石志嬌，唐軍榮，向建英，闞歡，趙平，張貴良，劉云＊

（1.西南林業(yè)大學西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南昆明 650224）（2.云南省高校大健康類森林資源開發(fā)利用工程研究中心，云南昆明 650224）（3.云南大圍山國家級自然保護區(qū)管護局河口管護分局，云南河口 661399）

云南金花茶（Camellia fascicularis）又稱簇蕊金花茶、云南顯脈金花茶，是云南特有的一個極小種群植物，含有多種對人體有益的維生素、微量元素、氨基酸以及黃酮、多酚等成分[1]。據(jù)研究報道，金花茶對于調(diào)節(jié)人體血脂、血糖、膽固醇等具有明顯效果，可改善因高血壓引起的各種不適癥狀[2]，具有極高的開發(fā)價值。作為金花茶組的一個種，云南金花茶在育種方面的研究較為深入，在活性物質(zhì)方面如黃酮、多酚等的研究包括了含量評價[3]、提取方法優(yōu)化和抗氧化活性[4,5]、抗炎活性[6,7]以及抗腫瘤活性[8]等的測定。云南金花茶是云南特有的藥食同源性植物，目前對其在人體中的消化釋放和吸收利用情況還未見任何報道，因此，為了充分考慮其活性物質(zhì)在人體消化過程中的變化情況，更好地了解云南金花茶活性物質(zhì)與健康之間的聯(lián)系和所涉及的機制，在體外模擬人體消化的生理過程就顯得尤為必要。

體外模擬消化是基于人體體內(nèi)消化環(huán)境和生理過程而在體外建立相似的條件來模擬人體消化過程的一種模型，這種模型可以綜合模擬人體口腔、胃、小腸和大腸的消化過程，靈活簡單、應用范圍廣泛并且重現(xiàn)性較好[9]。目前，體外模擬胃腸消化模型已廣泛用于研究功能性食品中生物活性化合物的變化、生物可及性和生物活性的變化等[10]。

黃酮、多酚等活性物質(zhì)對由自由基鏈反應引起的氧化、過氧化等炎癥反應具有很重要的調(diào)節(jié)和抑制作用[11,12]，然而，人體胃腸道的物理和生化特性可能會影響植物中活性物質(zhì)的存在形式及其功能活性。因此，本研究通過胃腸道消化模型來探索云南金花茶葉片在消化過程中總黃酮、總多酚的釋放情況，并測定其消化階段中的自由基清除能力、鐵離子還原能力以及脂質(zhì)過氧化抑制能力，以此來評價云南金花茶在不同消化時間段內(nèi)總黃酮、總多酚含量及活性變化之間的關系，為擴大云南金花茶應用范圍提供思路，可以為進一步研究云南金花茶多酚消化吸收機制提供一定的理論依據(jù)，這對于推進云南金花茶產(chǎn)品化進程具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南金花茶葉片，于2021 年采自云南河口。

沒食子酸、蘆丁、福林酚、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽、大豆卵磷脂，上海源葉生物科技有限公司；DPPH、ABTS，合肥博美生物科技有限責任公司；TBA，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YXFT3MP pH 計，上海梅特勒-托利多精密儀器有限公司；SpectraMax190 酶標儀，上海美谷分子儀器有限公司；THZ-82A 數(shù)顯恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司；TG16-WS 離心機，湖南邁克爾實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 云南金花茶粗提液制備

準確稱取0.4 g 云南金花茶葉粉末，加入20 mL甲醇，40 ℃超聲提取30 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，重復提取2 次，合并提取液備用。

1.3.2 體外模擬胃腸消化

參照尹瑞旸等[13]的方法略作修改，對云南金花茶葉片模擬胃腸消化。

模擬口腔消化：于50 mL 離心管中加入0.4 g 云南金花茶粉末，后加入20 mL 口腔電解液（20 mg NaCl，30 mg KCl，12 mg CaCl2溶解于100 mL 蒸餾水），2 mLα-淀粉酶（活力為100 U/mL）將pH值調(diào)至6.6，37 ℃ 120 r/min 下震蕩10 min，離心取上清液備用。

