張萬方,王 琳,潘鵬濤,李文昕,康瑞麗,朱子任,陳浩勤,方新宇,張星燦,張雨昕,姜依雯,李欣妍,袁本琪

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、間質(zhì)性肺病,其平均生存時間只有2～4年,被稱為“類腫瘤”[1]。研究[2-3]顯示IPF的主要特征是肺泡上皮細胞變異,后期肺組織異常修復(fù)等病變。肺泡上皮細胞在轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的刺激下會逐漸失去上皮細胞的特性,轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)細胞表型和特性,這一進程被稱為肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[4]。研究表明EMT與IPF發(fā)病具有重要的關(guān)系。

近年的研究[5-7]表明長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)在多種細胞進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,如細胞遷移、侵襲、凋亡等。lncSIL(AK004418)是突觸極蛋白2(SYNPO2)基因的第4個內(nèi)含子,具有抑制肌肉細胞發(fā)育的作用[8],課題組前期研究結(jié)果表明lncSIL能夠抑制肺泡上皮細胞的增殖和遷移[9],并且發(fā)現(xiàn)lncSIL在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進程中表達降低,過表達lncSIL能夠抑制間質(zhì)細胞標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ, Col Ⅰ)的表達,促進肺泡上皮細胞標志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達[10]。為了更深入地分析lncSIL在TGF-β1誘導(dǎo)EMT進程中的作用及其相關(guān)信號通路,本研究通過分析沉默lncSIL后相關(guān)細胞標志蛋白的表達變化,進一步驗證lncSIL的作用;并通過RNA pulldown檢測lncSIL的靶蛋白,通過分析過表達或沉默lncSIL后其靶蛋白組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)及其下游基因P21和CDK6的表達變化,并結(jié)合細胞周期進程的變化情況探討lncSIL在TGF-β1誘導(dǎo)EMT進程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞 A549細胞株購自上海生物科學(xué)研究所細胞庫,使用DMEM/F12 (含10%小牛血清)的培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.1.2主要試劑 LipofectaminTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol RNA 提取試劑盒、streptavidin-coupled Dynabeads(美國Invitrogen公司),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國 Thermofisher公司),小牛血清(批號:CA21,中國杭州四季青生物有限公司),引物由上海生工生物工程有限公司合成,siRNA序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司化學(xué)合成,抗體Col Ⅰ、α-SMA、EZH2、E-cad、HRP 標記二抗(美國Abcam公司),抗體P21、GAPDH(美國Santa Cruz公司),抗體CDK6 (美國BOSTER公司)。

1.1.3主要儀器 細胞培養(yǎng)箱(HERAcell 150 i)、核酸蛋白分析儀(Nano Drop 2000)購自美國 Thermo 公司,微孔板化學(xué)發(fā)光儀(LB960 Centro)購自德國 Berthold公司,熒光定量 PCR 儀(Light Cycler 480 II)購自瑞士 Roche公司,高速冷凍離心機(Allegra X-30R)購自美國 Beckman公司,垂直電泳儀(Power Pac HC)購自美國 Bio-Rad公司。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染將lncSIL克隆到pCMV-SPORT6載體獲得重組質(zhì)粒,使用Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑盒將其轉(zhuǎn)染到肺泡上皮細胞A549細胞中,同時設(shè)立空載體陰性對照,轉(zhuǎn)染4～6 h后加入誘導(dǎo)劑TGF-β1(5 μmol/L),24、48 h后收集細胞。設(shè)計并合成lncSIL 的SiRNA (CAATTGTAATAGTCAATAA)。轉(zhuǎn)染后加入誘導(dǎo)劑TGF-β1(5 μmol/L),24、48 h后收集細胞。

