曾 靜，郭建軍，王 通，袁 林

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096）

III 型普魯蘭水解酶（EC 3.2.1.1/41）能夠同時(shí)水解淀粉中α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵，是具有α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的雙功能酶[1-4]。III 型普魯蘭水解酶在淀粉加工工業(yè)、烘焙食品工業(yè)等工業(yè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。其中，嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶在淀粉酶法制糖工業(yè)具有巨大的應(yīng)用潛力[5-6]。嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶可在淀粉酶法制糖工業(yè)的液化條件下將淀粉完全酶解為淀粉糖，使淀粉酶法制糖工藝的液化過程和糖化過程合二為一，大大簡(jiǎn)化淀粉酶法制糖工藝，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。來源于極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensis的嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶（TKPUL）是目前已報(bào)道的水解活性最高的III 型普魯蘭水解酶[7-10]。TK-PUL 屬于糖苷水解酶類的第13 家族（GH13_20），具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高溫活性，并且其熱穩(wěn)定性和高溫活性均不依賴于Ca2+，可以完全水解淀粉為淀粉糖。已有研究表明，將TK-PUL以1 mg/g 淀粉干物質(zhì)的使用濃度加入30%玉米淀粉乳中，100 ℃反應(yīng)10 min，然后于90 ℃反應(yīng)96 h后，玉米淀粉乳完全轉(zhuǎn)化為淀粉糖，產(chǎn)物中DP1～DP7 所占比例為80.5%，DP7+所占比例為8.3%，DPn所占比例為11.2%[9]。

TK-PUL 已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。重組TK-PUL 于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，其主要位于重組大腸桿菌的胞內(nèi)可溶成分中，從重組大腸桿菌獲取TK-PUL 的純化過程復(fù)雜[8]。此外大腸桿菌的外膜成分含有脂多糖，具有一定的致病性。重組TK-PUL 于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)，重組枯草芽孢桿菌的胞外酶活僅為29.10 U/mL[11]。目前為止，TK-PUL 的異源表達(dá)策略難以滿足工業(yè)應(yīng)用要求。為滿足TK-PUL 的工業(yè)應(yīng)用要求，需選用其他合適的表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)TK-PUL 的異源高效分泌表達(dá)。

短小芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）具有卓越的蛋白質(zhì)合成與分泌能力，其胞外蛋白質(zhì)濃度可達(dá)30 g/L，并且其胞外蛋白酶活性低[12-14]。因此短小芽孢桿菌作為優(yōu)良的異源表達(dá)系統(tǒng)被用于各種目的蛋白質(zhì)的異源分泌表達(dá)，比如來源于Bacillus megaterium的α-淀粉酶、來源于Pyrococcus horikoshii的纖維素酶、來源于Bacillus deramifcans的普魯蘭酶等[14]。此外，已有較多研究闡述了一系列提高目的蛋白在短小芽孢桿菌中重組表達(dá)水平的策略，比如優(yōu)化基因表達(dá)啟動(dòng)子、優(yōu)化分泌表達(dá)信號(hào)肽、優(yōu)化目的蛋白質(zhì)序列、提高表達(dá)載體的穩(wěn)定性和拷貝數(shù)、共表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)以及發(fā)酵優(yōu)化等[14]。本研究擬將嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶（TK-PUL）于短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源分泌表達(dá)，并探索通過共表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)以及發(fā)酵優(yōu)化實(shí)現(xiàn)TK-PUL 在短小芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)，從而為TK-PUL 的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，并為其他目的蛋白在短小芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)提供了參考策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3、大腸桿菌Escherichia coliJM109、重組載體pBE-S-Atkp、質(zhì)粒pNCMO2、質(zhì)粒pNY326 由本實(shí)驗(yàn)室保存；LB 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g 環(huán)凱生物科技有限公司；TM 培養(yǎng)基（1 L，pH7.0）：10 g 多聚蛋白胨、5 g 牛肉粉、2 g 酵母提取物、10 g 葡萄糖、0.01 g FeSO4·7H2O、0.01 g MnSO4·4H2O、0.001 g ZnSO4·7H2O 上海生工生物工程股份有限公司；KOD-Plus-neo DNA 聚合酶 日本Toyobo 公司；DNA 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國(guó)Fermentase 公司；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A.美國(guó)Omega Bio-tek 公司；In-Fusion? HD Cloning kit 日本Takara 公司；Ni-NTA 親和層析柱 德國(guó)QIAGEN公司；Bradford 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Mastercycler gradient 型PCR 儀 美國(guó)Eppendorf 公司；TY04S-3C 型凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC 型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；iMark 酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh的構(gòu)建 基于TKPUL 的編碼基因tkpul的堿基序列，設(shè)計(jì)引物F1 和R1（表1），以重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp為模板，擴(kuò)增基因tkpul。PCR 擴(kuò)增條件為：98 ℃ 變性5 min；98 ℃變性 20 s，60 ℃ 退火20 s，74 ℃ 延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；74 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和XbaI 雙酶切，連接至經(jīng)同樣雙酶切處理的載體pNCMO2，構(gòu)建重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

