP-HP-1tbG。當自淬滅探針與此類互補序列結(jié)合時，熒光強度均出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）。其中BIP-HP-1tbC、BIP-HP-1tbG 和BIPHP1 結(jié)合自淬滅探針后的熒光強度差異均不顯著（P＞0.05），說明BIP-HP-1tbC 和BIP-HP-1tbG 均可以表現(xiàn)出與完全互補序列相同程度的淬滅效果。

然而，BIP-HP-1tbT 雖然對自淬滅探針表現(xiàn)出顯著淬滅（P＜0.05），但其淬滅效率（Kq為34.77%）明顯低于BIP-HP1、BIP-HP-1tbC 和BIP-HP-1tbG（Kq分別為45.08%、47.50% 和43.02%）。由此可知，改造互補序列，形成存在錯配堿基對的雙鏈，難以提高對自淬滅探針的淬滅效果，并且當錯配位點的堿基由A 顛換為T時，反而會降低淬滅效率。

2.3 互補序列的5′端延長對自淬滅探針熒光強度的影響

研究提出，互補序列的5′端延長會對自淬滅探針熒光強度產(chǎn)生不同影響[16]。因此，分別以3 種方式對互補序列的5′端延長，探究不同類型互補序列對自淬滅探針的淬滅能力，結(jié)果見圖3。

圖3 互補序列的5′端延長對自淬滅探針熒光強度的影響Fig.3 Effect of lengthened 5′end of the complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

如圖3 所示，首先在互補序列的5′端分別增加1 個和2 個A、T、C 堿基。延長后的互補序列結(jié)合自淬滅探針后熒光強度表現(xiàn)出顯著下降（P＜0.05），互補序列延長2 個堿基比延長一個堿基后結(jié)合自淬滅探針呈現(xiàn)出更強的熒光強度。說明非互補區(qū)域增加的堿基會提高DNA 鏈的整體電阻，阻礙電子在DNA 雙鏈間的傳輸，使得互補序列對自淬滅探針的淬滅效果減弱[16]。

第2 種延長方式是在互補序列的5′端增加GTAG和GG 堿基[圖3（B）]。第3 種延長是從與自淬滅探針互補19 個堿基的互補序列BIP-HP13 開始，在其5′端添加GTAG 和GG 堿基[圖3（C）]。兩種延長方式得到的互補序列在結(jié)合自淬滅探針時不僅熒光強度顯著降低（P＜0.05），而且淬滅后的熒光強度與完全互補序列淬滅的熒光強度相近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。毛慧慧[16]提出熒光基團的電子不僅可以沿著DNA 鏈傳輸，而且可以與互補序列中非互補區(qū)域的堿基進行電子轉(zhuǎn)移。G 最容易失電子，對熒光基團淬滅作用最大，更易產(chǎn)生顯著降低的熒光強度。因此，推測在互補序列的5′端增加G 堿基，仍可保持對自淬滅探針熒光的淬滅。

2.4 互補序列的5′端縮短對自淬滅探針熒光強度的影響

為確定能夠?qū)ψ源銣缣结槦晒猱a(chǎn)生淬滅的最短互補序列，從互補序列5′端開始進行縮短，優(yōu)化互補序列的設(shè)計?；パa序列的5′端縮短對自淬滅探針熒光強度的影響見圖4。

圖4 互補序列的5′端縮短對自淬滅探針熒光強度的影響Fig.4 Effect of shortened 5′end of the complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

對互補序列的長短進行優(yōu)化，從互補序列5′端開始逐個減少堿基，篩選合適的互補序列進行對自淬滅探針的淬滅。如2.1 所述，在添加與自淬滅探針完全互補的序列BIP-HP1 時，自淬滅探針的背景熒光顯著降低（P＜0.05）。

