王揚鐸，蘇永昌，王曉燕，施文正，劉智禹,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 202206；2.福建水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建廈門 361013）

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）通過抑制人體組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）的活性，從而阻礙血管收縮劑（血管緊張素Ⅱ，AngⅡ）的生成以及血管舒張劑（舒緩激肽，Bradykinin）的失活，起到調(diào)節(jié)人體血壓，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。目前制備食源性蛋白的ACE 抑制肽（Angiotensin converting enzyme inhibitors peptide，ACEIP）具有更高的安全性、專一性并且無副作用，更易被人體吸收，已成為當(dāng)下預(yù)防和治療高血壓非藥物策略的一種非常有效的手段[1]。其中蛋白資源豐富的海洋生物由于其生存環(huán)境的特殊性，在生物代謝過程中積累了具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能活性的物質(zhì)，相比陸生動植物蛋白具有更大的優(yōu)勢與特性，因此海洋源蛋白ACE 抑制肽成為該領(lǐng)域研究的熱點之一[2]。

仿刺參（Apostichopus japonicus），屬棘皮動物門（Echinodermata）海參綱的無脊椎海洋生物。作為消費市場上主要的食用海參之一，仿刺參的可食用部位除體壁外，還包括副產(chǎn)物腸與卵等，據(jù)此山東沿海也有“一花（精或卵）二腸三滾子（體壁）”的說法。而在我國多數(shù)區(qū)域被剔除的副產(chǎn)物大多被直接丟棄或用作飼料，造成環(huán)境污染和資源的浪費，副產(chǎn)物的有效合理利用將解決此類問題，提高仿刺參應(yīng)用的附加值。仿刺參各部位營養(yǎng)成分豐富并表現(xiàn)出許多生物活性功能，包括抗氧化[3]、抗凝血、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]等作用，并被用于制造功能性食品、藥品、護(hù)膚品[6]。

目前關(guān)于仿刺參降壓肽的來源主要集中在體壁，副產(chǎn)物性腺、內(nèi)臟和水煮液等，只以初加工為主，隨著副產(chǎn)物的高附加值逐漸被重視，也有研究表明這些副產(chǎn)物通過蛋白水解，同樣能產(chǎn)生具有降壓活性的多肽[7-9]。而且關(guān)于ACE 抑制肽研究均以其性腺、內(nèi)臟整體作為主體，缺少精細(xì)化的分類和研究，并尚無報道對仿刺參不同部位降壓活性進(jìn)行比較分析，明確其具有較強(qiáng)的活性部位，國內(nèi)對仿刺參卵降壓活性肽的報道也相對較少。

基于仿刺參及其加工副產(chǎn)物的高值化利用，對可食用的仿刺參不同部位（體壁、腸、卵）采用蛋白酶解法進(jìn)行水解。通過體外ACE 抑制率判斷其降血壓活性，以此為指標(biāo)比較篩選出最適蛋白酶及最優(yōu)抑制活性部位；經(jīng)單因素實驗與響應(yīng)面試驗優(yōu)化確定活性肽最佳制備條件，測定活性肽分子量分布范圍，通過超濾膜分離制備具有較高活性的低聚肽。旨在為仿刺參副產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)制備ACE 抑制肽的創(chuàng)新研發(fā)和副產(chǎn)物資源再利用提供理論依據(jù)，為提升仿刺參產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用附加值，并為其綜合利用開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仿刺參 購自福建省寧德市霞浦縣，均為性成熟的仿刺參原料，其體壁、腸和卵已被處理分揀并通過全程冷鏈運輸至實驗室，-20 ℃冷庫以保證品質(zhì)無損。原料進(jìn)行真空冷凍干燥處理，凍干研磨粉碎后放置0～4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?；濃鹽酸、乙腈、甲醇、硼酸、硼砂、三氟乙酸等 均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶 200 U/mg，南寧龐博生物工程有限公司；馬脲酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）美國Sigma 公司；實驗用水為超純水。