1.2.2 共胞外分子伴侶蛋白PrsA 的表達(dá)載體的構(gòu)建從NCBI 網(wǎng)站搜索來源于芽孢桿菌屬的胞外分子伴侶蛋白的蛋白質(zhì)序列和對(duì)應(yīng)的基因序列：來源于短小芽孢桿菌B.choshinensis的PrsABc（蛋白ID：WP_203357373.1）、來源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilus的PrsAGs（蛋白ID：ALA709 49.1）、來源于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens的PrsABa（蛋白ID：ASF28240.1）、來源于地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的PrsABl（蛋白ID：AOP14207.1）、來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的PrsABs（蛋白ID：AIY96590.1）。以共表達(dá)分子伴侶蛋白PrsABc的表達(dá)載體為例，采用化學(xué)合成方法合成由來源于質(zhì)粒pNY326 的P5 啟動(dòng)子和PrsABc編碼基因組成的“P5+PrsABc”堿基序列，根據(jù)“P5+PrsABc”堿基序列和In-Fusion? HD Cloning kit 的說明書，設(shè)計(jì)引物F2 和BcR（表1），以合成的“P5+PrsABc”堿基序列為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得“P5+PrsABc”堿基序列的線性化片段。同時(shí)根據(jù)In-Fusion? HD Cloning kit 的說明書和重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh的堿基序列，設(shè)計(jì)引物F3 和R3（表1），以重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)重組載體pNCMO2-tkpulh的線性化。采用In-Fusion? HD Cloning kit 連接線性化“P5+PrsABc”堿基序列和線性化重組載體pNCMO2-tkpulh，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體平板上，于37 ℃過夜培養(yǎng)。提取轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh/prsabc，將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。載體pNCMO2、重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh以及重組質(zhì)粒pNCMO2-tkpulh/prsa的質(zhì)粒圖譜如圖1 所示。其他共表達(dá)分子伴侶蛋白PrsA 的重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照如上構(gòu)建方法。

圖1 重組質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of recombinant plamids

1.2.3 重組短小芽孢桿菌的構(gòu)建與發(fā)酵培養(yǎng) 采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入B.choshinensisHPD1-SP3[15]，獲得重組短小芽孢桿菌。挑取轉(zhuǎn)化子單克隆接種于含50 μg/mL 新霉素的10 mL TM 培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)12 h，獲得種子液。取0.5 mL 種子液，轉(zhuǎn)接入50 mL TM 培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，于37 ℃、200 r/min，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)60 h，獲得重組短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.2.4 生物量的測(cè)定 取1 mL 重組短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液，于12000×g 離心5 min，收集菌體沉淀，并水洗三次后，于105 ℃烘干至重量不變，再將樣品進(jìn)行稱重，即為細(xì)胞干重（dry cell weight，DCW）。

1.2.5 重組TK-PUL 的純化與酶活力測(cè)定 待發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將重組短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液于12000×g 離心5 min，收集發(fā)酵液上清，即為發(fā)酵液上清樣品。采用適量50 mmol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid，MES），pH6.5緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細(xì)胞。超聲波細(xì)胞破碎儀的參數(shù)設(shè)置為超聲波功率為25%、超聲波破碎時(shí)間3 s、間歇6 s。超聲波處理菌體細(xì)胞至菌體懸液變?yōu)榫坏娜芤?，即為菌體沉淀處理樣品。