當添加互補序列BIP-HP2 至BIP-HP6 時，僅BIPHP2 與自淬滅探針結(jié)合，自淬滅探針背景熒光強度發(fā)生顯著降低（P＜0.05），BIP-HP3、BIP-HP4 和BIP-HP5添加入自淬滅探針后，熒光強度無明顯差異，與自淬滅探針自身熒光強度相近。但BIP-HP6 退火結(jié)合自淬滅探針后，熒光強度反而出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。由于退火后形成的雙鏈末端不存在GC 堿基對，故此部分熒光強度發(fā)生變化可能是由PET 和雙鏈淬滅雙重因素引起的。

最后，BIP-HP7、BIP-HP8 和BIP-HP9 加入自淬滅探針后，熒光強度與自淬滅探針熒光強度差異不顯著（P＞0.05）。研究表明，PET 需要經(jīng)過范德瓦爾斯接觸才可發(fā)生，BIP-FAM 中熒光基團修飾位點位于序列3′端第3 位，BIP-HP7 與熒光基團修飾位點相距3 個堿基長度[24]。因此，BIP-HP7 及更短的互補序列與自淬滅探針結(jié)合后不影響PET 的進行，熒光強度不會表現(xiàn)出顯著差異。

2.5 互補序列的3′端縮短對自淬滅探針熒光強度的影響

確定對自淬滅探針熒光產(chǎn)生顯著淬滅的最短互補序列，從3′端縮短互補序列，再對其與自淬滅探針結(jié)合的熒光強度進行測定，結(jié)果見圖5。

圖5 互補序列的3′端縮短對探針熒光強度的影響Fig.5 Effect of shortened 3′end of the complementary sequences on the fluorescence intensity of the self-quenching fluorogenic probe

從互補序列BIP-HP13 開始，按照梯度依次從3′端進行縮短，得到互補序列BIP-HP16、BIP-HP17 和BIP-HP18。當加入此類互補序列時，自淬滅探針的熒光強度呈現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），且各個組合之間的熒光強度與完全互補序列結(jié)合自淬滅探針時的熒光強度相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明對BIP-FAM 而言，與3′端互補10 個堿基的序列也可以對自淬滅探針熒光強度產(chǎn)生顯著淬滅。

對自淬滅探針R-FIP-FAM、ZJ-FAM 和S-LB-FAM分別設(shè)計與3′端互補10 個堿基的互補序列。由圖5（B）所示，自淬滅探針分別退火結(jié)合各自互補10 個堿基的互補序列后，熒光強度均表現(xiàn)出顯著下降（P＜0.05），且熒光強度與各自完全互補序列退火結(jié)合后的熒光強度相近，表現(xiàn)出程度相仿的淬滅效果。因此推斷，對于所有自淬滅探針，3′端互補序列可實現(xiàn)對自淬滅探針的顯著淬滅。

2.6 互補序列解鏈溫度和環(huán)境溫度對自淬滅探針熒光強度的影響

解鏈溫度是指雙鏈DNA 分子在變性過程中，50%的堿基對變?yōu)閱捂湑r的溫度[25]。因此，溶解溫度（melting temperature，Tm）值和環(huán)境溫度的關(guān)系，會直接影響互補序列與自淬滅探針的退火結(jié)合，能否形成穩(wěn)定的DNA 雙鏈，是自淬滅探針淬滅的重要影響因素?；パa序列Tm 值和環(huán)境溫度自淬滅探針熒光強度的影響見圖6。

圖6 互補序列Tm 值和環(huán)境溫度對自淬滅探針熒光強度的影響Fig.6 Effect of melting temperature and ambient temperature of complementary sequence on the fluorescence intensity of selfquenching fluorogenic probe

如圖6（A）所示，在自淬滅探針R-LB-FAM 中，結(jié)合與其互補10 個堿基的互補序列R-LB-FAM-HP2（Tm 值28.88 ℃）后，熒光強度未出現(xiàn)顯著下降。延長R-LB-FAM-HP2 的3′端堿基，得到11 個堿基長度的RLB-FAM-HP3（Tm 值34.55 ℃）和12 個堿基R-LB-FAMHP4（Tm 值41.79 ℃）。自淬滅探針加入延長后的互補序列時，熒光強度與完全互補序列結(jié)合自淬滅探針時接近，相比自淬滅探針熒光強度均呈現(xiàn)出顯著降低（P＜0.05）。表明通過增加堿基得到Tm 較高的互補序列，可以提高結(jié)合自淬滅探針后的雙鏈穩(wěn)定性，電子會沿著穩(wěn)定的DNA 雙鏈進行傳輸，產(chǎn)生更強的淬滅。