1.3 實時熒光定量PCR(real time-PCR,RT-PCR)使用TRIzol試劑盒提取各組分細胞的總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟要求合成cDNA,使用熒光定量PCR試劑盒SYBR green-based PCR Master Mix對目的基因進行定量分析。按照說明書步驟進行操作,采用兩步法,每組設(shè)置3個復(fù)孔,樣品重復(fù)檢測3次。以GADPH為內(nèi)參,根據(jù)公式2-ΔΔCT進行定量分析。

1.4 Western blot使用細胞裂解緩沖液裂解細胞樣品獲得細胞的總蛋白,使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。100 ℃變性10 min后經(jīng)過12% SDS-PAGE電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉的封閉液于室溫封閉1～2 h,隨后加入一抗( Col Ⅰ:1 ∶1 000,α-SMA:1 ∶1 000,EZH2:1 ∶1 000,P21:1 ∶500 ,E-cad:1 ∶1 000,CDK6:1 ∶500,GAPDH:1 ∶5 000)4 ℃封閉過夜,次日加入對應(yīng)的二抗室溫封閉30 min,最后經(jīng)ECL顯色后分析結(jié)果。

1.5 RNA pulldown生物素標記lncSIL與提取的細胞的總蛋白在室溫下作用1 h,然后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠(streptavidin-coupled Dynabeads)室溫孵育1 h,使用洗脫液洗滌,最后對上樣液(input)、洗脫液(lncSIL)和磁珠(beads)進行Western blot鑒定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS19.0軟件對實驗所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,組間差異比較采用t檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默lncSIL對TGF-β1誘導(dǎo)EMT進程的影響在TGF-β1誘導(dǎo)EMT的進程中,沉默lncSIL后,E-cad表達下調(diào),α-SMA和Col I表達上調(diào)(圖1A);在未進行TGF-β1誘導(dǎo)的對照組細胞中,沉默lncSIL后3種標志蛋白的表達變化與誘導(dǎo)組一致(圖1B)。說明lncSIL具有抑制EMT的作用。

圖1 沉默或過表達lncSIL后細胞中標志蛋白表達的變化

2.2 lncSIL對靶蛋白EZH2表達的影響為進一步驗證EZH2是否為lncSIL的蛋白伴侶,使用lncSIL為探針,進行RNA pulldown實驗,并通過Western blot證明EZH2是lncSIL的結(jié)合蛋白(圖2A)。在此基礎(chǔ)上,通過Western blot檢測了在TGF-β1誘導(dǎo)EMT進程中沉默或過表達lncSIL后EZH2蛋白的表達變化。結(jié)果顯示:TGF-β1誘導(dǎo)組(NC+TGF)中EZH2的表達量與對照組(NC)相比明顯升高;當直接沉默lncSIL后,沉默組(Si-SIL)與對照組(NC)相比,EZH2蛋白的表達量也明顯升高,并且沉默組(Si-SIL)與TGF-β1誘導(dǎo)組(NC+TGF)相比EZH2的表達水平相似;當TGF-β1誘導(dǎo)的同時沉默lncSIL后,TGF-β1誘導(dǎo)+沉默組(Si-SIL+TGF)與TGF-β1誘導(dǎo)組(NC+TGF)相比EZH2的表達量顯著升高(圖2B)。說明TGF-β1誘導(dǎo)能夠促進EZH2蛋白的表達,沉默lncSIL表達也能夠促進EZH2的表達,并且沉默lncSIL與TGF-β1誘導(dǎo)同時進行具有加成作用。

圖2 沉默或過表達lncSIL對EZH2蛋白表達的影響

當直接過表達lncSIL時,過表達組(lncSIL)與對照組(NC)相比EZH2的表達量明顯降低;當TGF-β1誘導(dǎo)的同時過表達lncSIL時,TGF-β1誘導(dǎo)+過表達組(lncSIL+TGF)與TGF-β1誘導(dǎo)組(NC+TGF)相比EZH2的表達量明顯降低;過表達組(lncSIL)與TGF-β1誘導(dǎo)+過表達組(lncSIL+TGF)相比EZH2的表達量再次顯著降低(圖2C)。說明過表達lncSIL抑制EZH2的表達,并且lncSIL的抑制作用能夠抵消一部分TGF-β1的誘導(dǎo)作用。RT-PCR的結(jié)果顯示EZH2 mRNA表達變化與上述結(jié)果一致(圖2D)。

