王丹陽 ，孫源，范蓓，孫晶，劉新民，王鳳忠*，盧聰*

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193

3.寧波大學(xué) 新藥技術(shù)研究院，浙江 寧波 315211

檳榔Areca catechuL.為棕櫚科檳榔屬常綠喬木，是我國南部熱帶亞熱帶地區(qū)的經(jīng)濟作物之一，位列我國“四大南藥”之首，具有較大的藥食兩用價值。檳榔在《中國藥典》1953 年版中就有收載記錄，且在《中國藥典》2015 年版一部收載的檳榔相關(guān)飲片及成方制劑多達60 余種[1]。藥用檳榔具有驅(qū)蟲[2]、消腫鎮(zhèn)痛[3]、消食化積[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗氧化[7-8]、抗疲勞[9-10]、抗衰老[4]、抗抑郁[11]、抗缺氧[12]、抗血栓[13]、抗腫瘤[14]、降血糖[15-16]、保護血管[17]、改善腸胃功能[18-19]等多種功效。

焦慮癥表現(xiàn)為持續(xù)性的緊張、不安、驚恐，并伴有自主神經(jīng)功能紊亂及運動性不安等癥狀[20-21]。焦慮癥的終身患病率最高，影響全球近30%人群的壽命，隨著生活節(jié)奏的加快，學(xué)習(xí)工作壓力的增大，焦慮癥已成為當(dāng)今社會危害人類身體健康的主要疾病，對焦慮癥的治療成為國際研究的熱點[22]。目前，市售主要化學(xué)藥物包括苯二氮?類藥物和5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑，為臨床常用治療藥物，其療效顯著，但也存在諸多不良反應(yīng)[23-25]。

在人們對健康的認(rèn)知水平提高、對健康的追求也日漸增加的背景下，藥食同源食品契合了當(dāng)代人們的需求，同時藥食同源產(chǎn)業(yè)是國家發(fā)展“健康中國”戰(zhàn)略中至關(guān)重要的一環(huán)，展示出了巨大的市場前景和發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢壳皺壚飘a(chǎn)業(yè)應(yīng)用不足，國家市場監(jiān)管總局2020 年最新修訂的《食品生產(chǎn)許可分類目錄》里未將“食用檳榔”收錄在內(nèi)，意味著檳榔不再作為食品來管理，也不能頒發(fā)食品生產(chǎn)許可[26-27]，檳榔國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)尚無，相關(guān)的《食用檳榔》（DB46/T75-2007）等食品質(zhì)量海南地方標(biāo)準(zhǔn)無法修訂和升級，且檳榔仍未列入國家藥食同源目錄，導(dǎo)致其作為食品的生產(chǎn)許可和監(jiān)管已缺乏依據(jù)。尤其2021 年國家廣播電視總局辦公廳發(fā)出明確指出停止利用任何媒體宣傳推銷檳榔及其制品的通知[28-29]，使我國檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展遭遇“滑鐵盧”，面臨生存危機。因此，面對當(dāng)前形勢，深入挖掘檳榔功能因子，解析其健康效應(yīng)的作用機制，夯實檳榔基礎(chǔ)理論，使其回歸藥用，引導(dǎo)檳榔行業(yè)轉(zhuǎn)換思路謀求再發(fā)展，對提升檳榔產(chǎn)業(yè)具備現(xiàn)實意義。

