鄭連濤,張曉霞,劉佩鈺,王志進(jìn),孫睿,牛曉琳,黃帥,王曉玥

(德州學(xué)院 醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院,山東 德州 253023)

1 納米金層析試紙條的發(fā)展歷程及其現(xiàn)狀

為保障人民合法權(quán)益和生命健康,食品安全、臨床診斷等各領(lǐng)域的檢測(cè)必不可少[1-2],務(wù)必發(fā)展檢測(cè)手段以起到預(yù)防和監(jiān)管控制效果。20世紀(jì)80年代初,在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上,納米金層析試紙條檢測(cè)方法被建立。Faulk等[3]最先應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)了大腸埃希菌Escherichia coli,1980年Unipath公司開(kāi)始市售檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素(HCG)的試紙條,該試紙條通過(guò)將納米金顆粒作為信號(hào)探針,用來(lái)檢測(cè)女性是否妊娠[4]。納米金試紙條技術(shù)的名稱來(lái)源于其使用粒徑在1～100 nm之間的金顆粒,與相應(yīng)的特異性探針相結(jié)合后,被檢測(cè)物與樣品墊上的納米金顆粒偶聯(lián),利用層析作用到達(dá)檢測(cè)線,通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)目的物質(zhì)是否存在[5]。根據(jù)檢測(cè)物的不同,納米金試紙條涵蓋了核酸水平的分子生物學(xué)檢測(cè)、蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測(cè)、化合物水平的理化檢測(cè)等多種層次。該技術(shù)具有特異性強(qiáng),靈敏度高,穩(wěn)定性好,檢測(cè)速度快,成本低,可視化,操作簡(jiǎn)單,污染少等一系列優(yōu)點(diǎn),因此在環(huán)境污染檢測(cè),食品安全檢測(cè),臨床診斷檢測(cè),微生物檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

2 納米金層析試紙條應(yīng)用于微生物快速檢測(cè)

2.1 納米金層析試紙條與病毒檢測(cè)

病毒無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu),依靠寄生在生物體內(nèi)生存,進(jìn)而侵染宿主的生命系統(tǒng),且?guī)в幸欢ǖ膫魅拘?。為?shí)現(xiàn)對(duì)病毒病的預(yù)防和監(jiān)管,需要對(duì)病毒進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。病毒檢測(cè)現(xiàn)階段主要依賴于PCR擴(kuò)增技術(shù)[6],需要使用凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果,存在著檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、檢測(cè)結(jié)果無(wú)法直觀可視等問(wèn)題[7-8]。王之瑩等[9]將納米金試紙條用于PCR結(jié)果的檢測(cè),建立了側(cè)流核酸測(cè)定試紙條(lateral flownucleic acid assay,LFNAA)檢測(cè)非洲豬瘟病毒(ASFV)的可視化檢測(cè)方法。受PCR 技術(shù)的限制,仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),因此有多項(xiàng)研究在檢測(cè)技術(shù)上進(jìn)行突破。如趙錦等[10]將等溫鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(Strand Displacement Amplification,SDA)與納米金測(cè)流層析試紙條相結(jié)合,進(jìn)而應(yīng)用于登革熱病毒(DENV)的檢測(cè)。該方法使用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)代替PCR擴(kuò)增,可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

在病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,由于環(huán)境及生物體本身等影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)不可避免地出現(xiàn)誤差。因此在實(shí)驗(yàn)中,需要增加多種檢測(cè)條件,使誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響降到最低。宋廣萍[11]以雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization Chain Reaction,HCR)為基礎(chǔ),以分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)探針(MBs)和雙聯(lián)特異性核酸酶為輔助,避免了多種干擾,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了三種流感病毒H1N1的可視化檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在新冠病毒檢測(cè)等多種病毒檢測(cè)中應(yīng)用廣泛,是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),陳崢嶸[12]利用等位基因特異性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)核酸試紙條區(qū)分犬瘟熱病毒(CDV)野毒株和疫苗株,通過(guò)雙抗夾心法進(jìn)行臨床驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)該方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比較,更為簡(jiǎn)單快速。新冠肺炎確診過(guò)程中,咽拭子的分子檢測(cè)是用于確認(rèn)新冠病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn),但該技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果假陰性率較高。Wen等[13]提出將新冠病毒核衣殼蛋白固定到一種固相LFIA條帶(LFIAs)表面,并將抗人lgG與膠體金顆粒偶聯(lián)。通過(guò)比較兩種結(jié)果,該測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確且更快速。對(duì)分子測(cè)定的不完善診斷策略進(jìn)行補(bǔ)充,可應(yīng)用于新冠肺炎患者的大量分子篩查中。

2.2 納米金層析試紙條與細(xì)菌檢測(cè)

