王 宇

腎活檢病理是腎小球疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1],診斷的手段包括光鏡、免疫熒光和電鏡。三種觀察方法對組織處理的要求不同,因此穿刺的腎活檢標(biāo)本需要人為地進行分割。這一操作容易造成某一觀察項目沒有腎小球的情況,此外也無法在同一腎小球中同時進行光鏡、免疫熒光及電鏡觀察。盡管在體視鏡或普通光學(xué)顯微鏡下分割腎組織可以盡量避免沒有腎小球的情況,但操作非常依賴穿刺醫(yī)師的水平,且對于出現(xiàn)硬化或缺血腎小球的組織,即使在顯微鏡下辨別穿刺組織中的腎小球亦非常困難。更重要的是,對于僅表現(xiàn)為局灶性病變的疾病,人為分割很可能導(dǎo)致在一個檢查項目中觀察到病變,在另外的檢查項目中觀察不到。此外,三種觀察手段的觀察重點不同,免疫熒光主要觀察是否存在免疫復(fù)合物及補體的沉積,光鏡主要觀察整體的形態(tài)學(xué)改變,電鏡則主要觀察超微結(jié)構(gòu)異常。盡管三種觀察方法是分開的,但我們需要整合三種觀察內(nèi)容對疾病進行整體分析,因此假如在同一腎小球中能同時獲得免疫、形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的信息更有利于我們做出準(zhǔn)確的診斷和開展發(fā)病機制的研究。

TSA/Opal是實現(xiàn)石蠟切片多重免疫熒光染色的一項新興技術(shù)[2]。隨著單細胞測序、空間蛋白組學(xué)以及腫瘤微環(huán)境等研究的開展,越來越多的實驗團隊選擇這項技術(shù)來實現(xiàn)病理組織多靶點的原位觀察[3]。本實驗借鑒了TSA/Opal在腫瘤學(xué)研究的應(yīng)用方法,嘗試在腎活檢標(biāo)本石蠟切片中進行染色,旨在減少腎活檢穿刺標(biāo)本的分割,并實現(xiàn)在同一腎小球中觀察免疫異常和形態(tài)學(xué)改變的目的,結(jié)果表明該技術(shù)能準(zhǔn)確識別免疫球蛋白及補體,與同一患者冷凍切片的免疫熒光結(jié)果有很好的一致性,且具有敏感性和特異性高的優(yōu)點,是一種可以常規(guī)開展的病理技術(shù),現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科住院患者的腎活檢石蠟組織標(biāo)本。經(jīng)病理診斷為IgA腎病、膜性腎病和狼瘡性腎炎各3例。

1.2 實驗試劑檸檬酸抗原修復(fù)液粉劑(pH 6.0,福州邁新公司);吐溫20(北京索萊寶公司)。磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.0,北京中杉金橋公司);抗原修復(fù)用胰蛋白酶(北京中杉金橋公司);內(nèi)源性過氧化物酶封閉液(碧云天公司);即用型封閉用山羊血清(博士德公司);兔抗人IgA、IgG、IgM、C1q、C3c、C4c抗體購自福州邁新公司,小鼠抗人κ、λ抗體購自Abcam公司;山羊抗鼠兔通用二抗(北京中杉金橋公司)。350、488、594酪胺及酪胺放大緩沖液購自蘇州UElandy公司。

1.3 實驗儀器微波爐(格蘭仕公司)。恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特公司)。4 ℃冰箱(海爾公司)。熒光顯微鏡(尼康公司)。

1.4 染色方法石蠟切片60 ℃烤片30 min,脫蠟至水。內(nèi)源性過氧化物酶封閉10 min,蒸餾水流水沖洗5 min。切片浸沒于檸檬酸抗原修復(fù)液中,100%火力3 min,50%火力7 min,靜置15 min。吐溫20配置PBS緩沖洗液(PBST)洗片3次,每次5 min。胰蛋白酶37 ℃恒溫修復(fù)30 min。PBST洗片3次,每次5 min。山羊血清恒溫封閉30 min。棄血清,滴加第一種一抗(濃度均為1∶100),4 ℃過夜?；謴?fù)室溫,PBST洗片3次,每次5 min。37 ℃恒溫孵育二抗1 h。PBST洗片3次,每次5 min。酪胺放大緩沖液配置酪胺37 ℃避光孵育10 min。PBST避光洗片3次,每次5 min。切片浸沒于檸檬酸抗原修復(fù)液中,100%火力3 min,50%火力7 min,靜置15 min,進行抗體洗脫。重復(fù)上述抗體孵育和酪胺孵育過程,分別孵育第二種和第三種一抗(本實驗中IgA、IgG、IgM于一個組織,C1q、C3c、C4c于一個組織,輕鏈κ、λ于一個組織分別進行三色或兩色熒光染色)。

