陳麗萍 籍強(qiáng) 陳艷紅 史永興 馮平 林衛(wèi)佳 項(xiàng)保利 趙建清

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的類型,占所有肺癌的85%以上,據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)道,2020年全球肺癌新發(fā)病例2206771例,死亡1796144例,我國(guó)肺癌新發(fā)病例815563例,死亡714699例,發(fā)病率和死亡率均居全球首位[1]。尋找相關(guān)標(biāo)志物評(píng)估NSCLC患者臨床預(yù)后非常重要。研究表明,環(huán)狀核糖核酸(circular ribonucleic acid,circRNA)能通過(guò)調(diào)控多種靶基因在NSCLC進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[2]。桿狀病毒IAP重復(fù)序列6(baculoviral IAP repeat containing 6,BIRC6)是新近發(fā)現(xiàn)的一種circRNA,研究報(bào)道circBIRC6與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后有關(guān)[3]。同時(shí)有學(xué)者指出,在NSCLC中異常表達(dá),并與肺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展密切相關(guān)[4]。β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白2(amyloid beta precursor protein binding protein 2,APPBP2)是一種膜內(nèi)在蛋白,能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)和/或加工淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5]。相關(guān)研究指出,APPBP2與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)[6]。本研究擬探討NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2表達(dá)及臨床預(yù)后意義,為促進(jìn)NSCLC患者預(yù)后提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年6月～2020年1月90例在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除的NSCLC組織及癌旁組織(距離癌組織≥3cm),女25例、男65例;年齡范圍27～75歲,平均(60.47±8.36)歲;40例吸煙;病理類型:29例腺癌、53例鱗癌、8例腺鱗癌;表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變:陽(yáng)性46例、陰性44例;腫瘤大小:≥5cm的患者為17例、<5cm的患者為73例;分化程度:31例低分化、59例中高分化;TNM分期[7]:14例Ⅰ期、29例Ⅱ期、47例Ⅲ期;45例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理檢查確診為NSCLC。(2)接受根治性或姑息性切除。(3)患者或家屬簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非初診或入院前已接受抗腫瘤治療。(2)不可手術(shù)切除或術(shù)前接受化療。(3)合并其他肺部疾病。(4)合并急慢性感染。(5)合并其他部位惡性腫瘤。(6)不能耐受手術(shù)。(7)臨床或隨訪資料不完整。(8)合并自身免疫性疾病。(9)年齡<18歲。(10)合并精神疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(W2023041)。

二、方法

使用總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取試劑盒(試劑盒購(gòu)自江西艾博因生物科技有限公司,貨號(hào):IBIO-C1764)從NSCLC組織及癌旁組織中提取總RNA,紫外分光光度計(jì)(儀器購(gòu)自上海譜元儀器有限公司,型號(hào):Alpha-1860Plus)驗(yàn)證RNA純度和完整性合格后,使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司,貨號(hào):RR036A)將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)(儀器購(gòu)自賽默飛世爾科技公司,型號(hào):7500 Fast)并按照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào):RFT164-JMA)說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系:單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄液1μL、2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、去離子水7μL,總體積20 μL;熱循環(huán)參數(shù):先95℃預(yù)變性5min,然后循環(huán)40次94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s。收集熒光信號(hào),通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算組織中circBIRC6、APPBP2相對(duì)表達(dá)量。引物序列由北京擎科生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)和合成:circBIRC6上游引物:5′-CCACAGATACAAGTGACACTGC-3′、下游引物:5′-CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG-3′;APPBP2上游引物:5′-CGCT-GTCGTGGACAACTACAT-3′、下游引物:5′-ATAAGCG-TCCCTGTTGGTAAAG-3′;內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

三、隨訪和分組

通過(guò)電話或門診方式對(duì)NSCLC患者隨訪3年(3～6個(gè)月/次),隨訪終止事件為患者死亡或隨訪終點(diǎn)時(shí)間(2023年1月),統(tǒng)計(jì)3年總生存率。根據(jù)NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)均值分為高/低表達(dá)組。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NSCLC組織和癌旁組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)比較

NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 NSCLC組織和癌旁組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)比較

二、NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示,NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.817,P<0.001)(見(jiàn)圖1)。

圖1 NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性圖

三、circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC患者不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)比較有差異(P<0.05),不同性別、年齡、吸煙、病理類型、EGFR基因突變、腫瘤大小組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)比較無(wú)差異(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