模擬胃消化：口腔殘留樣用0.1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至2.0，終止α-淀粉酶作用，加入10 mL 胃電解液（775 mg NaCl，275 mg KCl，37.5 mg CaCl2，150 mg NaHCO2溶解于250 mL 蒸餾水），2 mL 酶液（0.5 g 胃蛋白酶溶于100 mL 的0.03 mol/L NaCl溶液），37 ℃ 120 r/min 下震蕩2 h，分別于0、30、60、90、120 min 時取樣8 mL 進行指標測定。

模擬腸消化：口腔-胃殘留樣用0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH 值至7.0，終止胃蛋白酶作用，加入10 mL 腸電解液（540 mg NaCl，65 mg KCl，33 mg CaCl2溶解于100 mL 蒸餾水）及2 mL 胰蛋白酶-膽鹽混合液，37 ℃ 120 r/min 下震蕩4 h，分別于0、30、60、120、180、240 min 時取樣8 mL 進行指標測定。

1.3.3 總黃酮、總多酚含量測定

總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉法[14]，以蘆丁為標準品在510 nm 處測得的吸光度（y1）對濃度（x1）進行回歸，得到回歸方程為y1=0.046 46+0.001 04x1，R12=0.999，以此進行樣液中總黃酮含量測定?？偠喾雍繙y定采用福林酚法[15]，以沒食子酸為標準品在765 nm 處測得的吸光度（y2）對濃度（x2）進行回歸，得到回歸方程為y2=0.070 79+0.035 78x2，R22=0.999，以此進行樣液中總多酚含量測定。

1.3.4 自由基清除能力測定

1.3.4.1 DPPH·清除率測定

參考Zheng 等[16]的方法略作修改。取100 μL不同消化液與等體積的DPPH（40 mg/L，φ=95%乙醇）溶液混合，避光30 min，于波長517 nm 處測吸光度。

式中：

ADPPH——DPPH·清除率，%；

A0——蒸餾水代替消化液的吸光度；

A1——φ=95%乙醇代替DPPH 溶液的吸光度；

A2——消化液的吸光度。

1.3.4.2 ABTS+·清除率測定

參考Teng 等[17]的方法稍作修改。7.4 mmol/L ABTS 溶液與2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液以1:1（V/V）混合，室溫黑暗放置12 小時，用前稀釋，于波長734 nm 處調(diào)節(jié)吸光度至0.700±0.02，作為ABTS+·工作液。取800 μL ABTS+·工作溶液分別與200 μL 的消化液充分混合，避光反應6 min 于734 nm 處測吸光度。

式中：

AABTS——ABTS+·清除率，%；

A0——蒸餾水代替消化液的吸光度；

A1——消化液的吸光度。

1.3.5 鐵離子還原能力測定

參照石志嬌等[18]的方法并微調(diào)。分別取100 μL不同消化液、pH 值為6.6 的PBS 緩沖溶液、質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀于離心管中混合均勻，50 ℃的水浴中孵育20 min，后加入100 μL 體積分數(shù)為10%的三氯乙酸搖勻，取100 μL 上清液加入96 孔酶標板中，同時加入等體積的蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵溶液，反應10 min 后在700 nm 處測吸光度。用吸光度值表示消化液對三氯化鐵中鐵離子的還原能力。

1.3.6 脂質(zhì)過氧化抑制能力測定

結合閆紅秀等[19]和曠慧等[20]的方法并作修改調(diào)整。

1.3.6.1 蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制率測定

卵黃懸液的配制：將新鮮的雞蛋去除蛋清，加入等體積的0.1 mol/L 的PBS（pH 值為7.4）配置懸液，37 ℃磁力攪拌10 min，以1:25 稀釋為卵黃懸液備用。