如圖6（C）所示，由R-LB-FAM 和R-LB-FAM-HP2配制的體系在4 種溫度下表現(xiàn)出不同的熒光強度。-4 ℃處理30 min 后的體系具有最低的熒光強度，而室溫放置30 min 的體系熒光強度出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），35 ℃和45 ℃處理的體系相比前兩者，熒光強度均表現(xiàn)出顯著上升（P＜0.05）。說明環(huán)境溫度高于Tm 值時，雙鏈DNA 分子中部分雙鏈變成單鏈，淬滅效果明顯減弱，熒光強度隨之升高。而35 ℃和45℃處理后的體系熒光強度差異不顯著（P＞0.05），則表明在大于Tm 值的溫度下，R-LB-FAM-HP2 無法與R-LB-FAM 退火結(jié)合，無法形成雙鏈DNA，不能對自淬滅探針起到淬滅作用。

因此，當短的互補序列對自淬滅探針無法產(chǎn)生顯著淬滅時，通過延長互補序列提高Tm 值或通過降低環(huán)境溫度可以重新恢復(fù)超淬滅。對于互補序列淬滅自淬滅探針時，互補序列Tm 值應(yīng)高于環(huán)境溫度，可以形成穩(wěn)定的DNA 雙鏈，保證自淬滅探針的顯著淬滅。

2.7 LAMP 可視化體系驗證

以虹鱒魚（Oncorhynchusmykiss）為例，建立LAMP體系進行可視化驗證，結(jié)果見圖7。

圖7 LAMP 體系驗證結(jié)果Fig.7 Result of LAMP system

如圖7（A）和圖7（C）所示，反應(yīng)前LAMP 體系陽性驗證和空白對照表現(xiàn)為統(tǒng)一的熒光強度，不添加互補序列的LAMP 體系均為明亮的熒光，而添加互補序列的體系表現(xiàn)為微弱的熒光，說明互補序列在LAMP 體系依然能夠穩(wěn)定地降低自淬滅探針背景熒光。然而當反應(yīng)結(jié)束，不添加互補序列的體系陽性和陰性仍保持著難以分辨的熒光[圖7（B）]，添加互補序列的體系的可視化則出現(xiàn)了易于區(qū)分的差異，陽性呈現(xiàn)明亮的熒光，空白對照則表現(xiàn)出與反應(yīng)前一致的低熒光[圖7（D）]。由此說明，互補序列不僅能夠在反應(yīng)前對LAMP 體系中的自淬滅探針產(chǎn)生淬滅，而且在反應(yīng)結(jié)束恢復(fù)至室溫時能夠恢復(fù)對自淬滅探針的淬滅。同時，該互補序列在體系中未對陽性產(chǎn)生明顯抑制，陽性驗證在反應(yīng)后得到了與不添加互補序列體系一致的明亮熒光。

3 結(jié)論

本研究以自淬滅探針為研究對象，篩選具有降低自淬滅探針背景熒光的互補序列，并將其應(yīng)用于LAMP 中，實現(xiàn)基于自淬滅探針的LAMP 可視化檢測。結(jié)果表明，3′端縮短的互補序列Tm 值大于室溫的情況下，可以使自淬滅探針熒光發(fā)生顯著降低（P＜0.05）。并且該互補序列加入到LAMP 體系中，可在不影響擴增反應(yīng)的前提下降低體系的背景熒光。本研究所建立的基于自淬滅探針的LAMP 快速可視化檢測方法，能在反應(yīng)結(jié)束后直接通過肉眼觀察得到結(jié)果，簡化了LAMP 的檢測流程，對實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。