采用Ni-NTA 親和層析柱純化發(fā)酵液上清樣品中重組TK-PUL。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[16]檢測(cè)重組TK-PUL 的純度，根據(jù)蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE 圖譜上所呈現(xiàn)的帶型特點(diǎn)來判斷重組TK-PUL 的純度。采用活性印記分析[17]檢測(cè)TK-PUL 的α-淀粉酶酶活，并采用Bradford 法測(cè)定重組TK-PUL 的濃度[16]。

以1%（m/V）g/100 mL 可溶性淀粉為底物，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)液上清樣品、菌體沉淀處理樣品或純化后重組TK-PUL 的α-淀粉酶活性。α-淀粉酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。酶活力單位（U）定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol 還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）[18]。

1.2.6 重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 在TM 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上相應(yīng)地改變碳源、氮源以及培養(yǎng)基添加物（MgCl2·6H2O 或脯氨酸）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。選用不同碳源（甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉）替代TM 培養(yǎng)基中碳源（10 g/L 葡萄糖），不同氮源（牛肉浸粉、多聚蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、棉籽粉、大豆蛋白胨、硫酸銨、氯化銨）替代TM 培養(yǎng)基中氮源（10 g 多聚蛋白胨、5 g 牛肉粉、2 g酵母提取物），分別添加質(zhì)量濃度為0～15 g/L MgCl2·6H2O 或脯氨酸，研究不同碳源、氮源和培養(yǎng)基添加物（MgCl2·6H2O 或脯氨酸）對(duì)重組短小芽孢桿菌發(fā)酵生物量及產(chǎn)酶的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）進(jìn)一步優(yōu)化重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。選取發(fā)酵培養(yǎng)基中影響重組短小芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平的4 個(gè)因素葡萄糖、酵母提取物、MgCl2·6H2O、脯氨酸為考察對(duì)象，以重組短小芽孢桿菌發(fā)酵液上清的酶活（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 10.0.7 軟件設(shè)計(jì)4 因素3 水平的中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Response surface test factor level design

1.2.7 重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化 在“1.2.3”重組短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，選擇不同的發(fā)酵培養(yǎng)溫度（25、28、30、33、35、37 ℃）、不同的初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）以及不同的培養(yǎng)時(shí)間（48、54、60、66、72、78 h），分別培養(yǎng)重組短小芽孢桿菌，研究不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)重組短小芽孢桿菌發(fā)酵生物量及產(chǎn)酶的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用軟件SigmaPlot 14.0 和SPSS 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。采用軟件Design-Expert 10.0.7 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及試驗(yàn)數(shù)據(jù)的響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組TK-PUL 于短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的分泌表達(dá)

短小芽孢桿菌B.choshinensis表達(dá)系統(tǒng)具有較強(qiáng)分泌外源蛋白的能力[12-13]。將重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh于37 ℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，其搖瓶發(fā)酵曲線如圖2 所示。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)48 h 時(shí)，重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh的細(xì)胞干重達(dá)到最大值；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)60 h 時(shí)，其胞外α-淀粉酶活性達(dá)到最大值。待重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)60 h 后，將發(fā)酵培養(yǎng)液于12000×g 離心5 min，分別收集發(fā)酵培養(yǎng)液上清和菌體沉淀。分別測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)液上清和菌體沉淀處理樣品的α-淀粉酶活性，結(jié)果顯示重組TKPUL 主要位于發(fā)酵培養(yǎng)液上清中，發(fā)酵培養(yǎng)液上清樣品的比酶活力達(dá)75.24 U/mL，菌體沉淀處理樣品的比酶活力僅為1.38 U/mL。

圖2 重組菌株B.choshinensis HPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh 的搖瓶發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of B.choshinensis HPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh in shake flask

分別對(duì)重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2 和重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh的發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)和α-淀粉酶活性印記分析，結(jié)果如圖3 所示。重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2 的發(fā)酵液上清未檢測(cè)到α-淀粉酶活性，而重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh的發(fā)酵液上清檢測(cè)到明顯的α-淀粉酶活性。采用Ni2+親和層析純化重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh發(fā)酵液上清中目的蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)和和α-淀粉酶活性印記分析結(jié)果顯示重組TKPUL 的分子量約為84 kDa（圖3），其大小與TK-PUL的理論分子量相符[7-8]。