TCA-TBA-HCl（TTH）混合液的配制：在蒸餾水中依序放入15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL 濃鹽酸。

于離心管中依次加入100 μL 卵黃懸液、100 μL 400 μmol/L 三氯化鐵溶液、100 μL 400 μmol/L Vc溶液和100 μL 不同消化液混勻，37 ℃水浴60 min，再加入200 μL TTH 混合液，90～100 ℃水浴15 min，冰水冷卻后離心5 min，取上清液在532 nm 處測吸光度。

式中：

APC——蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制率，%；

A0——蒸餾水代替消化液的吸光度；

A1——PBS 代替脂質(zhì)體的吸光度；

A2——消化液的吸光度。

1.3.6.2 大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制率測定

大豆卵磷脂溶液的配制：20 mg 卵磷脂溶解于10 mL PBS（0.1 mol/L、pH 值為7.4）中。

于離心管中依次加入100 μL 大豆卵磷脂溶液、100 μL 400 μmol/L 三氯化鐵溶液、100 μL 400 μmol/L Vc 溶液和100 μL 不同消化液混勻，37 ℃水浴60 min，再加入200 μL TTH 混合液，90～100 ℃水浴15 min，冰水冷卻后離心5 min，取上清液在532 nm 處測吸光度。

式中：

ALHP——大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制率，%；

A0——蒸餾水代替消化液的吸光度；

A1——PBS 代替脂質(zhì)體的吸光度；

A2——消化液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行測定3 次，以Mean±SD 表示。采用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行錄入和整理，采用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異顯著。此外，通過聯(lián)川生物云平臺進行主成分分析，對上傳的數(shù)據(jù)進行中心化和z-score 歸一化，并采用Pearson 相關性測定模擬胃腸道消化前后總黃酮、總多酚與自由基清除能力（DPPH、ABTS）、鐵離子還原能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力（蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化、大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化）之間的相關性。采用Origin 2022 繪圖。

2 結果與分析

2.1 胃腸消化過程中總黃酮、總多酚含量變化

2.1.1 總黃酮含量變化

根據(jù)圖1a，云南金花茶未消化樣液中總黃酮含量為191.53 μg/mL，口腔消化液中總黃酮含量為159.85 μg/mL。在胃腸消化過程中，總黃酮含量的變化隨消化時間延長總體呈上升趨勢，胃消化階段中總黃酮含量均較于腸消化階段高。胃消化30～60 min總黃酮含量顯著升高（P＜0.05），消化90 min 時略有降低，但下降趨勢不顯著，隨后便回升，這可能是酸性環(huán)境促進了某些與蛋白質(zhì)結合的黃酮類物質(zhì)釋放，隨著消化時間延長，釋放量大于降解量[20]。由圖1b 可知，經(jīng)胃消化120 min 后，在腸消化初期（0 min），總黃酮含量降低了191.43 μg/mL，隨著腸消化的繼續(xù)，總黃酮含量上升，消化240 min含量達最高（78.88 μg/mL），是消化0 min 的2.04 倍。原因可能是腸消化初期，消化環(huán)境中的酶系和pH環(huán)境會使胃消化階段下的黃酮類物質(zhì)降解，且加入腸消化液后，也會使原本的黃酮濃度受到稀釋，隨著腸消化的進行，總黃酮含量有少量回升，推測胰蛋白酶和膽酸鹽可能會促使黃酮類物質(zhì)的釋放，是主要的貢獻者，但pH 環(huán)境可能會影響黃酮類物質(zhì)的結構和存在形式。