2.3 lncSIL對EZH2/p21/CDK6信號通路相關(guān)蛋白表達的影響對EZH2調(diào)控的下游相關(guān)基因細胞周期抑制蛋白P21和細胞周期蛋白依賴性激酶CDK6在沉默或過表達lncSIL后的表達分析結(jié)果顯示,沉默lncSIL后,EZH2和CDK6表達升高,P21表達降低(圖3A);過表達lncSIL時,EZH2和CDK6表達降低,P21表達升高(圖3B)。以上結(jié)果說明,lncSIL主要通過抑制EZH2蛋白表達,促使P21基因表達升高,進一步抑制CDK6的表達,導(dǎo)致細胞周期進程受到抑制,最終抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進程。

圖3 沉默或過表達lncSIL對EZH2/p21/CDK6信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 lncSIL對細胞周期進程的作用使用流式細胞術(shù)對TGF-β1誘導(dǎo)EMT進程中沉默或過表達lncSIL后的細胞周期進程分析結(jié)果顯示,過表達lncSIL時,與對照組(NC+TGF)相比,lncSIL+TGF組S期細胞數(shù)量明顯降低,G1/G0期細胞數(shù)量明顯升高(圖4A);沉默lncSIL后,與對照組(NC+TGF)相比,Si-SIL+TGF組S期細胞數(shù)量明顯升高,G1/G0期細胞數(shù)量明顯降低(圖4B)。結(jié)果說明lncSIL通過抑制細胞進入S期進一步抑制細胞周期進程。

圖4 沉默或過表達lncSIL對細胞周期進程的影響

3 討論

近年來lncRNA在肺纖維化進程中的作用不斷被揭示出來,例如,lncRNAs uc.77和2700086A05Rik通過上調(diào)Zeb2 和Hoxa3基因的表達誘導(dǎo)EMT,最終導(dǎo)致肺纖維化[11];LncRNA MALAT1通過PI3K/AKT/mTOR/Snail途徑抑制EMT進一步影響肺纖維化等[12]。根據(jù)前期研究[9-10]結(jié)果,本研究首先通過在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進程中沉默lncSIL后,檢測細胞標志蛋白表達變化,結(jié)合前期實驗結(jié)果進一步證明了lncSIL具有抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT進程的作用。為了深入探討lncSIL的分子機制,本研究通過RNA pulldown驗證了EZH2為lncSIL的相互作用蛋白,并發(fā)現(xiàn)lncSIL負向調(diào)控EZH2表達。EZH2是組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶,為多梳蛋白復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的核心成分,具有H3K27me3的能力,當其被招募到靶基因的啟動子上時,通過甲基轉(zhuǎn)移酶的作用,使下游靶基因通過甲基化而實現(xiàn)表觀沉默[13]。P21是一種重要的細胞周期蛋白的抑制基因,其作用是通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶CDK6的表達[14],進一步抑制細胞周期進程。本研究結(jié)果顯示lncSIL抑制EZH2的表達,促進P21的表達,說明lncSIL阻止了EZH2被招募到P21的啟動子上,導(dǎo)致P21逃過了表觀遺傳沉默。P21通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶CDK6引起細胞周期由G1期向S期的轉(zhuǎn)變受阻,細胞無法進入S期。綜合以上結(jié)果推測:lncSIL抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進程中的分子機制是通過負向調(diào)控EZH2/P21/CDK6通路,抑制細胞周期進程,從而抑制肺泡上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果將對特發(fā)性肺纖維化發(fā)生機制的探究以及尋找診斷和治療特發(fā)性肺纖維化的靶點具有重要意義。