BSA224S 分析天平 德國賽多利斯；Alpha2-4LDplus 真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ 公司；Five Easy pH 計 瑞士梅特勒-托利多公司；數(shù)顯型恒溫水浴鍋 上海力辰邦西器科技有限公司；Waters e2695 型高效液相色譜儀 美國Alliance 公司；Sun Fire C18色譜柱 德國Merck 公司；TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）凝膠柱 日本東曹株式會社；ST16R 型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Sorvall 公司；CeraMem-0100 陶瓷膜過濾設(shè)備（200 nm陶瓷膜）、RNF-0460 超濾膜濃縮設(shè)備（3000 Da 超濾膜）廈門福美科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 仿刺參不同部位蛋白酶解物制備 分別稱取一定質(zhì)量的仿刺參體壁、腸、卵凍干粉，按照底物濃度2%添加超純水振蕩混勻，恒溫水浴預(yù)熱，調(diào)節(jié)pH 后加入相應(yīng)蛋白酶。在適宜溫度下水解一定時間，隨后立刻置于95～100 ℃的水浴鍋中進(jìn)行鈍化滅酶15 min，待自然冷卻后4 ℃、4000 r/min 條件下離心15 min，上清液部分即為不同部位的蛋白酶解液，并取部分蛋白酶解液冷凍干燥成粉備用[10]。

1.2.2 水解蛋白酶的篩選 分別選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶三種具有較大水解pH 差異的蛋白酶作為水解酶。按照底物濃度2%、加酶量3 U/mg、酶解時間5 h 對仿刺參體壁、腸及卵凍干粉在蛋白酶各自最適條件下密封振蕩酶解（表1）。通過測定其充分酶解后不同部位稀釋10 倍后蛋白酶解液的ACE 抑制率，比較分析以篩選出最適宜的酶源。

表1 不同蛋白酶最適水解條件Table 1 Optimum enzymolysis conditions of different proteases

1.2.3 最優(yōu)降壓活性部位比較篩選 分別稱取適量經(jīng)冷凍干燥處理后的仿刺參體壁、腸、卵粉末蛋白酶解物，加入超純水溶解，將其分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、2、4、8 mg/mL 的6 個梯度，進(jìn)行3 組平行實驗測定計算出各濃度樣品的ACE 抑制率。使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行非線性曲線擬合分析，計算不同部位ACE 抑制率的半數(shù)抑制濃度值（IC50）。通過比較不同濃度下各部位ACE 抑制率大小并結(jié)合IC50值驗證，篩選出具有較強(qiáng)ACE 抑制效果的仿刺參部位，用作降壓組分活性肽的制備工藝優(yōu)化。

1.2.4 ACE 抑制率測定 通過反相高效液相色譜法對蛋白酶解物ACE 抑制活性進(jìn)行測定，根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[11-12]對測定方法進(jìn)行優(yōu)化。

配制pH8.3，濃度為0.1 mol/L 硼酸-硼砂緩沖溶液（含0.3 mol/L NaCl）；將100 mg 粉末狀馬脲酰組氨酰亮氨酸（HHL）加入46.57 mL 的硼酸-硼砂緩沖溶液，充分溶解后為5 mmol/L HHL 溶液；粉末狀0.25 unit 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）加入5 mL 硼酸-硼砂緩沖溶液充分溶解，即50 mU/mL ACE 溶液。

在2 mL 離心管內(nèi)加入100 μL HHL 溶液和100 μL 酶解液，置于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入50 μL ACE 溶液后，37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h。待反應(yīng)完成后，迅速加入200 μL 1 mol/L 鹽酸溶液終止反應(yīng)，通過0.22 μm 水系濾膜的樣液注入進(jìn)樣瓶，上機(jī)測定各組樣液中馬尿酸峰面積（μV·s）從而計算馬尿酸含量，以超純水作為空白對照組。

式（1）中，α：空白對照組馬尿酸峰面積（μV·s）；β：蛋白酶解液馬尿酸峰面積（μV·s）；

檢測條件：色譜柱：SunFireC18分析色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；過柱流速：1 mL/min；單樣進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測波長228 nm；流動相:乙腈:水（含0.1%三氟乙酸）=32:68（體積比）。

1.2.5 ACE 抑制肽制備工藝優(yōu)化

1.2.5.1 單因素實驗設(shè)計 在蛋白酶及活性部位篩選的實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以最適酶源堿性蛋白酶為提取酶，對具有較高降壓活性的仿刺參卵進(jìn)行單因素制備工藝設(shè)計。分別對酶解溫度、酶解底物濃度、pH、酶解時間、加酶量這5 個因素不同水平進(jìn)行調(diào)整，研究其對體外ACE 抑制率的影響。

