成坤，王峰，劉源*，王子亮，李雪梅

1.商丘市第一人民醫(yī)院 藥學部，河南 商丘 476100

2.商丘市第一人民醫(yī)院 呼吸科，河南 商丘 476100

支氣管炎是呼吸道的常見疾病之一，由病毒和細菌反復感染、冷空氣、煙霧、粉塵、空氣污染、過敏等多種因素導致的以咳嗽、痰多、氣促等癥狀及反復發(fā)作的慢性過程為特征的氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的炎癥。支氣管炎歸屬于中醫(yī)“咳嗽”“哮喘”“痰飲”等范疇，中醫(yī)認為肺主氣，司呼吸，主宣發(fā)、肅降，通調水道，外合皮毛，開竅于鼻。肺氣虛弱，外邪侵入致肺氣不得正常宣降而咳嗽、氣喘；脾虛運化失調，水濕痰飲停聚，痰飲上逆阻塞氣道而喘促痰多；腎虛則氣不歸根，動則氣促，命火不足水失其制，上泛為痰。中醫(yī)治療遵循“急則治其標、緩則治其本”的治療原則，急性發(fā)作期以治標為主，緩解期則以調補肺、脾、腎3 臟而固本為主。半貝丸來源于《重訂通俗傷寒論》，系止咳化痰、開郁散結劑，以咳嗽多痰為辨證要點。該方由半夏（制）和川貝母組方而成，味微苦，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第十三冊，方中半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，性辛味溫，歸脾、胃、肺經，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的臨床功效；川貝母性苦味甘，歸肺、心經，清熱潤肺、化痰止咳、散結消癰。諸藥合用，共奏止咳化痰、開郁散結之功，現(xiàn)代常用于治療支氣管炎、癲癇、淋巴結炎等病癥。

中成藥復方制劑具有多成分、多靶點、多通路整體作用的特點。網絡藥理學依托于系統(tǒng)生物學和網絡理論[1-2]，在“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡的基礎上，通過整合大量網絡數(shù)據(jù)庫資源，進行網絡分析，從整體觀系統(tǒng)地綜合分析藥物對疾病的干預和影響，與中醫(yī)基礎理論之整體觀念相吻合。分子對接技術研究藥物分子與蛋白靶點間的相互作用，預測其結合模式及親合力，通過結合自由能驗證篩選出的主要成分與關鍵靶點能否有效結合。本研究將上述2 種技術結合探討半貝丸治療支氣管炎作用機制，并為半貝丸后續(xù)研究提供思路。

1 方法

1.1 半貝丸成分及靶點獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取半貝丸中半夏和川貝母所含化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18 篩選半貝丸的有效成分。并通過中國知網、萬方、維普、PubMed 等數(shù)據(jù)庫分別以“半夏”“Pinelliae Rhizoma”“川貝母”“Fritillariae CirrhosaeBulbus”為關鍵詞，查找文獻中有明確與治療“支氣管炎”“bronchitis”相關藥理活性成分，建立活性成分數(shù)據(jù)庫；同時運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對其靶點蛋白進行預測。采用UniProt 蛋白質序列數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名轉換為靶點基因名。

1.2 半貝丸“成分-靶點”網絡模型構建

利用Cytoscape 軟件，按照半貝丸中活性成分預測的靶點，建立活性成分與靶點間的相互對應關系，構建“成分-靶點”網絡模型。

1.3 支氣管炎靶點獲取

在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中輸入主題詞“bronchitis”進行檢索，同時對相關疾病靶點進行合并和去重，即得支氣管炎疾病相關靶點，并把相關基因編碼的蛋白質作為藥物治療的潛在作用靶點。

1.4 疾病-活性成分共同靶點的獲取

將半貝丸成分靶點和支氣管炎疾病靶點錄入Bioinformatics &Evolutionary Genomics 在線軟件作圖工具平臺，繪制韋恩圖，獲得疾病-活性成分共同靶點。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網絡的構建

在STRING 數(shù)據(jù)庫在線平臺（https://stringdb.org/）中，構建PPI 網絡模型，獲得PPI 網絡圖。

1.6 基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

在Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/）中錄入交集靶點，進行生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）的GO 富集和KEGG 信號通路分析，并采用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在線工具進行GO 富集分析弦圖和KEGG富集分析氣泡圖，使其結果可視化。