圖1 總黃酮含量變化Fig.1 Changes of total flavonoid content

2.1.2 總多酚含量變化

由圖2a 可知，云南金花茶未消化樣液中總多酚含量為243.51 μg/mL，口腔消化液中云南金花茶總多酚含量為121.77 μg/mL。在模擬胃液消化過程中，總多酚含量的變化隨消化時間的延長出現(xiàn)了波動，但整體來看，與消化0 min 相比是增加的，可能是在胃蛋白酶的作用下，部分結合態(tài)多酚水解釋放出多酚，從而使可測多酚增加[21]。在胃消化90 min，總多酚含量達到最高，為327.65 μg/mL。由圖2b 可知，腸消化階段中總多酚含量變化趨勢與總黃酮一致。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，胃消化120 min 后，在腸消化初期（0 min）時，總多酚含量大幅度地降低了238.49 μg/mL，損失量為腸消化0 min的7.94倍，這可能是加入腸消化液，稀釋了原有的多酚，此外，pH 值上升，酸堿環(huán)境改變，多酚降解或聚合，導致可測多酚減少[22]。隨著腸消化的繼續(xù)，總多酚含量逐漸上升，但均比胃消化部位低，說明多酚在胃環(huán)境中更穩(wěn)定[23]，造成這種差異的原因可能是總多酚在弱堿性的腸消化環(huán)境下會發(fā)生氧化、聚合、降解等反應，導致其總體含量低[22]。

圖2 總多酚含量變化Fig.2 Changes in total polyphenol content

2.2 胃腸消化過程中自由基清除能力變化

2.2.1 DPPH·清除能力

如圖3a，云南金花茶未消化樣液的DPPH·清除率為86.62%。與口腔消化（51.89%）相比，模擬胃消化后，云南金花茶DPPH·清除能力顯著升高（P＜0.05），清除能力提高了32.69%～35.21%，均達到90%以上。根據(jù)圖3b 可知，與胃消化末期（120 min）相比，經(jīng)腸消化后，消化液的清除能力均降低，降幅在60.92%～68.55%之間。此外，胃消化階段中消化0 min 時對DPPH·清除能力最低（92.58%），在腸消化階段中消化180 min 時對DPPH·清除能力最高（32.97%），兩者相差近2.81 倍，表明相對于腸消化，胃消化過程中的DPPH·清除能力更高[24]。

圖3 DPPH·清除能力變化Fig.3 Change of DPPH· scavenging ability

2.2.2 ABTS+·清除能力

如圖4a 所示，云南金花茶未消化樣液的ABTS+·清除率為94.36%，高于口腔消化液。在胃消化過程中，云南金花茶ABTS+·清除能力的變化趨勢與DPPH·相似。根據(jù)圖4b 可知，在腸消化60 min 時，消化液對ABTS+·清除能力顯著下降（P＜0.05），隨著消化的繼續(xù)，清除能力逐漸上升，但總體上都低于胃消化階段?？赡苁悄c消化前期，由于消化環(huán)境的改變，使得胃消化過程遺留下的多酚和黃酮類成分迅速降解，結構發(fā)生變化，導致清除率下降，隨著消化的繼續(xù)，活性物質(zhì)釋放量大于降解量，因此清除能力逐漸回升。

圖4 ABTS+·清除能力變化Fig.4 Change of ABTS+· scavenging ability

綜上，經(jīng)模擬消化后，云南金花茶中的黃酮和多酚類物質(zhì)逐漸被釋放出來，表現(xiàn)出不同的活性。較口腔消化組，云南金花茶經(jīng)胃消化后，不同消化階段的DPPH·、ABTS+·清除能力顯著升高。經(jīng)腸消化后，自由基清除能力急劇下降，且均比胃消化階段低，這與總黃酮、總多酚含量變化趨勢大體一致，表明胃腸消化過程中自由基清除能力變化可能與黃酮、多酚類物質(zhì)在胃腸環(huán)境中的變化情況有關，這些物質(zhì)在弱堿性環(huán)境不穩(wěn)定，且易于蛋白質(zhì)等大分子絡合，降低其在消化液的溶解性，進而降低抗氧化活性[26]。自由基的清除效果可以反應抗氧化作用，在本研究中，胃消化環(huán)境中的抗氧化能力較高，經(jīng)腸消化后抗氧化能力下降，這與上述說法一致。

