汪萬(wàn)杰,許 晗,許婷婷,鮑 靜,夏瑞祥

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是目前第二大常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,近年來(lái)發(fā)病率逐漸增加。其以骨髓中單克隆性漿細(xì)胞異常的惡性增殖為特點(diǎn),常見的臨床癥狀表現(xiàn)為骨破壞、貧血、高鈣血癥及腎功能損害等。近年來(lái),隨著治療方案的更新?lián)Q代以及干細(xì)胞移植等技術(shù)的應(yīng)用,MM的預(yù)后有了很大改善。但由于其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明確,治療藥物的耐藥和副作用、治療后復(fù)發(fā)等都提示著需要探索MM新的治療策略。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)在真核生物中是一種可逆的、動(dòng)態(tài)的表觀遺傳修飾,其中甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16(methyltransferase like protein 16,METTL16)是人類細(xì)胞RNA修飾領(lǐng)域的新興參與者,現(xiàn)在已被證明可以結(jié)合MAT2A信使RNA (mRNA)和U6小核RNA (snRNA)并使其甲基化[1]。目前已發(fā)現(xiàn)METTL16與肝癌等惡性腫瘤有關(guān)[2],但其與MM的相關(guān)性還有待發(fā)掘。因此,該研究將進(jìn)一步探尋m6A與MM的診斷及預(yù)后的相關(guān)性,探討METTL16在臨床診治中的意義,并初步探索其影響MM可能相關(guān)的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2023年4-8月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科就診的MM初次就診患者26例以及標(biāo)準(zhǔn)方案治療后患者19例、健康人23例,收集患者的骨髓樣本及正常人的外周血樣本用于分離獲得淋巴細(xì)胞,所有患者均符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2022年修訂)》診斷標(biāo)準(zhǔn),采用ISS分期。參與本研究者均已簽署書面知情同意書。本研究方案遵循赫爾辛基宣言的原則,已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.20200040)。

1.2 試劑與儀器人骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒及人全血單個(gè)核細(xì)胞分離購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,TRIzol及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司,引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成(表1),去基因組與逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預(yù)混液及高特異化學(xué)染料法定量PCR預(yù)混液(無(wú)ROX)由莫納生物科技有限公司提供。離心機(jī):美國(guó)BECKMAN COULTER公司,型號(hào)為Allegra X-15R Centrifuge;qRT-PCR儀:美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào)為CFX Connect。

表1 引物序列

1.3 相關(guān)性分析下載多發(fā)性骨髓瘤研究基金會(huì)(The Multiple Myeloma Research Foundation,MMRF)數(shù)據(jù)庫(kù)及基因型-組織表達(dá)項(xiàng)目(The Genotype-Tissue Expression,GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)中多發(fā)性骨髓瘤患者及正常人組織中m6A相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)集,檢驗(yàn)MM患者與正常對(duì)照各m6A相關(guān)基因的表達(dá)差異,分析其與患者生存預(yù)后的相關(guān)性。

1.4 標(biāo)本的采集與檢測(cè)采用 Ficoll 分離方法分離骨髓及外周血中的單個(gè)核細(xì)胞,將細(xì)胞于RPMI1640培養(yǎng)基中混懸,于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h。吸取靜置后的細(xì)胞懸液于離心機(jī)中4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液,獲得骨髓及外周血淋巴細(xì)胞。加入TRIzol試劑提取淋巴細(xì)胞RNA,使用去基因組與逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預(yù)混液逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,高特異化學(xué)染料法定量PCR預(yù)混液(無(wú)ROX)進(jìn)行qRT-PCR。所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。收集初診及復(fù)查患者相關(guān)的臨床指標(biāo)(表2),包括性別、年齡、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、白細(xì)胞數(shù)(white blood cell count, WBC)、血小板數(shù)(blood platelet count, PLT)、血肌酐(serum creatinine, Scr)、血清鈣離子(serum calcium, Ca2+)、β-微球蛋白(β-microglobulin, β-MG)、骨破壞、ISS分期、分型等。其中Hb、WBC、PLT由臨檢室提供,Scr、Ca2+、β-MG由生化室提供,骨破壞由影像學(xué)檢查判斷。

2 結(jié)果

2.1 MM患者與正常組織m6A各相關(guān)酶表達(dá)水平及生存分析通過(guò)分析MMRF及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中MM患者及正常組織對(duì)照的基因表達(dá)量及臨床信息發(fā)現(xiàn),METTTL3、METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1及YTHDC2在MM患者中表達(dá)量均顯著高于正常組織,而METTL14和FTO則相反,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。預(yù)后分析顯示METTTL3、METTL14、METTL16、RBM15、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2及YTHDC2基因均與更短的生存期相關(guān)(圖2)。