1.2.5.2 酶解溫度 仿刺參卵凍干粉底物濃度為2%，加酶量為3.0 U/mg，pH 調(diào)為9.0，分別在40、45、50、55、60、65、70 ℃的酶解溫度下進(jìn)行恒溫酶解5 h，以蛋白酶解液ACE 抑制率為指標(biāo)，探討溫度對蛋白酶酶解效果的影響。

1.2.5.3 酶解pH 在酶解溫度為50 ℃，仿刺參卵凍干粉底物濃度為2%，加酶量為3.0 U/mg，酶解時間5 h 前提下，對pH 為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 的7 組蛋白酶解液進(jìn)行ACE 抑制率測定，探討酶解pH 變化對其酶解效果的影響。

1.2.5.4 底物濃度 在酶解溫度為50 ℃，加酶量為3.0 U/mg，酶解pH 為9.0，酶解時間5 h 的條件下對5 組不同含量的底物濃度0.5%、1%、2%、3%、4%進(jìn)行ACE 抑制率測定。

1.2.5.5 酶解時間 在仿刺參卵凍干粉底物濃度2%，加酶量3.0 U/mg，pH 為9.0，溫度50 ℃條件下，分別測定酶解時間在3、4、5、6、7 h 的ACE 抑制率以確定最適合的酶解時間，通過對其ACE 抑制率的測定分析酶解時間對酶解效果的影響。

1.2.5.6 加酶量 仿刺參卵凍干粉底物濃度為2%，pH 為9.0，溫度50 ℃，分別在2、2.5、3.0、3.5、4.0 U/mg 的酶添加量情況下酶解5 h，通過ACE 抑制率的變化趨勢分析加酶量對酶解效果的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計 以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，基于Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計方法，將時間與加酶量作為固定量。選取對ACE 抑制率有顯著影響的3 個因素酶解溫度（A）、pH（B）、底物濃度（C）為自變量，并將響應(yīng)值設(shè)為蛋白酶解物ACE 抑制率，應(yīng)用Design-Expert 8.06 軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 Box-Behnken 試驗因素水平設(shè)計Table 2 Factor coding of Box-Behnken experimental design

1.2.7 酶解產(chǎn)物分子量分布測定 采用高效凝膠過濾色譜法結(jié)合Empower GPC 處理軟件對經(jīng)工藝優(yōu)化后的仿刺參卵蛋白酶解物進(jìn)行分子量分布測定[13]。將濃度為1 mg/mL 的5 種不同分子量標(biāo)準(zhǔn)品按一定比例進(jìn)行混合；將酶解產(chǎn)物凍干粉溶解配制為10 mg/mL 溶液，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜過濾后上樣，得到混合標(biāo)品及仿刺參卵酶解產(chǎn)物色譜圖。以混合標(biāo)品的分子量對數(shù)（lgMw）對其保留時間作圖得到標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線及三階回歸方程，利用GPC 軟件將酶解產(chǎn)物色譜圖帶入校正曲線方程分析計算得到分子量及多肽分布范圍。

所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C（Mw 12384 Da）、抑肽酶（Mw 6512 Da）、桿菌酶（Mw 1423 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（Mw 451 Da）、Gly-Gly-Gly（Mw 189 Da）。色譜檢測條件：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）凝膠柱；過柱流速：1 mL/min；單樣進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測波長228 nm；流動相：乙腈:水（含0.1%三氟乙酸）=45:55（體積比）。

1.2.8 超濾膜分離 將最佳酶解工藝所得仿刺參卵蛋白酶解液進(jìn)行超濾分離。首先將經(jīng)優(yōu)化后的仿刺參卵酶解液過200 nm 的陶瓷膜對其大顆粒雜質(zhì)及雜菌進(jìn)行過濾，后利用相對分子質(zhì)量孔徑為3000 Da的超濾膜對其超濾分級，分為截留液和濾過液（低聚肽）兩個組分。真空冷凍干燥得到活性肽粉，將經(jīng)工藝優(yōu)化后的酶解液凍干粉與截留液和低聚肽的3 組活性肽粉分別加入超純水溶解配制成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL 的5 個梯度計算出各濃度的ACE 抑制率，并結(jié)合IC50值驗證分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗測定進(jìn)行三次重復(fù)實驗，最終數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；使用SPSS 22.0 軟件對各組單因素實驗結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析；使用Design Expert 8.06 軟件對響應(yīng)面優(yōu)化試驗進(jìn)行回歸性分析；使用Origin 2023 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位酶解物ACE 抑制活性分析