生物堿被認(rèn)為是檳榔中最主要的活性物質(zhì)，對神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)具有較強的藥理作用[30-32]。檳榔中主要生物堿包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿等[33]，其總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～0.7%[34]。Jain 等[35]建立一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）方法同時定量4 種生物堿。張瑩等[36]采用高效液相色譜法測定達原飲中檳榔生物堿的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，達原飲藥液中去甲檳榔堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.014 mg/mL。劉月麗等[28]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔提取物能改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、腦組織抗氧化能力和組織學(xué)改變，有抗衰老作用。Siregar等[37]通過成年斑馬魚行為測試，發(fā)現(xiàn)暴露于去甲檳榔堿的斑馬魚的攻擊性減少，表現(xiàn)出異常的探索行為。作為檳榔中一種生物堿有效成分，去甲檳榔堿的活性尤其抗焦慮功能尚未見報道，其具體作用機制不明。因此本研究首次以去甲檳榔堿為研究對象，采用經(jīng)典的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激所致小鼠焦慮模型在動物行為學(xué)水平篩選評價去甲檳榔堿在體內(nèi)的神經(jīng)活性，并采用分子生物學(xué)手段探索其發(fā)揮抗焦慮活性的作用機制，旨在探究去甲檳榔堿的體內(nèi)抗焦慮活性及可能的作用機制，為全面揭示檳榔健康功效提供數(shù)據(jù)支持并為檳榔資源的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 去甲檳榔堿（貨號N23911，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海吉至生化科技有限公司）。地西泮片（山東信宜制藥有限公司，批號220802）。

1.1.2 實驗動物 SPF 級C57/BL6 小鼠72 只，雄性，體質(zhì)量18.0～22.0 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2019-0063，實驗動物合格證號44829700011576，在湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司屏蔽環(huán)境D 區(qū)飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號SYXK（湘）2020-0015。小鼠自由飲用食水，實驗期間室內(nèi)溫度保持在22～24 ℃，相對濕度保持在（55±10）%，保持12 h 黑暗/12 h 照明的晝夜規(guī)律（8∶00～20∶00 亮燈）。本實驗已通過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所動物實驗倫理委員會審核并獲得批準(zhǔn)（審批號SYXK-2023042384）。

1.1.3 試劑及儀器 超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號A001-3-2）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號A003-1-2）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（貨號A007-1-1）、皮質(zhì)酮（Cort）試劑盒（貨號H205）、白細胞介素（IL）-1β（IL-1β）試劑盒（貨號H002-48）、IL-6 試劑盒（貨號H007-1-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（貨號H052）、多巴胺（DA）試劑盒（貨號H170）、血清素/5-羥色胺（5-HT）試劑盒（貨號H104）、小鼠去甲腎上腺素（NE）試劑盒（貨號H096）、γ-氨基丁酸（GABA）試劑盒（貨號H168），購自南京建成生物有限公司；Behav 動物行為分析系統(tǒng)（上海吉量科技有限公司）；ME2002E 型電子天平（梅特勒公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 根據(jù)C57/BL6小鼠體質(zhì)量隨機分為對照組、模型組、地西泮片2.5 mg/kg 組、去甲檳榔堿（10、20、40 mg/kg）組，每組12 只。依據(jù)文獻報道[38-39]折算結(jié)合實驗室前期預(yù)實驗篩選確定藥物劑量。除對照組外，其余小鼠每日隨機接受各種不同應(yīng)激源刺激，包括束縛12 h、45°傾籠12 h、禁食12 h、濕籠12 h、4 ℃冰水游泳10 min，頻閃12 h、噪音30 min、禁水12 h、晝夜顛倒等刺激，每天隨機安排，同一種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使動物不能預(yù)見給予的刺激，每日2～3 種，造模時間持續(xù)14 d，造模同時各組小鼠ig 給藥，對照組和模型組ig 給予純水，其余各組小鼠分別ig 給予相應(yīng)藥液，給藥體積為20 mL/kg，每天給藥1 次，連續(xù)給藥14 d后進行曠場、明暗箱、高架十字迷宮行為學(xué)實驗。

1.2.2 檢測指標(biāo) 曠場檢測：給藥14 d 后末次給藥后30 min，采用動物行為分析系統(tǒng)檢測10 min 內(nèi)小鼠曠場自主活動。明暗箱檢測：小鼠曠場實驗次日，進行明暗箱測試實驗，記錄小鼠10 min 內(nèi)穿箱次數(shù)。采用動物行為分析系統(tǒng)檢測小鼠在明暗箱內(nèi)活動。高架十字迷宮：明暗箱實驗次日，進行高架十字迷宮測試實驗。采用動物行為分析系統(tǒng)檢測小鼠閉臂進入次數(shù)、閉臂內(nèi)活動路程。