現(xiàn)階段,致病菌的檢測(cè)主要依賴于細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、涂片檢測(cè)等,在進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí),往往需要PCR技術(shù)結(jié)合后續(xù)檢測(cè)手段,存在著檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),操作復(fù)雜以及對(duì)操作人員和儀器要求高等問(wèn)題,納米金核酸試紙條改善了以上缺點(diǎn)。如陳詩(shī)勝[14]制備了PCR核酸免疫層析試紙條檢測(cè)奶牛乳房炎四種致病菌,通過(guò)肉眼直接觀察核酸擴(kuò)增后的條帶結(jié)果,解決了PCR擴(kuò)增后檢測(cè)產(chǎn)物的復(fù)雜化問(wèn)題,檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的靈敏度,且特異性高,可適用范圍更廣。在前期核酸擴(kuò)增方面,張力支等[15]利用核酸外切酶Ⅲ循環(huán)酶切策略實(shí)現(xiàn)了單鏈信號(hào)放大,同時(shí)結(jié)合納米金試紙條完成檢測(cè),李盛杰等[16]利用多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)(Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification,MIRA)結(jié)合納米金試紙條對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行快速鑒定。以上方法相較于細(xì)菌培養(yǎng)、PCR、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增等方法,操作流程更為簡(jiǎn)便,對(duì)環(huán)境要求更低。納米金還可與其他物質(zhì)相結(jié)合,以便于核酸試紙條的檢驗(yàn)。如賈慧建等[17]經(jīng)實(shí)驗(yàn)建立了一種新型核酸試紙條,此試紙條將鏈霉親和素與納米金結(jié)合,用來(lái)檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因,對(duì)于患者的檢測(cè)更為快速、準(zhǔn)確。與核酸檢測(cè)相比較,免疫試紙條檢測(cè)靈敏度較低。為提高靈敏度,Jia等[18]利用納米顆粒的光熱效應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大技術(shù),建立了一種用于大腸桿菌檢測(cè)的光熱免疫過(guò)濾試紙條,將靈敏度提高了十倍。并且該方法可通過(guò)替換抗體,擴(kuò)展到其他病原體的檢測(cè),具有普適性。

3 納米金層析試紙條應(yīng)用于疾病快速檢測(cè)

近年來(lái),隨著全球飲食結(jié)構(gòu)的變化和重金屬污染事件的發(fā)生日益增多,世界各地都受到了嚴(yán)重影響,同時(shí)威脅著人類的生活和健康。因此開(kāi)展疾病的預(yù)防檢測(cè)工作顯得至關(guān)重要。為進(jìn)一步提高疾病檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和工作效率,節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,葉鈺瀅[19]通過(guò)結(jié)合重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Aided Amplification,RAA)擴(kuò)增技術(shù)和核酸試紙條,在30 min內(nèi)檢測(cè)出日本血吸蟲(chóng)基因片段。王海波[20]在納米金試紙條生物傳感器的基礎(chǔ)上,提出可視化檢測(cè)Pd2+、肝癌單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)和慢性乙肝病毒(HBN-DNA)的方法,并且分別利用孔板放大和HCR放大策略等提高了檢測(cè)靈敏度。阿爾茲海默癥(Alzheimer disease,AD)是威脅老年群體的重要疾病之一,Liu等[21]發(fā)現(xiàn)AD病人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)水平顯著降低,因此提供了一種羅丹明B修飾的納米金顆粒雙讀數(shù)(比色法和熒光法)的方法,檢測(cè)了AD小鼠腦脊液中AChE的含量,結(jié)果表明該方法較現(xiàn)有方法選擇性更好,且對(duì)于微量物質(zhì)的檢測(cè)更為靈敏。

4 納米金試紙條在食品安全檢測(cè)方面的應(yīng)用

食品安全要求無(wú)毒,無(wú)公害且符合應(yīng)當(dāng)有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量,不會(huì)對(duì)食用者產(chǎn)生致病的危害,但某些食品添加物會(huì)損害人體健康。比如,為防止食品腐敗變質(zhì),加工時(shí)會(huì)人為地在動(dòng)物性食品中添加抗生素。常芮[22]在側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(LFS)應(yīng)用于檢測(cè)食品中抗生素的基礎(chǔ)上,將鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶DNA鏈修飾到納米金顆粒上,構(gòu)建了新型納米模擬酶的信號(hào)放大LFS,進(jìn)一步提高了納米金試紙條在檢測(cè)抗生素含量的靈敏度。食品中微生物的生長(zhǎng)也會(huì)影響食品質(zhì)量,預(yù)富集、選擇性富集、毒素檢測(cè)等微生物傳統(tǒng)方法存在檢測(cè)速度慢,鑒定結(jié)果不清晰等缺點(diǎn)[23-25]。張?jiān)萍t等[26]以食品中金黃色葡萄球菌為靶標(biāo),構(gòu)建了一種巰基、生物素修飾的雙核酸適配體夾心模式的層析試紙條,完成了金黃色葡萄球菌的定性檢測(cè)。最后,農(nóng)藥殘留也是影響食品安全主要因素之一,Liu等[27]預(yù)先制備了抗啶蟲(chóng)脒的單克隆抗體,利用樣品中的啶蟲(chóng)脒與檢測(cè)線上偶聯(lián)的啶蟲(chóng)脒競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)液中單克隆抗體的方法區(qū)分陽(yáng)性與陰性結(jié)果,建立了啶蟲(chóng)脒殘留檢測(cè)技術(shù),并成功用于市售黃瓜和蘋(píng)果農(nóng)藥殘留的檢測(cè),理論檢測(cè)限約為1 ng/mL。