2.3 鐵離子還原能力

如圖5 所示，云南金花茶未消化樣液吸光度為0.77，大于口腔消化液。經(jīng)模擬消化后，胃消化過程對鐵離子還原能力均高于腸消化過程，胃消化階段最小吸光度為0.57（消化0 min），腸消化階段最大吸光度為0.16（消化240 min）。由圖5a可知，在胃消化中，隨著消化時間增加，云南金花茶對鐵離子還原能力上升，上升差異不顯著（P＞0.05），如圖5b 所示，經(jīng)腸消化過程，還原能力先上升再下降后上升，呈現(xiàn)這一趨勢可能與腸消化階段活性物質(zhì)濃度變化有關，也可能與pH 值的變動有關[25]。

圖5 鐵離子還原能力變化Fig.5 Change of iron reduction ability

2.4 胃腸消化過程中脂質(zhì)過氧化抑制能力變化

2.4.1 蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力

蛋黃卵磷脂是一種磷脂混合物，其中的主成分是磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）。由圖6可知，云南金花茶未消化樣液和胃腸消化液對蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化均具有一定的抑制能力。在圖6a中的胃消化階段，脂質(zhì)過氧化抑制率具有差異性，消化90 min，蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力最高，為77.17%，在90 min 之前，隨消化時間增加，抑制能力逐漸降低，可能是在這個階段，云南金花茶釋放出的對蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化具有抑制能力的活性物質(zhì)的降解量大于釋放量，在90 min 左右，則是釋放量大于降解量，因此抑制情況便表現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢。在圖6b 中的腸消化過程中，脂質(zhì)過氧化抑制率差異不顯著（P＞0.05）。與胃消化末期（120 min）相比，腸消化0 min，抑制率降低，隨著消化進行，抑制率顯著提高（P＜0.05），消化240 min 達最高（82.49%）。這可能是在胃腸消化過度階段（0 min），由于消化環(huán)境的改變，具有抑制能力的黃酮、多酚類成分迅速降解，抑制率最低，隨著腸消化進行，釋放出的具有脂質(zhì)過氧化抑制能力的這類物質(zhì)逐漸增多，降解量與釋放量趨于平衡，因此抑制率顯著提升（P＜0.05）后便趨于穩(wěn)定。

圖6 蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力變化Fig.6 Changes in the inhibitory ability of egg yolk lecithin lipid peroxidation

2.4.2 大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力

由圖7 可知，云南金花茶胃腸消化液對大豆卵磷脂（Lecithin High Potency，LHP）脂質(zhì)過氧化均具有抑制能力。在圖7a 中未消化樣液對大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制率為90.81%，高于口腔消化，在胃消化階段，消化30 min 時測定樣液的脂質(zhì)過氧化抑制率最大為46.15%，隨著消化的進行，脂質(zhì)過氧化抑制率具有一定波動性，這可能是由于在胃消化環(huán)境中，對大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化具有抑制作用的黃酮、多酚類成分存在形式不穩(wěn)定，使得脂質(zhì)過氧化抑制率呈現(xiàn)上下波動的現(xiàn)象。如圖7b 顯示，腸消化0 min，抑制率為43.30%，消化30 min，抑制率顯著降低（P＜0.05），隨著消化的繼續(xù)，抑制率逐漸上升，消化為240 min 時，抑制率達最高（45.62%）。這可能是由于在弱堿性的腸消化環(huán)境中，消化0～30 min，對大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化具有抑制作用的黃酮、多酚類成分的降解量大于釋放量，隨著消化的進行，釋放量大于降解量，這類物質(zhì)累積量逐漸增加，對大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化的抑制能力顯現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。

圖7 大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力變化Fig.7 Changes in the inhibitory ability of soybean lecithin lipid peroxidation