1.7 分子對接驗證

以PPI 網絡模型中degree 值排名靠前的核心靶點為候選蛋白，在PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中獲得靶點蛋白PDB ID，以1.2 項下篩選出的半貝丸治療支氣管炎主要活性成分以及常用止咳化痰藥鹽酸氨溴索和氫溴酸右美沙芬為候選化合物，在PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得活性成分3D 結構保存為mol2 格式，運用PyMOL 軟件對蛋白質進行去水、加氫等操作，通過SwissDock 在線數(shù)據(jù)庫進行分子對接。

2 結果

2.1 半貝丸活性成分篩選結果

共篩選出半夏潛在活性成分13 個，川貝母潛在活性成分13 個，其中半夏、川貝母共有活性成分1個；除上述成分外文獻報道半夏中麻黃堿、偽麻黃堿[3-4]，川貝母中西貝母堿、貝母甲素對支氣管炎均有明確的藥理活性[5-6]，共獲得29 個活性成分，見表1。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫對上述成分進行靶點預測，29 個活性成分共獲得靶點蛋白285 個，經標準化匯總去重，最終獲得靶點基因95 個。

表1 半貝丸活性成分Table 1 Active ingredients of Banbei Pills

2.2 半貝丸活性成分及相應靶點的網絡圖

利用Cytoscape 3.7.1 軟件將半貝丸的2 味中藥、29 個活性成分和95 個相關靶點建立可視網絡拓撲圖，見圖1。網絡共包括126 個節(jié)點，295 條邊。結果表明，β-谷固醇、黃芩素、麻黃堿、偽麻黃堿、豆甾醇、卡維丁、松柏苷等主要成分連接的靶點較多，直接或間接作用于前列腺素內過氧化物合酶 2（PTGS2）、PTGS1、腎上腺素能受體β2（ADRB2）、鈉電壓門控通道α 亞基5（SCN5A）、核受體共激活因子2（NCOA2）、雄激素受體（AR）、毒蕈堿型膽堿受體M3（CHRM3）、CHRM1 等主要靶點。

圖1 半貝丸“成分-靶點”網絡圖Fig.1 “Ingredients-target” diagram of Banbei Pills

2.3 支氣管炎疾病靶點

以“bronchitis”為關鍵詞，在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索并篩選得到支氣管炎相關的疾病靶點1 964 個。

2.4 疾病-活性成分共同靶點

將95 個活性成分靶點基因與1 964 個支氣管炎靶點取交集，構建韋恩圖，獲得半貝丸治療支氣管炎的潛在作用靶點49 個，見圖2。

圖2 疾病-活性成分共同靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of common targets of diseases and active ingredients

2.5 PPI 網絡構建

根據(jù)半貝丸治療支氣管炎的49 個潛在作用靶點，導入STRING 數(shù)據(jù)庫在線平臺中，獲得PPI 網絡，見圖3。網絡圖中共有49 個節(jié)點，321 條邊，平均節(jié)點數(shù)13.1，平均局部聚類系數(shù)0.661。以degree 值較高的靶點為核心基因，前9 位分別為蛋白激酶（Akt1）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、腫瘤抑制因子P53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、原癌基因c-Jun 產物（JUN）、基質金屬蛋白酶-9（MMP9）、PTGS2、雌激素受體（ESR1）、細胞色素C（CYCS）。

圖3 PPI 網絡圖Fig.3 PPI network diagram

2.6 GO 富集結果

把篩選得到的交集靶點輸入到Metascape 數(shù)據(jù)庫中，選定物種為人，點擊個性化分析（custom analysis）進行GO 富集分析和KEGG 信號通路分析。GO 分析共得獲得4 751 個富集結果（P＜0.01），其中BP3 890 項，主要涉及細胞對有機環(huán)狀化合物的反應、對無機物的反應、對有毒物質反應、細胞對藥物反應、凋亡信號通路、細胞對氮化合物反應、生殖結構發(fā)育、類固醇激素反應、離子傳輸調節(jié)、對氧氣水平的反應等；CC 378 項，主要涉轉錄調節(jié)復合物、膜筏、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、突觸后膜組成部分、細胞器外膜、枝晶膜、富含ficolin-1 顆粒內腔、分泌顆粒腔、細胞質核周區(qū)域、粘附連接；MF 483 項，主要涉及蛋白質結構域特異性結合、蛋白質同源二聚化活性、熱休克蛋白結合、核受體活動、一氧化氮合酶調節(jié)活性、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、組蛋白激酶活性、肽結合、支架蛋白結合、神經遞質受體活性等。在BP、MF 和CC 中，以P值大小排序，分別選取排名前10 條目，采用微生信在線工具進行GO 富集分析弦圖，使其結果可視化，見圖4。