圖1 MMRF及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中m6A相關(guān)基因的表達(dá)水平

圖2 MMRF數(shù)據(jù)庫(kù)中m6A相關(guān)基因生存曲線

2.2 m6A各相關(guān)酶在MM患者及正常對(duì)照中的表達(dá)情況收集初診MM患者、標(biāo)準(zhǔn)方案治療后MM患者的骨髓標(biāo)本及正常人外周血樣本,提取其中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR,其結(jié)果(圖3)提示METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2及YTHDF2在初診和復(fù)查的MM患者中表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照,同時(shí)初診MM患者中的表達(dá)量也高于治療后復(fù)查的患者(P<0.05),而METTL3與FTO、YTHDF1在初診患者中的表達(dá)量也顯著高于治療后患者,METTL14及YTHDF2在初診患者中的表達(dá)量則顯著高于正常對(duì)照,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算初診患者中各基因表達(dá)量相對(duì)于正常對(duì)照中的倍數(shù),觀察其中表達(dá)升高更加顯著的基因(圖4)。

圖3 MM初診患者、治療后復(fù)查患者及正常對(duì)照m6A表達(dá)水平

圖4 初診患者中m6A各基因相對(duì)于正常對(duì)照表達(dá)量升高倍數(shù)

2.3 METTL16與初診患者各臨床指標(biāo)的相關(guān)性收集初診患者各臨床指標(biāo),與METTL16表達(dá)量進(jìn)行臨床相關(guān)性分析(圖5)。根據(jù)分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),Hb、WBC、β-MG、生存期、分期及骨破壞等均與METTL16有顯著相關(guān)性(P<0.05)。其中Hb及生存期與METTL16的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,WBC、β-MG及分期均與METTL16表達(dá)呈正相關(guān)性,而當(dāng)患者出現(xiàn)骨破壞后,骨破壞的程度也與其表達(dá)量呈正相關(guān)。

圖5 初診MM患者M(jìn)ETTL16表達(dá)與臨床各指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 METTL16與炎癥因子和趨化因子表達(dá)的相關(guān)性在初診患者樣本中使用qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-18以及趨化因子CCL2、CCL3、CCL4的表達(dá)量。分析METTL16與炎癥因子及趨化因子表達(dá)的相關(guān)性(圖6),可以發(fā)現(xiàn)METTL16與CCL4的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。

圖6 初診MM患者M(jìn)ETTL16表達(dá)量與CCL4表達(dá)量相關(guān)性分析

3 討論

近年來(lái),對(duì)于m6A各基因在多種腫瘤中發(fā)揮的調(diào)控作用研究非常多,其中包括肝癌、肺癌以及急性髓系白血病[3]等,其主要通過(guò)參與mRNA的翻譯、降解和剪切等來(lái)改變靶基因的表達(dá)。而在MM中,METTL3目前已被發(fā)現(xiàn)可以影響MM細(xì)胞的干性,抑制其凋亡[4],同時(shí),FTO和ALKBH5均可以在YTHDF2依賴的情況下促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖和侵襲,抑制其凋亡[5-6]。HNRNPA2B1則可以通過(guò)介導(dǎo)多條通路,包括AKT3、TLR4等基因的表達(dá)與修飾,促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖和侵襲[7-8]。

