菅若男 甄華 郭晶晶

肺纖維化(pulmonary fibrosis ,PF)是一種慢性進(jìn)行性間質(zhì)纖維化疾病,可致不可逆的瘢痕形成和肺血管重塑[1],其中位生存時(shí)間為2-4年[2]。然而,具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。有報(bào)道顯示,在小鼠[3, 4]和人[5]PF中,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與肺纖維化過程之間存在密切關(guān)系。研究表明,PI3K/Akt/mTOR信號通路與肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活和自噬不足促進(jìn)EMT,從而引起肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[6, 7]。蓽茇是蒙古族常用的草藥,現(xiàn)證明該藥具有抗腫瘤、改善心腦血管疾病、抗衰老和抗炎等生物活性[8]。本課題組前期研究已證實(shí)蓽茇可以減輕博來霉素引起小鼠肺部炎癥來改善肺纖維化[9]。基于此,本實(shí)驗(yàn)探討蓽茇調(diào)控PI3K/Akt/mTOR自噬相關(guān)信號通路對小鼠肺纖維化的影響,為科學(xué)治療PF提供理論支撐。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性KM小鼠(共50只),購自SPF生物技術(shù)有限公司(北京),批號SCXK(北京)2016-0002。到達(dá)時(shí),小鼠體重為(30±2)g。飼養(yǎng)條件:室溫(22±3)℃、濕度(45±5)%。本研究使用的動物經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(NO.2023079)。

2. 藥品

蓽茇購于內(nèi)蒙古騰翔中藥飲片有限公司,批號:170701。蓽茇20g,加水500mL浸泡30min,煎煮3次,每次30min,合并濾液濃縮,制成含生藥1.5g/mL的干浸膏;注射用鹽酸博來霉素,規(guī)格:8mg,國藥準(zhǔn)字號:H20123357,吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)有限公司;雷帕霉素(rapamycin,RAPA)購于Abcam:規(guī)格50ug,編號:53123-88-9,加DMSO溶解、分裝后置于-20℃冰箱保存。

3. 試劑

蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin stain,HE)染色液(Biosharp,貨號:BL700A);馬松(Masson)染色試劑盒(Solarbio,G1340)、Trizol試劑、SYBR Green Real Time PCR Master Mix、BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物,貨號:R0016、D7260、P0010);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(百邁克生物科技,貨號:RK02002);qRT-PCR所需引物購于上海生工生物工程公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、磷酸化磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine protein kinases,p-AKT) 和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、自噬相關(guān)蛋白1輕鏈3(autophagy-related protein 1 light chain 3,LC3)、自噬效應(yīng)蛋白(autophagy effector proteins,Beclin1)單克隆抗體(Abcam,貨號:ab108531、ab169771、ab151549、ab38449、ab109268、ab192890、ab210498)、羊抗兔二抗(Thermo Fisher,A-11034)。

4. 儀器

金華科迪KD-202/202A 病理石蠟切片機(jī)(科迪儀器設(shè)備有限公司);JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰);Nikon DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康);Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀(美國Biorad伯樂);小型電泳槽(美國Biorad伯樂);TG16.5低速高速離心機(jī)(盧湘)。

二、方法

1. 動物分組及方法

將50只KM小鼠適應(yīng)新環(huán)境(飼養(yǎng)2周)后,40只氣管內(nèi)滴注生理鹽水配置BLM(5mg/kg)建立PF模型,余下10只為空白組,采取隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組;模型組(BLM組);蓽茇低劑量組(LD組)、高劑量(HD組)組;雷帕霉素組(RAPA組)(見表1)。

表1 小鼠分組及處理

2. 肺功能(FVC、Cdyn)測定

將小鼠用戊巴比妥鈉(100mg/kg)進(jìn)行麻醉,氣管插管,調(diào)整流量閾,使小鼠呼吸平穩(wěn),即潮氣量為6～8mL/kg時(shí)記錄數(shù)據(jù)。使用Anires2005系統(tǒng)(中國北京)測量FVC和Cdyn。

肺組織:測定完肺功能后,麻醉處死小鼠(腹腔注射戊巴比妥鈉150mg/kg),手術(shù)暴露肺部,無菌完整剝離肺組織,用于肺部HYP、病理學(xué)變化檢測和蛋白檢測

3. HYP測定

根據(jù)羥脯氨酸檢測試劑盒說明準(zhǔn)確稱量右肺組織,制作成勻漿,測定HYP含量。結(jié)果表示為羥脯氨酸μg/蛋白質(zhì)g。

4. HE和Masson染色

將不同組小鼠分離的肺組織在4%多聚甲醛中固定24小時(shí),用乙醇梯度脫水,二甲苯透明化后包埋于石蠟中,切成4μm厚度。切片脫蠟和脫水后,用蘇木精染色6min,自來水藍(lán)化10min,視核染深淺進(jìn)行鹽酸乙醇分化,伊紅染色3 min,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。Masson染色是使用染色試劑盒說明進(jìn)行操作。顯微鏡下拍照。