2.1.1 水解蛋白酶的篩選 酶解法由于其操作可控性強(qiáng)、酶切作用位點高效專一、完全蛋白酶解物生物活性較高、反應(yīng)條件溫和且有較少的副產(chǎn)物產(chǎn)生，成為當(dāng)下蛋白降解最常用方法之一[14]。本研究中采用堿性、中性和胃蛋白酶分別在各自最適的蛋白酶解條件下對仿刺參不同部位進(jìn)行充分水解，并測定各組ACE 抑制率，比較篩選出最適酶解蛋白酶。如圖1 所示，在仿刺參體壁和卵的蛋白酶解物ACE 抑制率測定中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性更強(qiáng)，其抑制率分別為79.90%±3.63%、84.32%±0.51%，而胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性在兩個部位中均為最低。在仿刺參腸的ACE 抑制率測定中，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物具有更強(qiáng)的ACE 抑制活性，抑制率最高為71.01%±1.22%，其次為堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物，ACE 抑制率為54.21%±0.63%。在全部酶解產(chǎn)物ACE抑制率測定中，抑制率最高為使用堿性蛋白酶酶解的仿刺參卵酶解物，比胃蛋白酶酶解仿刺參腸產(chǎn)物高出約13.31%。有研究指出堿性蛋白酶作用于仿刺參原料的蛋白裂解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性，與其特異的酶切位點相關(guān)，例如其偏好在堿性氨基酸殘基（如精氨酸或賴氨酸）旁邊的肽鍵處進(jìn)行作用[15]，這種特異性切割特定肽段會導(dǎo)致其肽段數(shù)量、氨基酸序列等差異影響其功能活性[16]。分析比較篩選出具有更強(qiáng)ACE 抑制活性的堿性蛋白酶為最適酶源，其有利于仿刺參蛋白的成分提取，更適合作為具有較高活性的降血壓活性物質(zhì)制備的工具酶，有開發(fā)利用的潛力。

圖1 不同酶源制備仿刺參各部位酶解物的ACE 抑制率Fig.1 ACE inhibition rate of enzymolysis from various parts of A.japonicus by different enzyme sources

2.1.2 最優(yōu)降壓活性部位的比較篩選 使用篩選出的堿性蛋白酶，在其最適的酶解條件下分別對不同濃度梯度下的仿刺參體壁、腸和卵進(jìn)行充分酶解5 h后，測定ACE 抑制率，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，三種樣品中，仿刺參卵酶解產(chǎn)物在不同濃度均呈現(xiàn)出最高的ACE 抑制率，其次為體壁，與2.1.1 結(jié)果一致，隨著不同部位酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高，抑制率也隨即升高，呈正相關(guān)。其中仿刺參卵酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度在8 mg/mL 時，其ACE 抑制率達(dá)到最高為91.63%±0.21%。

圖2 仿刺參不同部位酶解物的ACE 抑制率Fig.2 ACE inhibition rate of enzymolysis from different parts of A.japonicus

IC50值是通過對原始質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式繪制曲線，并由此曲線進(jìn)行擬合計算得出的[17]，常被用于評價藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即抑制能力越強(qiáng)，其數(shù)值越低，因此常被用于藥物作用的科學(xué)評價。圖3 為仿刺參不同部位酶解物ACE 抑制率的IC50值測定結(jié)果，由圖3 可知，仿刺參體壁、腸、卵酶解物ACE 抑制率的IC50值分別為1.11±0.04、4.02±0.09、0.65±0.02 mg/mL，數(shù)值較小的仿刺參卵蛋白酶解物具有最好的ACE 抑制效果，降壓效果由高到低依次為卵＞體壁＞腸。比較證明仿刺參副產(chǎn)物卵相比于體壁與腸來說具有更好的降壓活性，具有潛在蛋白及活性物質(zhì)的開發(fā)價值，可用于降血壓功能性食品或藥品的開發(fā)。

圖3 仿刺參不同部位ACE 抑制率的IC50 值測定Fig.3 Determination of IC50 values of ACE inhibition rates in different parts of A.japonicus