四、不同EGFR基因突變、TNM分期和circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)與NSCLC患者總生存率的關(guān)系

隨訪3年,90例NSCLC患者3年總生存率為55.56%(50/90)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,EGFR基因突變陽(yáng)性(46例)總生存率為50.00%(23/46)與EGFR基因突變陰性(44例)的61.36%(27/44)比較無(wú)差異(Log-rank χ2=0.824,P=0.364,圖2A)。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(43例)NSCLC患者總生存率為79.07%(34/43)高于Ⅲ期(47例)NSCLC患者的34.04%(16/47);(Log-rank χ2=15.005,P<0.001,圖2B)。circBIRC6高表達(dá)組(≥10.97,46例)總生存率為45.65%(21/46)低于低表達(dá)組(<10.97,44例)的65.91%(29/44);APPBP2 mRNA高表達(dá)組(≥2.48,45例)總生存率為46.67%(21/45)低于低表達(dá)組(<2.48,45例)的64.44%(29/45)(Log-rank χ2=5.203、4.718,P=0.023、0.030,圖2C-D)。

圖2 NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線A:EGFR基因突變陽(yáng)性/陰性NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線;B:不同分期NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線;C:circBIRC6高/低表達(dá)NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線;D:APPBP2 mRNA高/低表達(dá)NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線

五、NSCLC患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

將失訪患者排除,以隨訪時(shí)間為時(shí)間變量,性別(男/女=1/0)、年齡(≥60歲/<60歲=1/0)、吸煙(是/否=1/0)、病理類型(腺鱗癌/鱗癌/腺癌=3/2/1)、EGFR基因突變(陽(yáng)性/陰性=1/0)、腫瘤大小(≥5cm/<5cm=1/0)、分化程度(低分化/中高分化=1/0)、TNM分期(Ⅲ期/Ⅰ～Ⅱ期=1/0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是/否=1/0)、circBIRC6(≥10.97/<10.97=1/0)、APPBP2 mRNA(≥2.48/<2.48=1/0)為自變量,生存狀態(tài)(死亡/存活=1/0)為因變量,選擇“Enter”法建立單因素和多因素Cox回歸模型。結(jié)果顯示:低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和circBIRC6≥10.97、APPBP2 mRNA≥2.48為NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 NSCLC患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

討 論

NSCLC是除小細(xì)胞肺癌以外所有起源于支氣管粘膜上皮的惡性腫瘤的統(tǒng)稱,以氣短、咯血和反復(fù)咳嗽等為主要臨床表現(xiàn),目前認(rèn)為其誘發(fā)原因包括吸煙、油煙、環(huán)境污染、慢性肺部疾病史、肺癌家族史、職業(yè)致癌物質(zhì)暴露史等[8]。近年來(lái)隨著居民健康意識(shí)的提高和低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描的開展,早期NSCLC診斷率有所提高,但初診晚期仍然占75%[8-9]。盡管近年來(lái)腫瘤分子生物學(xué)的進(jìn)展使晚期NSCLC靶向和免疫治療取得極大進(jìn)展,NSCLC患者預(yù)后有所改善,但療效隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)和患者數(shù)量增加逐漸降低,NSCLC患者總體預(yù)后依然很差[10-11]。尋找NSCLC預(yù)后影響因素,對(duì)指導(dǎo)患者個(gè)體化治療和促進(jìn)預(yù)后改善具有重要意義。