本研究選取m6A中較為常見的11個(gè)相關(guān)基因,包括METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、RBM15、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1和YTHDC2,在MMRF及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)其表達(dá)量與MM的發(fā)病及預(yù)后進(jìn)行相關(guān)分析,其結(jié)果顯示除METTL14和FTO外,其余基因在MM患者中表達(dá)量均顯著高于正常組織,其中METTTL3、METTL1、RBM1、ALKBH、YTHDF1、YTHDF2及YTHDC2基因的表達(dá)與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān),均提示更差的預(yù)后。在臨床樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)在MM患者中METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2及YTHDF2的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照,同時(shí)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方案治療后上述基因的表達(dá)量也同樣均低于初診患者。而初診患者與正常對(duì)照相比的表達(dá)倍數(shù)顯示,METTL16、WTAP、ALKBH5、YTHDF2、YTHDC1及YTHDC2的表達(dá)倍數(shù)顯著較高。在上述基因中,METTL16與MM的相關(guān)性是顯著的,但目前對(duì)于METTL16調(diào)控MM疾病發(fā)生與進(jìn)展的影響與機(jī)制尚不明確,因此本研究選取METTL16進(jìn)一步探究其在MM疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)METTL16的基因表達(dá)量與初診MM患者的臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,顯示其與多個(gè)指標(biāo)具有相關(guān)性,其中包括與Hb、生存期的負(fù)相關(guān)以及與WBC、β-MG、分期及骨破壞等的正相關(guān)。MM的主要癥狀包括貧血、骨破壞、高鈣血癥及腎功能損害,而METTL16與Hb的負(fù)相關(guān)以及骨破壞的正相關(guān)提示其表達(dá)量越高,患者的貧血程度越重,而當(dāng)患者出現(xiàn)骨質(zhì)破壞后,METTL16的表達(dá)越高則預(yù)示著更嚴(yán)重的骨破壞。這些都提示METTL16與MM疾病的進(jìn)展相關(guān)。而既往的研究顯示,β-MG與MM的更差分期及預(yù)后相關(guān)[9],因此METTL16與β-MG以及分期的正相關(guān)提示其表達(dá)越高,預(yù)示著疾病的更差分期及預(yù)后。根據(jù)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),METTL16的表達(dá)往往提示臨床MM患者的疾病進(jìn)展,預(yù)示著更差的分期和預(yù)后,對(duì)于臨床的診治具有指導(dǎo)意義。

炎癥因子是指參與各種炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子。在既往多年對(duì)于腫瘤相關(guān)的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),促進(jìn)腫瘤的炎癥也是癌癥的特征之一。腫瘤微環(huán)境中的炎癥失調(diào)直接通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的惡性細(xì)胞刺激和(或)間接通過(guò)誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子、血管生成和組織重塑促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。同樣的, IL-1β、IL-6、IL-18等多種炎癥因子也均已被證實(shí)與MM的發(fā)展與預(yù)后相關(guān)[10-12],參與到MM細(xì)胞的增殖、侵襲以及耐藥等過(guò)程。趨化因子則是炎癥反應(yīng)中使免疫細(xì)胞定向趨化的細(xì)胞因子蛋白。其主要作用是誘導(dǎo)細(xì)胞的定向遷移,在炎癥及體內(nèi)各平衡過(guò)程中管理白細(xì)胞向各位置的定向歸巢,其分泌通常由炎癥因子刺激,并與炎癥因子協(xié)同作用。趨化因子在MM的發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用,包括趨化因子配體(chemokine ligand,CCL)3、趨化因子受體(chemokine receptor,CCR)1等多種趨化因子均被證明調(diào)控MM的進(jìn)展和耐藥[13-14]等多種生物學(xué)過(guò)程。因此,本研究選取4種炎癥因子和3種趨化因子,探究METTL16的表達(dá)與其是否具有相關(guān)性,能否進(jìn)一步研究METTL16調(diào)控MM可能的相關(guān)通路。

METTL16與炎癥因子及趨化因子的相關(guān)性分析表明其與CCL4的表達(dá)具有顯著的正相關(guān)性,METTL16表達(dá)越高,CCL4的表達(dá)也越高。該結(jié)果提示METTL16可能通過(guò)CCL4相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控MM的進(jìn)展及預(yù)后。CCL4,一種CC趨化因子,也被稱為巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein , MIP)-1β,可以對(duì)各種類型的免疫和非免疫細(xì)胞具有多種作用。目前已知CCL4可以通過(guò)募集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和致瘤性巨噬細(xì)胞,并作用于腫瘤微環(huán)境中的其他駐留細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)其致瘤能力,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[15]。但對(duì)于CCL4與MM的作用目前尚不清楚。因此,在進(jìn)一步的研究中可以探究CCL4與MM的相關(guān)性,并明確METTL16是否通過(guò)CCL4相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控MM的疾病發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述,MM患者的骨髓中m6A多種基因均呈高表達(dá),其中METTL16的高表達(dá)對(duì)于評(píng)估疾病的進(jìn)展以及預(yù)測(cè)預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。同時(shí),METTL16與趨化因子CCL4的表達(dá)呈正相關(guān),在未來(lái)的研究中可以進(jìn)一步明確其與MM相關(guān)的信號(hào)通路,尋找能夠抑制METTL16表達(dá)的治療方式,為MM尋找新的治療策略。