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對ACE 抑制率的影響 由圖4 可知，酶解溫度對仿刺參卵酶解液的ACE 抑制率具有顯著（P＜0.05）影響。測定7 組不同溫度下酶解物的ACE 抑制率，結(jié)果表明，隨著溫度的上升，ACE 抑制率不斷增加，其中50～55 ℃時ACE 抑制率上升速度減緩；隨后隨著溫度上升，抑制率迅速增加并在65 ℃時達(dá)到最高值78.75%±1.10%，升高至70 ℃呈現(xiàn)下降趨勢。在蛋白酶的適宜酶解溫度范圍內(nèi)，溫度的升高促使蛋白酶活力增強(qiáng)，加速酶解反應(yīng)并讓活性肽片段被更好地釋放。但當(dāng)酶解溫度過高并超過其最適范圍會導(dǎo)致酶逐漸失活，從而使酶解液抑制活性迅速降低[18]。綜上，確定其最佳酶解溫度為65 ℃，選取溫度60、65、70 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

圖4 溫度對蛋白酶解液ACE 抑制率影響Fig.4 Effects of temperature on ACE inhibition rate of protease hydrolysate

2.2.2 pH 對ACE 抑制率的影響 相對于蛋白酶最適作用范圍下的pH，較高或較低都將對蛋白酶和樣品底物的解離狀態(tài)造成不同程度的負(fù)向影響，同時會對蛋白酶空間結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致酶特異性切割位點改變，使ACE 抑制活性降低[10,19]。由圖5 可知，蛋白酶解液pH 范圍在7.5～9.0 時，抑制活性逐漸增強(qiáng)并在pH9 時達(dá)到最高值69.28%±0.28%，隨后逐漸降低。因此，確定pH9 為蛋白酶較合適的酶解pH，選取pH8.5、9、9.5 作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計條件。

圖5 pH 對蛋白酶解液ACE 抑制率影響Fig.5 Effects of pH on ACE inhibition rate of protease hydrolysate

2.2.3 底物濃度對ACE 抑制率的影響 由圖6 可知，底物濃度對ACE 抑制率具有顯著影響并且不同濃度間均存在顯著差異（P＜0.05）。蛋白酶解液ACE抑制率隨著底物濃度的不斷增加呈現(xiàn)先迅速升高后緩慢下降的趨勢，在底物濃度為3%時具有最高的ACE 抑制率78.10%±0.32%。這可能與其水解度有關(guān)，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低，反應(yīng)物含量少，即使完全水解酶解液中游離氨基酸及多肽的含量也相對較低，較低水解度導(dǎo)致ACE 抑制率也較低；隨底物濃度增加，酶解過程中大量底物蛋白與蛋白酶可以充分接觸，水解度升高提高了其反應(yīng)效率使ACE 抑制率增高[7]；而過高的底物濃度對蛋白酶在樣液的自由擴(kuò)散產(chǎn)生阻礙作用，其流動性減弱導(dǎo)致相同酶解時間下水解度下降，酶解液中多肽含量降低，致使抑制率平穩(wěn)或下降[20]，這與吳國宏[21]在以水解度為指標(biāo)對海參卵底物濃度對酶解效果影響的實驗結(jié)果相似。綜上，確定底物濃度為3%為蛋白酶的最適濃度，選取2%、3%、4%三個濃度作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計條件。

圖6 底物濃度對蛋白酶解液ACE 抑制率影響Fig.6 Effects of substrate concentration on ACE inhibition rate of protease hydrolysate

2.2.4 酶解時間對ACE 抑制率的影響 如圖7 所示，酶解時間的改變對抑制率的影響相比其他因素較弱。酶解液的ACE 抑制率隨時間的增長先穩(wěn)定升高隨后緩慢下降，酶解5 h，抑制率達(dá)到最高值71.78%±0.18%，并逐漸下降，與第6 h 的抑制率（71.01%±0.10%）相比無顯著性差異（P＞0.05）。推測是由于過長的酶解時間造成酶解程度達(dá)到極限，導(dǎo)致對多肽的過度降解，生成大量肽鏈過短的抑制肽或游離氨基酸，對其氨基酸組成及構(gòu)象造成破壞，丟失了發(fā)揮相關(guān)作用的活性位點，使ACE 抑制率下降[22]。綜上所述，將酶解時間作為響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計固定量，為了節(jié)約消耗、降低成本，選取5 h 為蛋白酶解的最適酶解時間。

圖7 時間對蛋白酶解液ACE 抑制率影響Fig.7 Effects of time on ACE inhibition rate of protease hydrolysate