5. RT-qPCR技術(shù)

使用TRIzol試劑按照說明書要求裂解肺組織,提取總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度。按照Prime ScriptTMRT預(yù)混試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。加入引物進(jìn)行基因序列擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算相對表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用下列公式計(jì)算:目的基因mRNA的相對表達(dá)=2-ΔΔCT,其中CT為循環(huán)數(shù)。(表2)為引物序列。

表2 引物序列

6. 免疫組化

組織切片方法與HE染色一致,固定,包埋,切片和脫蠟后,置于檸檬酸pH 6.0緩沖液中微波修復(fù)。PBS清洗,3% BSA封閉30 min。每張切片加入約50μL稀釋的α-SMA和TGF-β1一抗覆蓋組織,4℃過夜孵育。PBS清洗,加二抗,常溫孵育50min后,加50μL新鮮配制DAB溶液,顯色完全后,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,1%鹽酸酒精分化(約1s),自來水沖洗,氨水返藍(lán),流水沖洗。無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析得出每張照片陽性的累積光密度值(integrated optical density,IOD)以及組織的像素面積(The pixel area of the tissue,AREA)。并求出平均光密度值IOD/AREA(Mean Density),此值反映了目標(biāo)蛋白的單位面積濃度。

7. Western Blot

RIPA緩沖液裂解小鼠肺組織,并在4°C下10000×g離心以獲得上清液。BCA法測量蛋白質(zhì)濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2h,加入一抗(LC3、Beclin-1、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR)4°C孵育過夜。第二天,回收一抗溶液。用TBST洗膜3次,每次6min。洗滌后加入二抗,室溫孵育1h。將薄膜洗滌6次,然后用ECL發(fā)光試劑盒顯色和曝光,使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析,計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。用下列公式計(jì)算:目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)的方法;以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。條形圖由GraphPad 8.0軟件繪制。

結(jié) 果

一、蓽茇對肺組織病理變化影響

HE染色結(jié)果顯示:與 BLM組相比,LD組肺泡萎縮塌陷程度、肺泡壁增厚程度和肺實(shí)質(zhì)化減輕,炎癥細(xì)胞浸潤減少,損傷程度有所改善。HD組和RAPA組與BLM組相比,肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰,上皮細(xì)胞數(shù)量減少并且肺泡壁增厚程度明顯得到改善(見圖1)。

圖1 PF小鼠肺組織HE染色(×200)A:空白組肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡結(jié)構(gòu)清晰,上皮細(xì)胞數(shù)量未見增多,肺泡壁較薄,組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤;B:BLM組肺組織重度異常,大量肺泡萎縮塌陷,上皮細(xì)胞數(shù)量增多,肺實(shí)質(zhì)化,肺實(shí)質(zhì)內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤,粉紅色纖維組織增生;C: LD組部分肺泡萎縮塌陷,肺泡壁增厚,肺輕度實(shí)質(zhì)化,少量炎癥細(xì)胞浸潤;D-E:HD組和RAPA組肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰,少量區(qū)域上皮細(xì)胞增多,肺泡壁增厚,炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少(紅色箭頭表示炎癥細(xì)胞浸潤程度;黑色箭頭表示纖維組織增生程度)

Masson染色發(fā)現(xiàn):與 BLM組相比,LD組纖維化程度有所減輕,而HD組和RAPA組與其他組相比纖維化程度最小,與HE結(jié)果保持一致(見圖2)。

圖2 PF小鼠肺組織Masson染色(×200)A:空白組未見明顯纖維化;B:BLM組纖維化最嚴(yán)重,藍(lán)色膠原纖維最多;C:LD組纖維化程度有所減輕;D-E:HD組和RAPA組纖維化程度最小(藍(lán)色膠原纖維越多表示纖維化越嚴(yán)重,相反則表示纖維化程度越小)

二、蓽茇對肺功能、HYP影響

與空白組相比,BLM組FVC(P<0.01)和Cdyn(P<0.01)明顯降低,HYP(P<0.01)顯著增多,提示小鼠呼吸功能發(fā)生障礙,HYP積累,膠原蛋白在肺組織中過量沉積。而與BLM組相比,蓽茇處理后,LD組FVC和Cdyn顯著提升(P<0.05),HYP顯著降低(P<0.01),HD組和RAPA組FVC和Cdyn得到明顯改善(P<0.01),HYP明顯降低(P<0.01)(見圖3)。

圖3 各組小鼠肺功能和HYP情況注:與空白組相比,**P<0.01;與BLM組相比,#P<0.05,##P<0.01

三、 蓽茇對肺纖維化相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較,BLM組小鼠α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.01);與BLM組相比,蓽茇各劑量組和RAPA組α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下降,且存在顯著差異(P<0.01)(見圖4、5、6)。

圖4 蓽茇對小鼠肺組織α-SMA蛋白表達(dá)的影響(免疫組化×200)注:與空白組相比,**P<0.01;與BLM組相比,##P<0.01

圖5 蓽茇對小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)的影響(免疫組化×200)注:與空白組相比,**P<0.01;與BLM組相比,##P<0.01