圖3 重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 檢測(cè)圖以及活性印記分析Fig.3 SDS-PAGE and activity staining analysis of recombinant proteins

2.2 共表達(dá)胞外分子伴侶蛋白PrsA 對(duì)TK-PUL 分泌表達(dá)的影響

來源于芽孢桿菌屬的胞外分子伴侶蛋白PrsA是常見的蛋白質(zhì)折疊輔助因子[19-20]，其通過脂蛋白信號(hào)肽錨定在細(xì)胞膜的外側(cè)，可輔助跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)后的目的蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的間隙中正確折疊成具有生物活性的空間結(jié)構(gòu)[21-23]。本研究選擇來源于B.choshinensis的PrsABc、來源于G.stearothermophilus的PrsAGs、來源于B.amyloliquefaciens的PrsABa、來源于B.licheniformis的PrsABl以及來源于B.subtilis的PrsABs作為胞外分子伴侶蛋白的考察對(duì)象，考察了共表達(dá)不同芽孢桿菌來源的胞外分子伴侶蛋白PrsA 對(duì)TK-PUL 于短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4 所示。經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，共表達(dá)胞外分子伴侶蛋白PrsABa最有利于TK-PUL的分泌表達(dá)。其對(duì)應(yīng)的重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa搖瓶發(fā)酵的胞外α-淀粉酶比酶活力為98.79 U/mL，提高了0.31 倍。

圖4 共表達(dá)胞外分子伴侶蛋白對(duì)TK-PUL 分泌表達(dá)的影響Fig.4 Effects of extracytoplasmic molecular chaperone co-express ing on the secretory expression of recombinant TK-PUL

已有研究表明，在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)分子伴侶蛋白PrsA 可有效提高PrsA 依賴型目的蛋白的分泌表達(dá)水平[23-24]。例如，Chen 等[24]通過在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)PrsABs，將α-淀粉酶AmyL 的分泌表達(dá)水平提高了2.2 倍。另外，不同來源的分子伴侶蛋白PrsA 具有一定的底物特異性。共表達(dá)分子伴侶蛋白PrsA 可能提高、降低或不影響目的蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)量。Yao 等[21]研究結(jié)果表明，共表達(dá)PrsABs和PrsABa有利于提高α-淀粉酶AmyS 在短小芽孢桿菌中的胞外表達(dá)水平，而共表達(dá)PrsABc和PrsABl導(dǎo)致α-淀粉酶AmyS 的胞外表達(dá)水平下降。本研究結(jié)果表明，在短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)分子伴侶蛋白PrsABa、PrsABl、PrsABs均不同程度地促進(jìn)了TK-PUL 的分泌表達(dá)，共表達(dá)PrsABc不影響TK-PUL 的分泌表達(dá)，而共表達(dá)PrsAGs導(dǎo)致TK-PUL 的分泌表達(dá)水平下降。本研究中共表達(dá)PrsABa最有利于TK-PUL 的異源分泌表達(dá)。Yao 等[21]研究結(jié)果以及Quesada-Ganuza 等[23]研究結(jié)果均表明，共表達(dá)PrsABa可以不同程度提高各種來源的α-淀粉酶的異源分泌表達(dá)水平。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測(cè)來源于B.amyloliquefaciens的胞外分子伴侶蛋白PrsABa具有較弱的底物特異性，在芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)PrsABa有利于促進(jìn)多種目的蛋白質(zhì)的異源分泌表達(dá)。

2.3 重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基的成分會(huì)影響重組菌株的生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶水平。本研究中重組短小芽孢桿菌所采用的TM 培養(yǎng)基包括碳源（10 g/L 葡萄糖）、氮源（10 g/L多聚蛋白胨、5 g/L 牛肉粉、2 g/L 酵母粉）以及金屬離子等。碳源和氮源對(duì)重組短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成具有非常重要的影響，合適的碳源和氮源有利于促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成分泌[25-26]。另外，發(fā)酵培養(yǎng)基中金屬離子和其他重要組成部分如脯氨酸也會(huì)影響重組短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成[25-26]。