1.2.3 生化指標(biāo)測定 高架十字迷宮實驗結(jié)束后進行取材。小鼠眼球提取血液樣本，于4 ℃離心（3 500 r/min，10 min），吸取血清，于-80℃冰箱貯藏。采血后，將小鼠處死，在冰上迅速剝離出全腦組織，按序分裝于0.5 mL 離心管中并放入液氮中暫存，取材結(jié)束統(tǒng)一貯藏于-80 ℃冰箱。血清生物標(biāo)志物包括Cort、MDA、SOD、CAT，腦組織指標(biāo)包括氧化因子MDA、SOD、CAT，神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT、GABA，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β，均嚴(yán)格按照各自試劑盒操作。

1.2.4 蛋白免疫印跡測定 取小鼠腦組織加入裂解緩沖液和磷酸酶抑制劑，勻漿后冰上裂解30 min，將混合物在4 ℃下13 000 r/min 離心4 min，取上清液，用BCA 檢測試劑盒測定總蛋白濃度，加熱使蛋白變性。配制8%分離膠，濃縮膠濃度為5%，等量蛋白質(zhì)樣品（30 μg）進行電泳（濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓120 V），根據(jù)相對分子質(zhì)量進行分離。隨后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（300 mA 恒流，0.45 μm 孔徑，60 min）。之后在4 ℃下一抗孵育過夜：NMDAR（1∶1 000）、CamkII（1∶1 000）、Kalirin（1∶1 000）、Rac（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）。孵育次日，用T-TBS 清洗膜3 次，每次10 min 以去除未結(jié)合的抗體。二抗孵育：5% BSATBST 稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H＋L）HRP 1∶10 000，室溫孵育1 h。ECL 滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5 min；膠片曝光顯影2 min，定影。使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)條帶的可視化分析，使用Image J 軟件將相對蛋白表達水平歸一化為β-actin。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)值以表示。使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 去甲檳榔堿對小鼠曠場活動的影響

如表1 所示，與對照組比較，模型組小鼠總路程、平均速度顯著增加（P＜0.01），活動次數(shù)、休息時間顯著減少（P＜0.05），表現(xiàn)出焦慮行為，說明造模成功。與模型組比較，去甲檳榔堿10、20 mg/kg 組小鼠總路程、平均速度顯著降低（P＜0.05、0.01）。去甲檳榔堿各劑量組小鼠活動次數(shù)顯著增加（P＜0.05、0.01）；去甲檳榔堿20 mg/kg 組小鼠休息時間顯著增加（P＜0.05）。

表1 去甲檳榔堿對小鼠曠場活動的影響（，n =12）Table 1 Effects of guvacoline on open field test of mice (,n =12)

表1 去甲檳榔堿對小鼠曠場活動的影響（，n =12）Table 1 Effects of guvacoline on open field test of mice (,n =12)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

2.2 去甲檳榔堿對小鼠在明暗箱實驗中的影響

如表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠穿箱次數(shù)、明室時間顯著降低（P＜0.05、0.01），表現(xiàn)出焦慮行為，說明造模成功。與模型組比較，去甲檳榔堿20 mg/kg 組小鼠穿箱次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。

表2 去甲檳榔堿對小鼠明暗箱的影響（，n =12）Table 2 Effects of guvacoline on light-dark box test in mice(,n =12)

表2 去甲檳榔堿對小鼠明暗箱的影響（，n =12）Table 2 Effects of guvacoline on light-dark box test in mice(,n =12)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05##P＜0.01。*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

2.3 去甲檳榔堿對小鼠在高架十字迷宮實驗中的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組小鼠閉臂總路程、閉臂進入次數(shù)顯著升高（P＜0.01）。表現(xiàn)出焦慮樣行為，表明造模成功。與模型組比較，去甲檳榔堿各劑量組小鼠閉臂總路程、閉臂進入次數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

表3 去甲檳榔堿對小鼠高架十字迷宮的影響（，n =12）Table 3 Effects of guvacoline on elevated plus maze test in mice (,n =12)

表3 去甲檳榔堿對小鼠高架十字迷宮的影響（，n =12）Table 3 Effects of guvacoline on elevated plus maze test in mice (,n =12)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。**P ＜ 0.01 vs control group;##P ＜ 0.01 vs model group.