circRNA是一類新型的非編碼RNA,最初被認(rèn)為是RNA剪接錯(cuò)誤而出現(xiàn)的副產(chǎn)物,近年研究發(fā)現(xiàn)circRNA具有高度穩(wěn)定性和保守性,可以通過(guò)與線性微小RNA(microRNA,miRNA)相互競(jìng)爭(zhēng)對(duì)mRNA進(jìn)行螯合,或直接與RNA結(jié)合蛋白相互作用,或miRNA海綿競(jìng)爭(zhēng)性干擾miRNA與mRNA結(jié)合等多種機(jī)制參與腫瘤過(guò)程[12]。circBIRC6是人染色體2p22.3上的一種circRNA,是凋亡抑制蛋白家族中相對(duì)分子量巨大的成員,能作為泛素連接酶促進(jìn)凋亡蛋白的蛋白酶體降解,促進(jìn)細(xì)胞存活[13]?；赾ircRNA的抗凋亡作用,近年來(lái)被多種研究報(bào)道參與惡性腫瘤過(guò)程。如circBIRC6能靶向下調(diào)miR-449b-5p促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展和抑制其凋亡[14];circBIRC6能靶向下調(diào)miR-495-3p上調(diào)X-盒結(jié)合蛋白1,促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15];circBIRC6能靶向下調(diào)miR-367-3p促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥和抑制癌細(xì)胞凋亡[16]。研究提示,circBIRC6在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)circBIRC6表達(dá)能抑制NSCLC細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲和促進(jìn)凋亡[17-18]。然而關(guān)于circBIRC6在臨床NSCLC癌組織的表達(dá)意義尚不清楚。結(jié)果顯示,NSCLC組織中circBIRC6高表達(dá),提示circBIRC6高表達(dá)可能參與NSCLC發(fā)生,符合上述研究結(jié)果。結(jié)果還顯示,NSCLC組織中circBIRC6表達(dá)與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),circBIRC6高表達(dá)患者3年總生存率顯著降低,是NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步說(shuō)明circBIRC6高表達(dá)參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能是circBIRC6能靶向miR-944上調(diào)程序性細(xì)胞死亡配體1表達(dá),抑制腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞對(duì)NSCLC細(xì)胞的殺傷作用,促進(jìn)NSCLC細(xì)胞存活和持續(xù)惡性發(fā)展,進(jìn)而導(dǎo)致患者預(yù)后降低[19]。

APP是一種跨膜糖蛋白,既往常被作為阿爾茨海默病的重要參與者,近年研究發(fā)現(xiàn)APP不僅在神經(jīng)中大量表達(dá),在各種非神經(jīng)組織中也表達(dá)豐富,能影響細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活,在結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、甲狀旁腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中過(guò)表達(dá),并影響著癌細(xì)胞進(jìn)程[20]。APPBP2是一種與微管相互作用,并在功能與APP轉(zhuǎn)運(yùn)和加工相關(guān)有關(guān)的膜內(nèi)在蛋白,基于APPBP2對(duì)APP的調(diào)控作用,且APPBP2自身也能影響微管活動(dòng)和功能,因此有學(xué)者推測(cè)APPBP2在惡性腫瘤中扮演重要角色[5]。有學(xué)者通過(guò)基因組鑒定發(fā)現(xiàn),APPBP2異常表達(dá)與乳腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)[21-22]。實(shí)驗(yàn)指出,下調(diào)APPBP2能增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對(duì)靶向藥物的敏感性,抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[23]。然而關(guān)于APPBP2在臨床NSCLC癌組織的表達(dá)意義尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組織中APPBP2高表達(dá),提示APPBP2高表達(dá)可能參與NSCLC發(fā)生。結(jié)果還顯示,NSCLC組織中APPBP2表達(dá)與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),APPBP2高表達(dá)患者3年總生存率顯著降低,是NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步說(shuō)明APPBP2高表達(dá)參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能是APPBP2高表達(dá)能促進(jìn)APP大量合成,通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路,促進(jìn)NSCLC惡性進(jìn)展[24]。同時(shí)APPBP2高表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致微管功能異常,改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),促進(jìn)NSCLC細(xì)胞持續(xù)分裂、增殖和遷移[5]。

本研究通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān),提示circBIRC6與APPBP2可能共同參與NSCLC進(jìn)程而影響患者預(yù)后。最近Ni等[25]通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)也發(fā)現(xiàn),NSCLC中circBIRC6能通過(guò)海綿miR-217促進(jìn)APPBP2表達(dá),敲低circBIRC6則會(huì)抑制APPBP2表達(dá),進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和存活。此外本研究結(jié)果還顯示,EGFR基因突變陽(yáng)性/陰性NSCLC患者總生存率并無(wú)差異,考慮原因是EGFR基因突變雖然對(duì)EGFR靶向治療更敏感,但針對(duì)部分EGFR基因突變亞型作用較差,因此可能影響療效,這與既往研究報(bào)道結(jié)果相符[26]。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者總生存率高于Ⅲ期患者,且TNM分期Ⅲ期為NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,說(shuō)明TNM分期能顯著影響NSCLC患者預(yù)后。其原因可能是TNM分期越高反映腫瘤細(xì)胞的侵襲性更強(qiáng),惡性程度更高,因此會(huì)降低總生存率,并增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達(dá)升高,與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。但本研究樣本量較少和隨訪時(shí)間較短,其結(jié)果還需多中心研究進(jìn)一步擴(kuò)張樣本量和延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證。