圖4 GO 功能分析Fig.4 GO function analysis

2.7 KEGG 通路富集分析結果

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 信號通路富集分析，得到380 條通道（P＜0.01），按富集基因數(shù)目排序后取前20 條信號通路，采用微生信在線工具進行KEGG 富集分析氣泡圖，使其結果可視化，見圖5。前20 條KEGG 通路及其信息見表2。

圖5 KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

表2 前20 條KEGG 通路關鍵靶點Table 2 Key targets of the top 20 KEGG pathways

2.8 分子對接驗證

為驗證活性成分與關鍵靶點的結合能力，將PPI 網絡中degree 值較高的前4 個關鍵靶點Akt1、VEGFA、TP53、CASP3，與靶點連接最多的活性成分β-谷固醇、黃芩素、麻黃堿、偽麻黃堿和豆甾醇以及臨床上治療支氣管炎常用的止咳化痰藥鹽酸氨溴索、氫溴酸右美沙芬進行分子對接驗證，通過SwissDock 在線數(shù)據(jù)庫獲得分子對接結果，見表3。從分子對接結合能判斷成分與相關潛在靶點的結合程度，結合能＜0 kcal/mol（1 cal＝4.2 J）表明分子與配體能夠有效結合；結合能≤-7.0 kcal/mol 表明分子與靶點結合較緊密。從表3 結果可以看出β-谷固醇與Akt1、VEGFA、TP53、CASP3，黃芩素與Akt1、VEGFA、CASP3，豆甾醇與Akt1、VEGFA、TP53、CASP3 等結合較緊密，見圖6。

圖6 分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram

表3 分子對接結果Table 3 Scores of molecular docking

3 討論

本研究通過分析半貝丸“成分-靶點”網絡，挖掘出半貝丸中關鍵化合物為β-谷固醇、黃芩素、麻黃堿、偽麻黃堿、豆甾醇、卡維丁、松柏苷等。β-谷甾醇對脂多糖誘導的急性肺損傷有較好的保護作用，可通過阻止腫瘤壞死因子、白細胞介素-6 的釋放和下調核轉錄因子-κB 信號轉導通路的活化等途徑來發(fā)揮平喘的作用[7-8]；黃芩素具有抗病毒、抗菌、抗炎等作用，能夠明顯抑制銅綠假單胞菌的叢集運動和顫搐運動，破壞銅綠假單胞菌已形成的生物被膜，有效降低慢性支氣管炎、彌漫性泛細支氣管炎等肺疾病患者的感染幾率。對呼吸道合胞病毒具有直接滅活作用，通過調節(jié)谷氨酰胺代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，有效抑制嬰幼兒毛細支氣管炎、支氣管肺炎的發(fā)生[9-10]。黃芩素通過下調α-平滑肌肌動蛋白，抑制轉化生長因子-β體外誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化過程[11]。麻黃堿和偽麻黃堿可以直接作用于α 和β 受體，能夠直接或間接地發(fā)揮擬腎上腺素作用，松弛支氣管平滑肌，抑制支氣管平滑肌細胞增殖，舒張支氣管，達到治療咳嗽和支氣管炎的作用[3,12-13]。豆甾醇抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降低膽固醇療效顯著[14]，可刺激網狀內皮系統(tǒng)增生，加強巨噬細胞的能力，明顯減少由脂多糖刺激增多的致炎因子環(huán)氧化酶-2 和誘生型一氧化氮合酶mRNA 的表達，同時通過減少前列腺素E2 和一氧化氮的釋放發(fā)揮抗炎作用[15-16]。豆甾醇可顯著抑制A7r5 細胞中血管緊張素Ⅱ誘導的活性氧的增加，增加血管緊張素Ⅱ處理的A7r5細胞中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，在A7r5 細胞中的抗氧化作用[16]?？ňS丁具有較強的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除作用，其抗氧化活性顯現(xiàn)濃度相關性，具有一定的抗炎活性[17]，現(xiàn)有文獻報道對卡文定堿和松柏苷研究相對較少，但本研究顯示這2 種成分能與較多靶點像連接，表明卡文定堿和松柏苷具有潛在治療支氣管炎活性，需要進一步深入研究。在半貝丸治療支氣管炎的過程中，以上化合物發(fā)揮了重要作用。