本研究在TM 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上相應(yīng)地改變碳源、氮源以及培養(yǎng)基添加物（MgCl2·6H2O 或脯氨酸）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果如圖5 所示。由圖5A 和圖5B 可知，采用葡萄糖作為碳源時(shí)，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量以及產(chǎn)酶水平最高。并且當(dāng)葡萄糖的濃度為20 g/L 時(shí)，發(fā)酵生物量達(dá)到4.88 g/L，發(fā)酵液上清的酶活達(dá)到105.64 U/mL。圖5C 和圖5D 顯示選用酵母提取物作為氮源時(shí)，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量以及產(chǎn)酶水平最高。當(dāng)酵母提取物的濃度為22 g/L 時(shí)，發(fā)酵生物量達(dá)到5.67 g/L，發(fā)酵液上清的酶活達(dá)到127.84 U/mL。圖5E 顯示向培養(yǎng)基中添加12 g/L MgCl2·6H2O 時(shí)，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量以及產(chǎn)酶水平最高，發(fā)酵生物量達(dá)到5.02 g/L，發(fā)酵液上清的酶活達(dá)到117.19 U/mL。在短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，Mg2+可通過抑制P2 啟動(dòng)子的活性，降低目的蛋白質(zhì)前體的合成，從而提供足夠的時(shí)間使目的蛋白質(zhì)前體折疊成為具有正確分子結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)。例如，Zou 等[27]將來源于B.deramificans的普魯蘭酶于短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行分泌表達(dá)。當(dāng)表達(dá)B.deramificans普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加12 g/L MgCl2·6H2O 時(shí)，發(fā)酵液中B.deramificans普魯蘭酶的表達(dá)量降低了30.4%，而發(fā)酵液上清的普魯蘭酶活性提高了5.4 倍。即重組短小芽孢桿菌表達(dá)的B.deramificans普魯蘭酶中，更高比例的B.deramificans普魯蘭酶前體折疊成為具有正確分子結(jié)構(gòu)的活性普魯蘭酶。圖5F 顯示向培養(yǎng)基中添加9 g/L 脯氨酸時(shí)，重組短小芽孢桿菌的產(chǎn)酶水平最高，此時(shí)發(fā)酵生物量達(dá)到5.99 g/L，發(fā)酵液上清的酶活達(dá)到168.79 U/mL。脯氨酸作為發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成部分，有利于維持短小芽孢桿菌細(xì)胞的完整性和活力，提高異源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)水平[17,28]。Li 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過向短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加脯氨酸來提高異源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)水平具有普遍適用性。

圖5 碳源、氮源和培養(yǎng)基添加物對(duì)重組短小芽孢桿菌發(fā)酵生物量及產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of carbon sources,nitrogen sources and medium additions on DCW and enzyme production of recombinant B.choshinensis

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵培養(yǎng)基中影響重組短小芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平的4 個(gè)因素葡萄糖、酵母提取物、MgCl2·6H2O、脯氨酸為考察對(duì)象，以重組短小芽孢桿菌發(fā)酵液上清的酶活（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 10.0.7 軟件設(shè)計(jì)4 因素3 水平的中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表2 所示，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表3。采用Design-Expert 10.0.7 軟件對(duì)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合分析，響應(yīng)面試驗(yàn)二次模型的方差分析結(jié)果如表4 所示。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experimental

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)二次模型的方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results for the response surface quadratic model

表4 中方差分析結(jié)果顯示：模型P值＜0.0001，這表示方程模型達(dá)到極顯著；失擬P值=0.8241，不顯著，說明該模型擬合程度好，可靠性高。因此該二次多項(xiàng)回歸模型成立，應(yīng)用此模型可以預(yù)測(cè)重組短小芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平以及優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)AB、AD、CD 以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶水平的影響達(dá)到極顯著程度（P＜0.01），一次項(xiàng)D 以及交互項(xiàng)AC、BD 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶水平的影響達(dá)到顯著程度（P＜0.05）。此外，該二次多項(xiàng)回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.9991，說明該方程模型與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果擬合良好，試驗(yàn)誤差小。根據(jù)表4，去掉對(duì)反應(yīng)的影響不顯著的試驗(yàn)因素，獲得描述顯著試驗(yàn)因素與發(fā)酵液上清酶活（Y）之間關(guān)系的二次多項(xiàng)式方程（Y=181.11-1.80A-9.00B+0.72D+1.69AB+1.59AC+3.97AD+1.33BD+3.19CD-27.23A2-41.77B2-30.39C2-28.56D2）。以上二次多項(xiàng)回歸模型中二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，說明該方程模型有極大值。