2 結(jié)果

IgA腎病組織免疫熒光顯示系膜區(qū)高亮度的紅色IgA和C3熒光染色,在同一組織中未見IgG(綠色)和IgM(藍色)或C1q(紅色)和C4c(藍色)熒光信號(圖1)。膜性腎病組織免疫熒光顯示毛細血管基底膜外側(cè)高亮度綠色IgG熒光染色,在同一組織中未見IgA(紅色,毛細血管內(nèi)有節(jié)段非特異IgA沉積)和IgM(藍色)或C1q(紅色)和C4c(藍色)特異性熒光信號(圖2)。狼瘡性腎炎患者系膜區(qū)和毛細血管基底膜IgA(紅色)和IgG(綠色)共定位,且與光鏡連續(xù)切片的同一腎小球有組織對應(yīng)關(guān)系;另一狼瘡性腎炎患者κ(紅色)和λ(綠色)共定位,且與光鏡連續(xù)切片的同一腎小球有組織對應(yīng)關(guān)系(圖3)。

圖2 膜性腎病石蠟切片免疫熒光染色：免疫球蛋白IgA、IgG、IgM在同一張石蠟切片同一腎小球中的沉積及另一張連續(xù)切片中補體C1q、C3、C4的沉積

圖3 狼瘡性腎炎石蠟切片免疫熒光染色及與光鏡連續(xù)切片六胺銀染色(PASM)的組織對應(yīng)：免疫球蛋白IgA、IgG在同一張石蠟切片同一腎小球中的沉積及與光鏡六胺銀染色切片同一腎小球的組織對應(yīng);另一例狼瘡性腎炎患者輕鏈κ、λ在同一張石蠟切片同一腎小球中的沉積,與光鏡六胺銀染色切片同一腎小球的組織對應(yīng)

3 討論

盡管腎臟病理學(xué)家長期以來都希望在同一個腎小球中同時觀察免疫異常和組織結(jié)構(gòu)異常,但技術(shù)的限制阻礙了石蠟切片免疫熒光染色的廣泛應(yīng)用。隨著病理技術(shù)的發(fā)展,基于TSA/Opal技術(shù)的多重石蠟免疫熒光吸引了越來越多病理學(xué)家的關(guān)注。本實驗證實了TSA/Opal技術(shù)作為腎活檢常規(guī)免疫熒光方法的可靠性。利用TSA/Opal技術(shù)進行石蠟切片免疫熒光染色可以獲得與冷凍切片相似甚至更強的信號[4],無需提高一抗?jié)舛燃纯杀ＷC檢測的敏感性。特異性方面,與傳統(tǒng)石蠟切片免疫熒光相比,TSA/Opal染色的石蠟切片背景更清晰,信噪比更好。此外,由于與光鏡切片使用的是同一石蠟組織,連續(xù)切片制作的免疫熒光切片中的腎小球與光鏡中觀察的腎小球一致,可以實現(xiàn)免疫異常和組織結(jié)構(gòu)異常的同位觀察,這對于局灶性病變的診斷尤為重要(病變可能僅存在于部分腎小球中,人為分割腎組織可能導(dǎo)致僅能在熒光切片中觀察到病變而光鏡不能,或反之亦然)。

免疫熒光染色是腎活檢病理必不可少的觀察手段?，F(xiàn)普遍使用的是分割腎活檢組織的冷凍切片來進行免疫熒光染色。但在臨床實踐中,冷凍切片中沒有腎小球的情況時有發(fā)生,此時需要使用石蠟免疫熒光染色進行補救。此外,當(dāng)在冷凍組織中預(yù)期有免疫球蛋白或輕鏈成分但未檢測到時(通常在懷疑有單克隆免疫球蛋白沉積的情況下),同樣需要行石蠟切片免疫熒光染色以除外假陰性[5]。但石蠟切片免疫熒光存在敏感性差的缺點,即使在酶修復(fù)和熱修復(fù)后,為了獲得確切的熒光信號,也需要提高一抗?jié)舛取?/p>