2.4 去甲檳榔堿對小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖1 所示，與模型組比較，去甲檳榔堿20、40 mg/kg 組小鼠Cort、MDA 顯著降低（P＜0.01、0.001），去甲檳榔堿各劑量組小鼠SOD、CAT 顯著增加（P＜0.05、0.001）。

圖1 去甲檳榔堿對小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（，n =12）Fig.1 Effect of guvacoline on serum oxidative stress indexes in mice (,n =12)

2.5 去甲檳榔堿對小鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖2 所示，與模型組比較，去甲檳榔堿各劑量組小鼠MDA 含量顯著降低（P＜0.01、0.001），SOD、CAT 含量顯著增加（P＜0.001）。

圖2 去甲檳榔堿對小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（，n =12）Fig.2 Effects of guvacoline on oxidative stress indexes in brain tissue of mice (,n =12)

2.6 去甲檳榔堿對小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE、GABA 釋放的影響

如圖3 所示，與模型組比較，去甲檳榔堿各劑量組小鼠的5-HT、DA、NE、GABA 含量顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖3 去甲檳榔堿對腦組織中5-HT、DA、NE、GABA 的影響（，n =12）Fig.3 Effects of guvacolineon 5-HT,DA,NE and GABA in brain tissue (,n =12)

2.7 去甲檳榔堿對小鼠腦組織中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的影響

如圖4 所示，與模型組比較，去甲檳榔堿40 mg/kg 組小鼠TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05），去甲檳榔堿各劑量組小鼠IL-6、IL-1β 含量顯著降低（P＜0.05、0.001）。

圖4 去甲檳榔堿對腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 的影響（，n =12）Fig.4 Effects of guvacoline on TNF-α,IL-6 and IL-1β in brain tissue (,n =12)

2.8 去甲檳榔堿對小鼠腦組織NMDAR/CamkⅡ/Rac 通路的影響

如圖5 結(jié)果所示，與模型組相比，去甲檳榔堿40 mg/kg 組可顯著上調(diào) NMDARa、p-CamkII/CamkII、Kalirin/β-actin、Rac/β-Actin 蛋白表達（P＜0.001）。

圖5 去甲檳榔堿對慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激小鼠NMDAR/CamkⅡ/Rac 通路的影響（，n =3）Fig.5 Effect of guvacoline on NMDAR/CamkⅡ/Rac pathway in chronic unpredictable mild stress mice (,n =3)

3 討論

焦慮癥是一種以焦慮情緒為主要表現(xiàn)的神經(jīng)癥，是以廣泛和持續(xù)發(fā)作性焦慮或反復(fù)發(fā)作性驚恐不安為主要特征的神經(jīng)性障礙，常伴有軀體、認(rèn)知和行為障礙，是一種常見的危害人類身心健康的精神疾病[40]。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激已經(jīng)成為一種廣泛使用的嚙齒類動物焦慮癥模型[41]，其是讓大鼠或小鼠在持續(xù)2 周重復(fù)暴露于各種不可預(yù)測的輕度壓力下，而形成與焦慮癥患者相似的行為學(xué)改變，是國內(nèi)外比較認(rèn)可的焦慮模型，也是抗焦慮評價的主要動物模型。因此，本研究采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激制備焦慮小鼠模型，通過曠場、明暗箱、高架十字迷宮等行為學(xué)評價小鼠焦慮樣行為。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在曠場中模型小鼠總路程、平均速度顯著增加，活動次數(shù)、休息時間顯著減少；在明暗箱實驗中模型小鼠穿箱次數(shù)、明室時間顯著降低；在高架十字迷宮實驗中模型小鼠閉臂總路程、閉臂進入次數(shù)顯著升高。結(jié)果表明本研究造模成功。