綜上，本研究在卵磷脂脂質(zhì)體存在下，通過二價鐵離子促進其脂質(zhì)過氧化，探究了云南金花茶消化液對脂質(zhì)過氧化的抑制作用。在胃消化過程中，隨著消化的進行，脂質(zhì)過氧化抑制能力均表現(xiàn)出上下波動的情況，可能是模擬胃消化過程釋放出對脂質(zhì)過氧化起作用的黃酮、多酚類成分存在形式不穩(wěn)定，模擬腸消化過程，脂質(zhì)過氧化抑制率趨于平穩(wěn)或逐漸上升，可能是隨著腸消化的進行，對脂質(zhì)過氧化起作用的這類物質(zhì)的釋放量大于或等于降解量?？傊?，云南金花茶胃腸消化過程中釋放出的黃酮、多酚類成分均有抑制脂質(zhì)過氧化能力，但抑制率的高低與總黃酮、總多酚含量并不趨于一致，后續(xù)應該進一步研究單體酚對脂質(zhì)過氧化的作用。

2.5 相關性及主成分分析

將體外模擬胃腸消化過程中測定的總黃酮含量（TFC）、總多酚含量（TPC）、DPPH·清除能力（DPPH·）、ABTS+·清除能力（ABTS+·）、鐵離子還原能力（Fe3+）、蛋黃卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力（PC）和大豆卵磷脂脂質(zhì)過氧化抑制能力（LHP）等7項指標之間進行了相關性及主成分分析（PCA），由圖8a 相關性分析得，總黃酮含量、總多酚含量與自由基清除率和鐵離子還原能力之間呈顯著正相關，且相關系數(shù)均在0.9 以上，表明相關性極強；總黃酮含量、總多酚含量與脂質(zhì)過氧化各指標之間的相關系數(shù)較低，但也具有一定的相關性。主成分分析中各指標之間的距離也可反應其聯(lián)系的緊密程度[27]，根據(jù)圖8b 可得，總黃酮、總多酚含量、DPPH·、ABTS+·清除能力和鐵離子還原能力之間的距離較近，說明它們之間的聯(lián)系較為緊密，相關性高，這也能反應相關性熱圖的分析結果。

圖8 相關性和主成分分析Fig.8 Correlation and principal component analysis

3 結論

本研究通過模擬消化技術對云南金花茶進行體外模擬胃腸消化，通過動態(tài)研究了云南金花茶在口腔、胃、腸消化環(huán)境中總黃酮、總多酚含量及抗氧化變化規(guī)律。在模擬消化過程中，云南金花茶消化液中總黃酮、總多酚含量及自由基清除率、鐵離子還原能力和脂質(zhì)過氧化抑制能力存在顯著性差異。經(jīng)模擬胃消化后，總黃酮、總多酚含量較高，腸消化0 min，含量下降，DPPH·、ABTS+·清除率和鐵離子還原能力的變化趨勢與總黃酮、總多酚含量變化趨勢相似。經(jīng)相關性分析，DPPH·、ABTS+·清除率和鐵離子還原能力與總黃酮、總多酚含量之間呈顯著正相關，且相關性較高。在脂質(zhì)過氧化抑制能力測定中，各消化液均對脂質(zhì)過氧化具有抑制效果，抑制能力變化趨勢與總黃酮、總多酚含量不一致，經(jīng)相關性分析，脂質(zhì)過氧化各指標與總黃酮含量、總多酚含量之間的相關性較低。根據(jù)研究結果可推測，胃消化過程對云南金花茶清除自由基、還原鐵離子和抑制脂質(zhì)過氧化活性物質(zhì)的釋放均有促進作用，而腸消化過程主要促進了抑制脂質(zhì)過氧化活性物質(zhì)的釋放，可見體外模擬消化過程因消化環(huán)境的改變會影響黃酮、多酚類物質(zhì)的存在形式并使其表現(xiàn)出不同的活性。為探究云南金花茶在消化過程中起抗氧化作用的主要活性物質(zhì)及其構效關系，后續(xù)還需進一步通過細胞及動物模型研究其消化轉(zhuǎn)運機制和作用機理。