5 納米金試紙條在檢測(cè)真菌毒素方面的應(yīng)用

真菌毒素在谷物、水中等廣泛存在,易造成糧食以及水污染,從而對(duì)人類身體健康造成極大危害。在檢測(cè)領(lǐng)域,傳統(tǒng)的化學(xué)鑒定方法(如薄層色譜TLC)檢測(cè)復(fù)雜、準(zhǔn)確性低,無(wú)法滿足市場(chǎng)對(duì)于即時(shí)檢測(cè)的要求,納米金試紙條作為一種快速檢測(cè)技術(shù),在真菌毒素檢測(cè)方面逐漸應(yīng)用于市場(chǎng)。鄒鵬[28]制備了球狀和花狀納米金層析試紙條,并在多種雜質(zhì)存在的粗制樣品中可以快速地檢測(cè)出谷物及中藥材中三種毒素(玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赭曲霉毒素A),相較于食品檢測(cè)中馬彤彤[29]將球狀改良成花狀納米金顆粒,球狀和花狀納米金都可定性檢測(cè)玉米赤霉烯酮,避免了假陽(yáng)性的出現(xiàn),從而完成市場(chǎng)初步篩查。黃馨雨[30]研究的同類型納米金免疫層析試紙條也可在雜物中定性的檢測(cè)出伏馬毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。相比于鄒鵬檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,該方法靈敏度更高。張珊[31]采用納米金粒子與核酸適配體偶聯(lián)的方法制備出核酸適配體試紙條,來(lái)檢測(cè)黃曲霉素B1,相較于商品化檢測(cè)試劑盒,該方法成本更低、檢測(cè)范圍更廣,為檢測(cè)其他產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ),可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化實(shí)時(shí)檢測(cè)。Wu等[32]開(kāi)發(fā)了紅曲發(fā)酵食品中桔青霉素的快速金納米顆粒免疫層析條方法,實(shí)驗(yàn)表明這種方法靈敏度高、檢測(cè)快速,在檢測(cè)食品中的桔青霉素(CTN)具有很大幫助。

6 總結(jié)與展望

相比于傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方式,納米金層析試紙條技術(shù)是一種高靈敏度、高特異性、準(zhǔn)確、有效、快速可視化的檢測(cè)技術(shù),但其應(yīng)用與推廣仍然不廣泛。第一,傳統(tǒng)的納米金試紙條檢測(cè)需要抗體和抗原特異性結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生抗體-抗原-納米金顆粒復(fù)合物,而研制免疫層析試紙條的重要一步是制備特異性高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體,需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的雜交瘤實(shí)驗(yàn)和篩選過(guò)程,開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)且耗費(fèi)大量的人力與物力,實(shí)驗(yàn)成功率低,再者抗體偶聯(lián)金標(biāo)的過(guò)程較為復(fù)雜,以上都成為免疫試紙條研發(fā)的瓶頸。為了解決以上問(wèn)題,首先可以嘗試基于適配體的核酸檢測(cè)方法,其次納米金核酸檢測(cè)試紙條可以根據(jù)檢測(cè)對(duì)象靈活設(shè)計(jì)核酸探針,可在生物公司訂購(gòu),避開(kāi)了制備抗體的限制,為試紙條檢測(cè)的廣泛應(yīng)用提供了條件。

第二,目前大多數(shù)納米金層析試紙條檢測(cè)是基于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行的研究,若要將此技術(shù)更廣泛、更便攜地應(yīng)用于物質(zhì)檢測(cè),仍需將其應(yīng)用于臨床環(huán)境中。第三,現(xiàn)今所研究的試紙條是對(duì)于單一檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè),如符娜[33]農(nóng)田生產(chǎn)中,仍然無(wú)法同時(shí)檢測(cè)侵染植物的多種病毒,陳淑丹等[34]提出對(duì)同一檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)時(shí),只能逐一浸染各種測(cè)試項(xiàng)目的試紙條的現(xiàn)象。由此在試紙條探索過(guò)程中,對(duì)于可同時(shí)檢測(cè)更多種類的檢測(cè)對(duì)象的多功能甚至萬(wàn)能試紙條需要我們進(jìn)一步研究。第四,在定量檢測(cè)方面,目前大多數(shù)試紙條只能利用顯色方式來(lái)檢測(cè)是否含有檢測(cè)對(duì)象,如鄭方媛等[35]建立了核酸試紙條檢測(cè)與交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的快速檢測(cè)狐貍源性成分的方法時(shí),只能鑒定狐貍源性成分是否存在,而對(duì)于在狐貍源性成分的定量檢測(cè)方面還需進(jìn)一步研究,故對(duì)于定量檢測(cè)目的對(duì)象上的探索仍然有很長(zhǎng)的路要走。