2.2.5 加酶量對ACE 抑制率的影響 圖8 為加酶量對蛋白酶解液ACE 抑制率的影響，加酶量在2.0～2.5 U/mg 時，ACE 抑制率并無顯著變化，隨加酶量的增加呈上升趨勢，加酶量3.5 U/mg 時，達(dá)到最大值69.12%±0.27%，此時相對于其他加酶量都具有顯著差異（P＜0.05），當(dāng)加酶量超過3.5 U/mg，其抑制率開始下降。推測原因為加入蛋白酶的過量致使加大酶解液中活性肽水解程度，生成的高活性ACE 抑制肽被繼續(xù)水解喪失其活性導(dǎo)致ACE 抑制率下降[23]。而不同加酶量之間對抑制率的影響程度較小，所以選擇加酶量作為響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計固定量，選取3.5 U/mg 作為進(jìn)一步優(yōu)化酶解的條件。

圖8 加酶量對蛋白酶解液ACE 抑制率影響Fig.8 Effects of enzyme addition on ACE inhibition rate of protease hydrolysate

2.3 蛋白酶解工藝響應(yīng)面試驗

2.3.1 Box-Behnken 實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)2.2 中單因素實驗結(jié)果，以酶解時間（5 h）和加酶量（3.5 U/mg）為固定量，將酶解溫度（A）、pH（B）、底物濃度（C）三個對ACE 抑制率具有顯著影響的因素設(shè)定為自變量，ACE 抑制率設(shè)定為響應(yīng)值，結(jié)合Box-Behnken 的中心復(fù)合設(shè)計原理進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面試驗。優(yōu)化試驗設(shè)計17 組實驗點，實驗方案及結(jié)果如表3 所示。

表3 Box-Behnken 設(shè)計方案及ACE 抑制率的測定結(jié)果Table 3 Box Behnken design and determination of ACE inhibitory activity

2.3.2 模型建立及方差分析 對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行建立，結(jié)合Design-Expert 8.06 軟件對2.3.1 數(shù)據(jù)結(jié)果多元擬合分析后，得到回歸方程：Y=79.74-0.18A+5.15B-0.11C+0.91AB-0.58AC+0.63BC-2.46A2-5.14B2-2.23C2。

對模型做方差分析，結(jié)果見表4。該模型F值=40.96，P值＜0.0001（極顯著），失擬項P值=0.4657＞0.05（不顯著），表明所建立模型達(dá)到極顯著水平，擬合精度良好，數(shù)據(jù)可信度高，可用于此優(yōu)化設(shè)計[24]。模型決定系數(shù)R2=0.9814，校正系數(shù)R2adj=0.9574，R2Pred=0.8530，表明該模型相關(guān)性好，預(yù)測結(jié)果可以用于解釋95.74%的實驗結(jié)果，R2adj和R2Pred（R2adj-R2Pred＜0.2）兩數(shù)值均較高且差較小，因此能充分說明工藝過程。信噪比C.V.%=1.37＜10%，也說明數(shù)據(jù)擁有較高的可信度及精密度。底物濃度B 以及二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值的影響都為極顯著（P＜0.001），根據(jù)F值的大小可判斷各因素對實驗結(jié)果影響程度大小，F(xiàn)值越大表明對結(jié)果的影響越大。因此，根據(jù)各因素對ACE 抑制率影響進(jìn)行排序：底物濃度＞酶解溫度＞pH。

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface regression model

2.3.3 交互作用分析 根據(jù)所建立模型及擬合的回歸方程，結(jié)合交互影響的3D 立體響應(yīng)面圖和等高線圖，分析在固定單一因素同時中心值不變時，其他2 個因素之間的交互作用對仿刺參卵酶解液ACE 抑制率的影響。通過對3D 響應(yīng)曲面的陡峭程度及等高線形狀進(jìn)行觀察使兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度做出更直觀的反應(yīng)，3D 反應(yīng)曲面越陡峭，等高線越密集越接近橢圓[25]，表明影響越顯著，兩因素交互的作用就越強(qiáng)。

