王玉萍，付萍萍，蒲 時(shí)，姜軍俠

（陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 西安 710003）

1 前言

大蒜素是以大蒜為原料提取的產(chǎn)品，也可化工合成，是一種具有刺激性氣味的有機(jī)硫化合物，化學(xué)名為二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，是大蒜中主要的殺菌成分［1-2］。目前作為飼料添加劑使用的大蒜素絕大部分是化工合成的產(chǎn)物。農(nóng)業(yè)上用作殺蟲(chóng)、殺菌劑，也用于飼料、食品、醫(yī)藥上［3］。

對(duì)于在農(nóng)業(yè)種植方面，也有大量研究表明大蒜素對(duì)于大部分植物的細(xì)菌性病害都具有較好的防治效果，同時(shí)對(duì)于真菌病害也具有一定的防效。根據(jù)研究報(bào)道科學(xué)使用大蒜素防治辣椒炭疽病，防效可與多菌靈相當(dāng)，達(dá)到80%左右。在國(guó)外已經(jīng)有不少大蒜素登記的農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于果樹(shù)、蔬菜、鮮花等作物上防治病害和蟲(chóng)害。在農(nóng)藥殘留方面，大蒜素是一種天然植物源農(nóng)藥，與人類(lèi)日常飲食密切相關(guān)；施藥量低，植物中殘留量遠(yuǎn)低于人體每日從大蒜中攝取量，在自然環(huán)境中易降解，國(guó)內(nèi)外未對(duì)大蒜素最大殘留限量做出規(guī)定，在我國(guó)對(duì)其使用安全性高度認(rèn)可，且至今未發(fā)現(xiàn)有大蒜素在作物上超標(biāo)而引起人體危害的情況。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；二烯丙基二硫醚標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ω≥89.0%；二烯丙基三硫醚標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ω≥90.9%；（ChromaDex）；5%大蒜素微乳劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1260，具有二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent 色譜工作站；色譜柱：150 mm×4.6 mm（i.d.）不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18、5μm填充物。

2.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：Ψ（乙腈∶水）＝60∶40，經(jīng)濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣；流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣體積：5μL；保留時(shí)間：二烯丙基二硫醚約7.6 min；二烯丙基三硫醚約12.2 min。典型的大蒜素的標(biāo)樣、樣品色譜圖（圖1、2、3）。

圖1 二硫醚標(biāo)樣色譜圖

圖2 三硫醚標(biāo)樣色譜圖

圖3 大蒜素5%微乳劑試樣液相色譜圖

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 分別稱(chēng)取0.05 g（精確至0.000 1 g）二硫醚和三硫醚標(biāo)樣于2 個(gè)100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱(chēng)取含0.05 g（精確至0.000 1 g）大蒜素的試樣于100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度并搖勻，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，過(guò)濾。

2.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2 針二硫醚或三硫醚峰面積相對(duì)變化＜1.2%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.4.4 計(jì)算 將測(cè)得的2 針試樣溶液以及試樣前后2 針標(biāo)樣溶液中二硫醚或三硫醚峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中二硫醚或三硫醚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式（1）計(jì)算，兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和即為大蒜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：

ω1——試樣中二硫醚或三硫醚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A2——試樣溶液中二硫醚或三硫醚峰面積的平均值；

m1——標(biāo)樣的質(zhì)量的數(shù)值，g；

ω——標(biāo)樣中二硫醚或三硫醚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A1——標(biāo)樣溶液中二硫醚或三硫醚峰面積的平均值；

m2——試樣的質(zhì)量的數(shù)值，g。

3 結(jié)果分析

3.1 色譜條件選擇 色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根據(jù)大蒜素物化性質(zhì)、溶劑的紫外吸收波長(zhǎng)和成都新朝陽(yáng)作物科學(xué)有限公司的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動(dòng)相。為了得到更好的分離效果和峰形，將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)Ψ（乙腈∶水）=60∶40 作為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，該條件下，二硫醚和三硫醚色譜峰峰形較好，峰純度＞990，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)Agilent 1260 高效液相色譜儀的光譜數(shù)據(jù)采集功能，二硫醚、三硫醚的紫外光譜圖（圖4、5），從圖中可以看到二硫醚和三硫醚的最大吸收波長(zhǎng)均約為190 nm，190 nm屬于低波長(zhǎng)段，靈敏度雖高，但干擾較大，故選擇230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，靈敏度較好，且干擾小，能滿(mǎn)足分析要求。

圖4 二硫醚的紫外光譜圖

圖5 三硫醚的紫外光譜圖

3.3 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 按2.4.1 標(biāo)樣溶液的制備方法配制5 個(gè)不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1 至STD5。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1 至STD5 的順序測(cè)定每個(gè)溶液中二硫醚或三硫醚的峰面積，取2 次測(cè)定的平均結(jié)果。以二硫醚或三硫醚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果（表1、2）、（圖6、7）。

表1 二硫醚線性范圍的測(cè)定

表2 三硫醚線性范圍的測(cè)定

圖6 二硫醚峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

圖7 三硫醚峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

從表1～2和圖6～7可以看出，當(dāng)二硫醚質(zhì)量濃度在280.4～654.2 mg/L 之間（進(jìn)樣體積5μL），三硫醚質(zhì)量濃度在128.2～542.5 mg/L 之間（進(jìn)樣體積5 μL），與相應(yīng)的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y二硫醚=7.330 3x+99.808、y三硫醚=14.113x-204.16，相關(guān)系數(shù)r二硫醚=0.999 9、r三硫醚=0.996 1 完全可以滿(mǎn)足定量分析要求。本方法中二硫醚和三硫醚標(biāo)樣質(zhì)量濃度分別為467.3、339.1 mg/L（進(jìn)樣體積5μL）。

3.4 分析方法的精密度試驗(yàn) 按2.4.2 試樣溶液的制備方法配制5 個(gè)5%大蒜素微乳劑精密度溶液，以有效成分線性相關(guān)溶液STD3 為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（表3）。

表3 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.5 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱(chēng)取含0.025 g（精確至0.000 1 g）大蒜素的5%大蒜素微乳劑于100 mL 容量瓶中，再分別加入二硫醚的標(biāo)樣0.025 g 和三硫醚標(biāo)樣0.015 g，按2.4.2 試樣溶液的制備方法配制5 個(gè)有效成分準(zhǔn)確度溶液，以線性相關(guān)溶液STD3 為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（表4）。

表4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.6 方法特異性 本試驗(yàn)采用HPLC-DAD 峰純度分析法來(lái)鑒別大蒜素。大蒜素標(biāo)樣、5%大蒜素微乳劑的大蒜素HPLC-DAD 峰純度均＞990，有效成分處無(wú)其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖（圖8～11）。

圖8 二硫醚標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖9 三硫醚標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖10 5%大蒜素微乳劑中二硫醚HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖11 5%大蒜素微乳劑中三硫醚HPLC-DAD峰純度色譜圖

4 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)大蒜素微乳劑中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜素在測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有分離效果好，分析時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，符合定量分析要求，是一種高效、快速、準(zhǔn)確的分析方法。