基于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：19.65 g/L 葡萄糖、21.46 g/L 酵母提取物、12.01 g/L MgCl2·6H2O、9.02 g/L 脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·4H2O、0.001 g/L ZnSO4·7H2O。在此條件下，重組短小芽孢桿菌發(fā)酵液上清的酶活為181.64 U/mL。采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得重組短小芽孢桿菌發(fā)酵液上清的酶活分別為180.16、182.47、180.39 U/mL，平均值為181.01±1.27 U/mL，與該條件下的理論值的相對(duì)誤差值小于1%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的制備工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。重組短小芽孢桿菌于最佳發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵上清液酶活相對(duì)于TM 培養(yǎng)基提高了1.41 倍。

2.4 重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)溫度、發(fā)酵初始pH 和發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間也是影響重組短小芽孢桿菌發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平的重要因素[29-30]。本研究也探究了發(fā)酵培養(yǎng)溫度、發(fā)酵初始及培養(yǎng)時(shí)間pH 對(duì)重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平的影響，結(jié)果如圖6 所示。由圖6A 可知，在25～35 ℃范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵培養(yǎng)溫度的升高，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平逐漸升高；溫度大于35 ℃后，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平下降。這表明35 ℃更適于重組短小芽孢桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，因此選取35 ℃為最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度。圖6B 顯示，隨著培養(yǎng)基pH 的增加，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)。發(fā)酵初始pH 為7.0 時(shí)，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平最高。這表明pH7.0 更適于重組短小芽孢桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，因此選取7.0 為最適發(fā)酵初始pH。圖6C顯示，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間由48 h 延長(zhǎng)至66 h 時(shí)，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平持續(xù)增加；待發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間超過66 h 后，重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵生物量和產(chǎn)酶水平略有降低。即隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，受到碳源、氮源等能源物質(zhì)的限制，重組短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受限，其生物量和產(chǎn)酶水平不會(huì)一直持續(xù)增加。此外，在重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵后期，細(xì)胞自身的裂解可能導(dǎo)致其生物量降低，并且其所產(chǎn)的胞外外源酶可能受其自身胞外蛋白酶的降解而導(dǎo)致其產(chǎn)量下降[21]。本研究顯示，重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/ pNCMO2-tkpulh/prsaBa采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基于35 ℃、pH7.0下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)66 h 后，其細(xì)胞干重為5.69 g/L，發(fā)酵上清液酶活達(dá)到192.68 U/mL。

圖6 培養(yǎng)溫度、初始pH 和時(shí)間對(duì)重組短小芽孢桿菌發(fā)酵生物量及產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of cultivation temperature,pH and time on DCW and enzyme production of recombinant B.choshinensis

3 結(jié)論

本研究通過共表達(dá)分子伴侶蛋白提高了嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶TK-PUL 在短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)水平，并進(jìn)一步優(yōu)化了重組短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。研究結(jié)果表明，通過共表達(dá)來源于B.amyloliquefaciens的胞外分子伴侶蛋白PrsABa，重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa的胞外酶活達(dá)到98.79 U/mL，提高了0.31 倍。重組短小芽孢桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：19.65 g/L 葡萄糖、21.46 g/L 酵母提取物、12.01 g/L MgCl2·6H2O、9.02 g/L 脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·4H2O、0.001 g/L ZnSO4·7H2O。重組短小芽孢桿菌的最佳發(fā)酵溫度為35 ℃，最佳起始發(fā)酵pH 為7.0，最佳培養(yǎng)時(shí)間為66 h。重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基于35 ℃、pH7.0 下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)66 h 后，其細(xì)胞干重為5.69 g/L，發(fā)酵上清液酶活達(dá)到192.68 U/mL，提高了1.56 倍。本研究通過共表達(dá)分子伴侶蛋白和發(fā)酵優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了TK-PUL 在短小芽孢桿菌的高效分泌表達(dá)，為TK-PUL 的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，并為其他目的蛋白在短小芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)提供了參考策略。

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