圖9 為酶解溫度（A）、底物濃度（B）、pH（C）三因素兩兩交互作用對響應(yīng)值A(chǔ)CE 抑制率影響的3D響應(yīng)面及等高線圖。如圖9A 所示，當(dāng)處于最佳酶解時間，其底物濃度處于較低水平時，反應(yīng)體系中溫度的變化對ACE 抑制率的影響并不顯著，當(dāng)酶解底物濃度水平較高時，隨溫度的增加，響應(yīng)值A(chǔ)CE 抑制率呈現(xiàn)先升高隨后降低的趨勢；固定溫度，響應(yīng)值隨底物濃度的增加呈現(xiàn)先升高后緩慢降低或趨于平穩(wěn)的趨勢。底物濃度變化的反應(yīng)曲面陡峭程度大于酶解溫度，表明酶解底物濃度對響應(yīng)值的影響更為明顯。由圖9B 可知，當(dāng)處于最佳底物濃度，響應(yīng)值隨著pH 和酶解溫度的同時增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，反應(yīng)曲面的陡峭程度相似。由圖9C 可知，當(dāng)處于最佳酶解溫度，底物濃度的水平較低時反應(yīng)體系的pH 對響應(yīng)值的影響并不顯著，底物濃度水平較高時呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，固定pH，響應(yīng)值隨底物濃度的增加呈現(xiàn)先升高后緩慢減小或趨于平穩(wěn)的趨勢。根據(jù)圖9 中各等高線圖中橢圓程度的大小結(jié)合表4 中交互項AB、AC、BC 的F值大小，對比判斷出酶解溫度和底物濃度的交互作用相對其他兩組對ACE 抑制率的影響更大。

圖9 三因素交互作用對ACE 抑制率影響的3D 響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 3D response surface and contour map of the effects of three factors interaction on ACE inhibition rate

2.3.4 工藝優(yōu)化及模型驗證 通過Design-Expert 8.06 處理分析，仿刺參卵ACE 抑制肽的最佳制備工藝為：酶解溫度65.26 ℃、底物濃度3.51%、酶解pH9.02，在此條件下，軟件模型預(yù)測的ACE 抑制率為81.04%?？紤]到實驗操作的可控性，將最佳的酶解工藝調(diào)整為酶解溫度65 ℃、底物濃度3.5%、pH9.0、加酶量3.5 U/mg、酶解時間5 h。在該條件基礎(chǔ)上進(jìn)行3 次重復(fù)實驗驗證，ACE 抑制率為80.65%±0.52%，與模型的預(yù)測值高度接近。對工藝優(yōu)化后蛋白酶解產(chǎn)物的IC50值計算，由圖10 所示，經(jīng)工藝優(yōu)化后的仿刺參卵酶解產(chǎn)物其IC50值（0.59±0.03 mg/mL）最小，且與未經(jīng)優(yōu)化的酶解產(chǎn)物IC50值（0.65±0.02 mg/mL）具有顯著性差異（P＜0.05）。證明經(jīng)工藝優(yōu)化后其蛋白酶解物ACE 抑制活性具有顯著性提升，該回歸模型實用性較高并具有高擬合度，可用于對仿刺參卵ACE 抑制肽的制備。

圖10 工藝優(yōu)化前后酶解產(chǎn)物IC50 值Fig.10 IC50 values of enzymatic products before and after process optimization

2.4 工藝優(yōu)化酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布測定

通過高效凝膠過濾色譜法測定分子量分布實驗中，由于分子量不同的多肽在色譜圖中的保留時間不同，因此利用洗脫體積與分子量對數(shù)（lgMw）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而通過GPC 軟件計算酶解液中多肽的分子量分布范圍[26]。標(biāo)準(zhǔn)線性擬合曲線為Y=0.005X3-0.2364X2+3.4398X-11.758，R2為0.998，混合標(biāo)準(zhǔn)品隨洗脫時間的分子量分布色譜圖及線性擬合曲線如圖11 所示。

圖11 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及分子量校正曲線Fig.11 Chromatogram and molecular weight correction curve of mixed standard

通過對多肽分子量分布范圍測定，不僅能反映出蛋白的水解程度，同時也可作為分離制備高活性多肽的參照條件之一[27]。工藝優(yōu)化酶解產(chǎn)物采用與混合標(biāo)品相同的檢測條件，測定其分子量分布，色譜圖及分子量分布表如圖12 和表5 所示。由圖可知，酶解產(chǎn)物的出峰時間大多都集中在14～22 min，利用GPC 軟件處理數(shù)據(jù)并結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出：酶解產(chǎn)物大部分多肽分子量分布范圍為＜3000 Da，占總含量的98.37%，其中1000～3000 Da 占比9.50%，小于1000 Da 占比88.87%，小于200 Da 以下的寡肽、游離氨基酸以及酶解過度的氨基酸殘基占比25.45%。結(jié)果表明，經(jīng)過工藝優(yōu)化后，酶解產(chǎn)物水解較充分，蛋白大分子大多被水解為1000 Da 以下易被腸道吸收的小分子肽，目前已知并被證明活性的ACE 抑制肽大部分為分子量較小的短肽[28]。該結(jié)果為超濾膜分離選擇組分提供了數(shù)據(jù)支撐。