PPI 網絡結果顯示，半貝丸治療支氣管炎的關鍵靶點主要有Akt1、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、MMP9、PTGS2、ESR1、CYCS 等。Akt1 參入代謝、增殖、細胞存活、生長等多種生物學過程，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路中的關鍵節(jié)點[18]，對調節(jié)炎癥反應具有重要作用[19]，直接影響肺部及氣道炎癥[20]。VEGFA 是一種高度保守的二聚體糖蛋白，通過影響毛細血管后靜脈和小靜脈增加血管通透性，主要由肺血管內皮細胞和上皮細胞合成分泌，可促進血管內皮增生，具有抗內皮細胞凋亡作用，是血管生成的重要調節(jié)因子，受炎癥因子、缺氧誘導因子-1α 等調節(jié)，通過增加超氧化物歧化酶的表達產生抗氧化保護作用，對肺臟的生長發(fā)育、維持生理功能、修復損傷具有重要意義，與慢性炎癥性氣道疾病相關[21]。TP53 可調控細胞凋亡、細胞周期阻滯，其協(xié)同p300 基因抑制核因子κB、Toll 樣受體4 和泛素連接酶TRAF6 的活化，負調控腫瘤壞死因子α 等炎癥因子的分泌[22]。CASP3 是細胞凋亡的關鍵效應因子，對機體受損傷的細胞予以清除從而維持自身穩(wěn)定[23-26]，CASP3 的表達與肺水腫以及肺組織中細胞凋亡呈正相關，與肺功能呈負相關，藥物對肺組織中CASP3 干預后，CASP3 表達減少，可有效減輕細胞凋亡，進而改善肺功能[27]。原癌基因C-jun 產物Jun 與原癌基因c-fos 產物Fos 結合形成異二聚體AP-1 或多聚體型反式因子，組成AP-1 轉錄因子，在轉錄水平調節(jié)下游靶基因的表達，直接調控炎性蛋白的合成，調控平滑肌細胞的活化和增殖[28-29]。MMP9 是高度保守的鈣鋅離子依耐性內切酶超家族之一，能調節(jié)其他蛋白酶及細胞因子活性，通過釋放血管內皮生長因子參與血管生成，分解呼吸道和肺內結構復合物，參與呼吸道和肺的重建[30]。MMP9 水平與氣道炎癥炎性細胞的數(shù)量呈正相關，MMP9 增加可導致氣道損傷，促進血管生成、成纖維細胞增生和氣道重塑[31]。綜上所述，半貝丸可能通過調節(jié)上述關鍵靶點的表達，從而發(fā)揮治療支氣管炎的作用。

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，半貝丸治療支氣管炎的核心靶點涉及癌癥信號通路、小細胞肺癌等通路。其中PI3K/Akt信號通路在炎癥、腫瘤、代謝等相關疾病的發(fā)病機制研究中具有重要意義[32]；激活PI3K/Akt 信號通路可促進呼吸道上皮細胞炎癥反應[33]；細胞凋亡是細胞基因控制的細胞自主有序死亡[18]，氣道上皮細胞過度凋亡，其完整性被破壞，導致氣道局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞[33]；晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路可激活核因子-κB 信號通路，引起多種黏附因子、趨化因子、生長因子、炎癥因子的釋放，產生更多炎癥介質，造成氣道高反應和組織損傷等[34-35]。

本研究采用網絡藥理學探討了半貝丸治療支氣管炎的作用機制，分析出半貝丸的主要成分可能是β-谷固醇、黃芩素、麻黃堿、偽麻黃堿、豆甾醇、卡維丁、松柏苷等，作用靶點可能是Akt1、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、MMP9，其作用通路可能是PI3K/Akt 信號通路、細胞凋亡、AGE-RAGE 信號通路。后續(xù)研究可以在此基礎上對篩選出的關鍵靶點和通路加以驗證，為半貝丸的臨床治療提供指導。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突