冷凍切片免疫熒光的優(yōu)點是抗原暴露好,檢查的敏感性高,染色步驟簡單,但其缺點是缺乏固定,不能很好地展示組織結(jié)構(gòu),尤其不能滿足明確靶蛋白亞細胞定位的需要。我們在另一項基礎(chǔ)研究中觀察到,主要定位于細胞核中的靶蛋白在冷凍切片中廣泛出現(xiàn)在細胞質(zhì)內(nèi)。此外,在進行單克隆免疫球蛋白相關(guān)腎病及C3腎小球病等疾病的診斷時,為了避免冷凍切片抗原“遮蔽”,石蠟切片免疫熒光已被推薦為常規(guī)進行的病理檢查項目[6]。若未來石蠟切片免疫熒光作為常規(guī)的免疫熒光觀察方法,我們將不必在進行冷凍切片免疫熒光后再行石蠟切片免疫熒光。

一直以來,多重免疫熒光染色都僅能使用冷凍切片。即使在基礎(chǔ)研究中,對固定的動物組織或細胞標(biāo)本進行多重?zé)晒馊旧卜浅Ｓ屑夹g(shù)挑戰(zhàn),往往需要針對不同的抗體進行多次預(yù)實驗才能確定實驗步驟。更讓人困擾的是,基于抗原抗體結(jié)合原理的傳統(tǒng)免疫熒光染色方法在檢測多重靶點時,為避免標(biāo)記不同熒光信號的二抗與不同一抗結(jié)合發(fā)生交叉反應(yīng),要求必須使用不同種屬來源的一抗和針對性二抗,這大大限制了科研人員選擇商業(yè)抗體的范圍,也提高了成本。TSA/Opal技術(shù)的原理與傳統(tǒng)免疫組化相似,不同的是它利用了二抗結(jié)合的辣根過氧化物酶激活酪胺,之后這些被熒光信號標(biāo)記的酪胺可以與抗體周圍的組織酪氨酸殘基結(jié)合,實現(xiàn)信號標(biāo)記。由于每個二抗都能激活大量的酪胺,因此這種方法放大了信號,提高了敏感性,且由于酪胺僅在抗體結(jié)合部位被激活,因此也具有很好的特異性。每輪染色結(jié)束時,利用微波熱修復(fù)方法即可將該輪結(jié)合的抗體洗脫,重復(fù)上一輪的操作即可孵育下一種抗體。從上述原理可知,該技術(shù)的信號直接標(biāo)記在靶抗原上,上一種抗體洗脫后,不用擔(dān)心會與下一種抗體發(fā)生交叉反應(yīng),因此可以使用多個來源于同一種屬的不同一抗和相同二抗進行多重免疫熒光染色[7]。多個靶標(biāo)的同位觀察對于一些特殊腎病非常有價值,且該技術(shù)為我們利用珍貴活檢組織進行機制研究提供了支持。

本實驗僅探討了利用石蠟切片免疫熒光減少冷凍切片組織分割的情況,事實上,目前光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像技術(shù)已整合了熒光和電鏡技術(shù),使超微結(jié)構(gòu)和蛋白靶標(biāo)的同位觀察成為可能[8],但高昂的設(shè)備成本和繁瑣的技術(shù)要求限制了該技術(shù)還僅應(yīng)用在科研領(lǐng)域。相信隨著科技發(fā)展,在同一腎小球中同位觀察免疫沉積、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)異常的設(shè)想會被實現(xiàn)。此外,本實驗在進行多重?zé)晒馊旧珪r使用的是手工操作,因此整體染色時間略長,目前已有TSA/Opal自動化平臺能在1天內(nèi)完成3個靶點的多重染色,大大節(jié)省了人力和時間,據(jù)報道該技術(shù)平臺最多可在同一組織中進行7個靶點的熒光染色。

總之,本實驗證實了TSA/Opal技術(shù)可提高腎活檢病理石蠟免疫熒光的敏感性,同時其不依賴于抗體種屬的多靶點同位檢測不僅節(jié)省了組織,還能有效整合免疫和組織結(jié)構(gòu)的病理信息,為精確診斷和發(fā)病機制研究提供了技術(shù)保障。