圖6 蓽茇對α-SMA和TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響注:與空白組相比,**P<0.01;與BLM組相比,##P<0.01

四、蓽茇對肺組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響

通過自噬標(biāo)志性LC3Ⅱ和Beclin1蛋白指標(biāo)發(fā)現(xiàn),與空白組相比,BLM組小鼠肺組織中,Beclin1蛋白表達(dá)無顯著性差異,蓽茇治療4周后,與BLM組相比,LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。說明蓽茇可能通過激活自噬干預(yù)PF進(jìn)程(見圖7)。

圖7 蓽茇對自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)的影響注:與空白組相比,*P<0.05;與BLM組相比,##P<0.01

五、蓽茇對肺組織P13K/AKT/mTOR信號通路的影響

P13K/AKT/mTOR信號通路的激活對PF產(chǎn)生至關(guān)重要的作用,與空白組相比,BLM組小鼠肺組織中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01);與BLM組相比,蓽茇各劑量組和RAPA組 p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白磷酸化水平明顯降低,說明蓽茇通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路干預(yù)PF(見圖8)。

圖8 蓽茇對p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響注:與空白組相比,**P<0.01;與BLM組相比,#P<0.05,##P<0.01

討 論

PF是一類肺部疾病的終末表現(xiàn),其臨床特征是肺功能下降和進(jìn)行性呼吸困難[10]。且病因尚不清楚。肺纖維化的發(fā)病率逐年增加,尚無有效治療方法,預(yù)后極差[11]。因此,尋找新的治療藥物具有重要的臨床意義。

BLM在短時(shí)間內(nèi)可誘發(fā)肺部炎癥和PF,而BLM通過氣管內(nèi)給藥上調(diào)纖維化因子水平,如IL-1β,IL-6,TNF-α和TGF-β等[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到BLM處理后,肺組織HYP含量和炎癥細(xì)胞顯著增加,肺泡隔明顯增厚,肺功能下降。而蓽茇治療后減少小鼠肺部內(nèi)膠原蛋白的沉積和炎癥細(xì)胞的浸潤,肺功能得到改善。TGF-β1是肺纖維化細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因素。它具有吸引單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的能力,增強(qiáng)與肺纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá),并加快纖維化過程。ɑ-SMA是指示成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志物,其水平導(dǎo)致成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[13]。BLM處理后,肺組織TGF-β1和ɑ-SMA表達(dá)增加,蓽茇治療后,ɑ-SMA和TGF-β1蛋白表達(dá)降低。

自噬是一種生理過程,通過降解受損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在PF患者的肺組織中觀察到自噬不足[14]。自噬缺乏可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化來加速BLM誘導(dǎo)的肺纖維化的進(jìn)展[15]。在TGF-β1調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞分化期間,自噬受到抑制,并且自噬的激活可能阻斷分化過程并減輕纖維化[16, 17]。這表明,活化的自噬在肺纖維化的發(fā)展中具有保護(hù)作用。Beclin-1 是自噬的關(guān)鍵因子,參與著自噬體膜的伸展與封閉;LC3 是自噬的標(biāo)志性蛋白,是評價(jià)自噬水平的重要指標(biāo)[18, 19]。本實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)蓽茇可激活自噬。BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺組織中觀察到Beclin-1、LC3Ⅱ降低。而蓽茇上調(diào)Beclin-1、LC3Ⅱ的表達(dá)水平,來減弱BLM誘導(dǎo)的肺纖維化,抑制肺成纖維細(xì)胞活化。因此,蓽茇可能通過激活自噬來抑制肺成纖維細(xì)胞分化并緩解肺纖維化。

mTOR 的活化可抑制細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生,被認(rèn)作為自噬的負(fù)性中心調(diào)節(jié)點(diǎn)[20]。mTOR的上游調(diào)節(jié)劑之一是PI3K/AKT信號通路。增加的PI3K激活A(yù)KT,AKT通過激活mTOR抑制自噬[21]。PI3K/AKT/mTOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,作用于細(xì)胞的生長、存活、增殖、凋亡、蛋白質(zhì)合成、反轉(zhuǎn)錄和自噬等。研究發(fā)現(xiàn),在BLM誘導(dǎo)的PF動物模型中,通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,可以減輕肺纖維化[6,22]。有證據(jù)表明PI3K/AKT途徑參與TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化和膠原Ⅰ基因表達(dá)[23]。本研究評估了PI3K/AKT/mTOR途徑在蓽茇誘導(dǎo)的自噬中的作用。結(jié)果顯示,蓽茇可降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)。說明蓽茇可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路并且激活自噬來減少肺纖維化。

綜上所述,蓽茇可通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路、激活自噬,抑制炎癥反應(yīng)并改善肺組織纖維化。本實(shí)驗(yàn)揭示了蓽茇對PF的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制,這為蓽茇應(yīng)用于PF的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)意義。