圖12 酶解產(chǎn)物色譜圖Fig.12 Chromatogram of enzymatic hydrolysis product

表5 酶解產(chǎn)物分子量分布Table 5 Molecular weight distribution

2.5 超濾膜分離

超濾技術(shù)是以相對分子質(zhì)量大小為條件，通過采用不同孔徑的超濾膜，依靠濾膜前后不同壓力分離不同組分的膜分離技術(shù)[29]。為確定ACE 抑制肽的作用效果與其分子量相關(guān)性，制備較高活性的ACE 抑制肽，根據(jù)酶解產(chǎn)物分子量分布測定結(jié)果，采用截留量為3000 Da 超濾膜將仿刺參卵酶解液分為2 個組分，即截留液和濾過液組分，并在同一濃度梯度下與經(jīng)優(yōu)化工藝后制備的酶解產(chǎn)物進(jìn)行比較分析。圖13 為同一濃度梯度下工藝優(yōu)化酶解產(chǎn)物及超濾組分的ACE 抑制率，由圖13 可知，三個不同組分的ACE 抑制率與其濃度均呈現(xiàn)正相關(guān)，且低聚肽組分的ACE 抑制率在各濃度都高于其他兩組分。圖14 為各組分ACE 抑制率的IC50值，低聚肽組分ACE 抑制率的IC50值（0.30±0.03 mg/mL）最小，擁有較強(qiáng)的ACE 抑制活性，且顯著（P＜0.05）強(qiáng)于截留液組分（IC50=1.17±0.03 mg/mL）及經(jīng)工藝優(yōu)化后的酶解產(chǎn)物組分（IC50=0.59±0.03 mg/mL）。目前已知被證明活性的ACE 抑制肽中大部分為分子量較小的短肽[30]。李文欣等[7]發(fā)現(xiàn)，海參性腺酶解物超濾后分子量較低的組分ACE 抑制活性（IC50=1.37 mg/mL）同樣顯著強(qiáng)于其他組分。因此，具有ACE 抑制活性的蛋白多肽多數(shù)集中于低聚肽組分中，并且超濾技術(shù)有助于對低分子量多肽的富集并提高酶解物的ACE 抑制活性，可用作分離純化制備較高活性單體肽。

圖13 不同濃度酶解物及超濾組分的ACE 抑制率Fig.13 ACE inhibitory activities of enzymatic hydrolysates and ultrafiltration components at different concentrations

圖14 酶解物及超濾組分ACE 抑制活性的IC50 值Fig.14 IC50 values of ACE inhibitory activities of enzymatic hydrolysates and ultrafiltration components

3 結(jié)論

堿性蛋白酶水解仿刺參不同部位所得蛋白酶解物中，仿刺參卵具有更好的ACE 抑制活性（IC50=0.65±0.02 mg/mL）。以ACE 抑制率為評價指標(biāo)，通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定最佳的酶解制備工藝為：酶解時間5 h，加酶量3.5 U/mg，酶解溫度65.26 ℃，底物濃度3.51%，酶解pH9.02，在該條件下仿刺參卵的ACE 抑制率可達(dá)80.65%±0.52%，與預(yù)測值接近。酶解產(chǎn)物的分子量分布主要集中在3000 Da 以下，占比98.37%，超濾膜分離所得低聚肽組分擁有較強(qiáng)的ACE 抑制活性（IC50=0.30±0.03 mg/mL），對于經(jīng)工藝優(yōu)化后的酶解產(chǎn)物有了顯著提升（P＜0.05）。以上研究結(jié)果說明了仿刺參卵制備功能活性肽的可行性，對仿刺參副產(chǎn)物的高質(zhì)化利用與功能活性肽的開發(fā)提供理論依據(jù)，未來可進(jìn)一步開展仿刺參卵蛋白高活性單肽的分離制備及作用機(jī)制研究等方面的工作。

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