慢性應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的過度激活，這在焦慮的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。血清Cort 是嚙齒動物中HPA 軸活性的生物標(biāo)志物[42]。本研究通過測定血清Cort 水平來評估去甲檳榔堿對HPA 軸的影響。MDA 為脂質(zhì)過氧化物，一定程度上反映細胞內(nèi)的氧化程度[43]，而抗氧化酶SOD、CAT 亦是抗氧化的重要影響因素[44-45]，通過制約氧化損傷來維持細胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡。裴海月[39]研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)給予檳榔14 d 后，小鼠體內(nèi)SOD、CAT 活性明顯升高且MDA 表達量顯著下降，表明檳榔具有較好的抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，去甲檳榔堿20、40 mg/kg 組可明顯降低小鼠MDA 含量，且去甲檳榔堿各劑量組均能顯著提高小鼠SOD 和CAT 表達水平，結(jié)果與之相一致。目前，抗焦慮藥物的研究主要針對特定的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說中，神經(jīng)細胞突觸間隙的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，如5-HT、DA 和NE 水平的降低是誘導(dǎo)神經(jīng)性疾病，如焦慮、抑郁發(fā)生的主要原因之一[46]。據(jù)報道，腸道微生物群通過多種途徑影響大腦，包括GABA 系統(tǒng)的變化，并導(dǎo)致多種精神障礙[47]。Johnston 等[48]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔成分是大鼠腦切片中中樞抑制遞質(zhì)GABA 攝取的有效抑制劑。Chu[49]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔中的生物堿是GABA 攝取的強抑制劑，咀嚼檳榔可能會影響交感神經(jīng)功能，增加去甲腎上腺素的血漿濃度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲檳榔堿各劑量組顯著增加小鼠5-HT、DA、NE 和GABA 含量，即去甲檳榔堿干預(yù)逆轉(zhuǎn)了慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的5-HT、DA、NE 和GABA 水平下降，結(jié)果提示膽堿能系統(tǒng)功能改善是去甲檳榔堿發(fā)揮抗焦慮活性的潛在作用機制之一。IL-6、IL-1β具有較強的促炎活性[50]，可誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)，如細胞因子和趨化因子。IL-1β 對各種細胞有多種作用，并最終導(dǎo)致廣泛的炎癥事件[51]。與IL-1β 相似，TNF-α 是一種多效性促炎細胞因子，在調(diào)節(jié)多種發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮著不同的作用，包括炎癥、分化、脂質(zhì)代謝和凋亡[52]。TNF-α 的調(diào)節(jié)失調(diào)與多種病理狀況有關(guān)，如感染、自身免疫性疾病、癌癥、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、炎癥性腸病和椎間盤退變等[53-55]。Ma 等[56]根據(jù)來自動物和臨床研究的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)重度抑郁障礙患者的亞群具有增強的血漿TNF-α 水平的作用，阻斷TNF-α 可以改善動物模型和臨床試驗中的抑郁癥狀。本研究中，去甲檳榔堿40 mg/kg 組干預(yù)使小鼠TNF-α 含量顯著降低。結(jié)果與之相一致。NMDAR、CamkII、Kalirin、Rac 等蛋白或神經(jīng)受體都與神經(jīng)突觸可塑性的改變密切相關(guān)。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與嚙齒動物的焦慮樣行為有關(guān)。Jiang 等[57]研究表明，櫻桃葉煎劑改善慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激引起的抑郁樣行為與調(diào)節(jié)NMDAR 表達有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲檳榔堿40 mg/kg 組可顯著上調(diào)NMDAR 蛋白表達、p-CamkII/CamkII、Kalirin/β-actin 及Rac/βactin。結(jié)果表明去甲檳榔堿可通過調(diào)控NMDAR/CamkⅡ/Rac 通路對焦慮小鼠起到改善作用。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)了去甲檳榔堿具備顯著抗焦慮活性，其作用機制與對抗氧化應(yīng)激損傷、抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平以及NMDAR/CamkⅡ/Rac 信號通路有關(guān)，相關(guān)結(jié)果可為去甲檳榔堿神經(jīng)功效挖掘提供新方向，并為檳榔功效成分研究利用提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突