廖小毓,方 輝,楊飛宇,鄒多宏,2

引導(dǎo)性骨再生(guided bone regeneration,GBR)技術(shù)是口腔科常用的骨量提升技術(shù)之一,而 GBR 膜作為其關(guān)鍵材料之一,具有避免骨缺損部分被軟組織侵占并引導(dǎo)新骨生長的重要作用[1]。然而,商用 GBR 膜如 Bio-Gide 膜等,存在機械性能不足、降解速度過快等問題,容易導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥,如膜穿孔等[2]。因此,迫切需要開發(fā)一種高模量高強度的 GBR 膜。絲素蛋白是一種天然的蛋白質(zhì),主要存在于蠶絲的繭中。它具有良好的生物相容性,可在各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用,并不引起免疫反應(yīng)。絲素蛋白可在體內(nèi)逐漸降解并被代謝,為新生組織提供支撐,最終被身體自身的組織所替代[3]。絲素蛋白因其生物相容性、可降解性、機械性能、生物活性以及可塑性和可功能化的特點,使其在生物醫(yī)藥和組織工程領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。該研究以絲素蛋白作為原料,采用自蒸發(fā)方法使絲素蛋白溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟げ?并通過保濕、熱壓的方法進一步改變其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),通過測試其濕態(tài)拉伸強度、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及對細胞增殖黏附的影響等,探究其作為新型 GBR 膜的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑蠶繭(南潯練市久恒蠶絲制品經(jīng)營部);蛋白酶 K、溴化鋰(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);碳酸鈉(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司);小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)、小鼠成纖維細胞(L929)購自中國科學(xué)院細胞庫;MWCO 3500 透析袋 (湖南翊博生物科技有限公司)。 MEM-α 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)、杜氏磷酸鹽緩沖溶液(Dulbecco’s phosphate buffered saline,DPBS)、胎牛血清、0.25%胰酶細胞消化液、青-鏈霉素(美國 Gibco 公司),CCK-8 試劑盒、Calcein-AM/PI 活/死細胞雙染試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)。

1.2 主要儀器場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM-IT800,日本電子株式會社),傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS50 FT-IR,美國 Thermo Fisher 公司),自動壓片機(ZDZT-30T,天津市睿恒科技發(fā)展有限公司)、溫控儀(ZTRM-1,天津市睿恒科技發(fā)展有限公司),酶標儀(Spark,美國 Biotek 儀器有限公司),倒置熒光顯微鏡(IX71,日本 Olympus 株式會社),細胞培養(yǎng)箱(IMH60-S,美國 Thermo Scientific 公司),冷凍離心機(MultifugeXPro Series,美國 Thermo Scientific 公司),萬能力學(xué)試驗機(5565A,美國 Instron 公司),冷凍干燥機(SCIENTZ-12N/A,寧波新芝士生物科技有限公司),激光掃描共聚焦顯微鏡(A1 RHD25,日本尼康株式會社)。

1.3 方法

1.3.1提取絲素蛋白溶液 將去蛹的桑蠶繭剪成片狀,稱取 4.24 g無水碳酸鈉,溶于 2 L 去離子水,煮沸后加入 5 g蠶繭片,保持沸騰 30 min。取出蠶絲,去離子水洗沖洗、浸泡、擰干,重復(fù) 5 遍,直至徹底洗去絲膠和碳酸鈉;洗凈的蠶絲,放入 60 ℃ 烘箱過夜烘干,得到脫膠蠶絲。配制濃度為 9.3 mol/L的溴化鋰溶液,置于 60 ℃油浴中加熱。向溶液中加入 5 g 脫膠蠶絲,低速攪拌反應(yīng) 4 h。完成反應(yīng)后,將所得溶液裝入事先準備好的 MWCO 3500 透析袋中,去離子水透析 48 h,以去除溶液中的溴化鋰。透析完畢后,將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中,并在 4 ℃、9 000 r/min離心2次,每次離心 20 min[4]。留取上清液作為最終使用的絲素蛋白溶液。

1.3.2制備絲素蛋白膜 將絲素蛋白溶液均勻地倒入方形培養(yǎng)皿中,然后將培養(yǎng)皿放置在 30 ℃的加熱臺上蒸發(fā) 24 h ,直至完全干燥,形成薄膜。將膜放置于 60 ℃、100%相對濕度的恒溫恒濕箱中高溫高濕處理 20 min,然后將膜放置于在兩塊鏡面鋼之間,使用熱壓機在 15 MPa、170 ℃的條件下進行熱壓處理,即可獲得絲素蛋白膜。所得的絲素蛋白膜應(yīng)進行真空干燥保存,以備后續(xù)使用。

1.3.3微觀表征 將絲素蛋白膜裁剪成規(guī)則大小,于液氮中脆斷得到樣品。選擇斷面整齊的樣品,采用導(dǎo)電膠將其固定于樣品臺正面及側(cè)面,于低真空度的蒸金室中蒸金 60 s,通過掃描電鏡在 2.5kV 加速電壓下觀察其表面及截面結(jié)構(gòu)特征。取絲素蛋白膜采用傅里葉變換紅外光譜儀分析其二級結(jié)構(gòu)。

1.3.4力學(xué)性能測試 將絲素蛋白膜裁剪成長條形樣品并浸泡于 DPBS 中,待其充分溶脹后使用游標卡尺測量厚度、寬度與長度,樣品置于恒溫水浴中通過萬能力學(xué)試驗機以 100 mm/min 的拉伸速度勻速拉伸直至樣品斷裂,以測量其濕態(tài)拉伸性能。

1.3.5細胞相容性檢測 根據(jù)ISO/EN10993-12 國際標準組織的規(guī)定,提取絲素蛋白膜浸提液,并將經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的樣品浸泡在含有 10% 胎牛血清和 1% 青-鏈霉素溶液的培養(yǎng)基中,浸泡時間為 24 h。接種 MC3T3-E1 細胞,每個時間點每組 3 個復(fù)孔,每孔接種 1×103個細胞。接種 24 h 后更換培養(yǎng)基,對照組使用普通培養(yǎng)基,絲素蛋白組使用浸提液培養(yǎng),每 3 d 換液 1 次。在 1、4、7 d 分別棄去培養(yǎng)基,PBS 清洗,每孔加入 CCK-8 溶液,37 ℃ 孵育 1 h 后使用酶標儀讀取450 nm處吸光度值。

1.3.6細胞活力實驗 通過活/死熒光染色評估細胞活力:使用打孔器將絲素蛋白膜制備成直徑 6 mm的圓形樣品,高壓蒸汽滅菌,分別置于 3 個 96 孔板中,每個樣品上接種 3×103個 L929 細胞,每個時間點設(shè) 3 個復(fù)孔。分別培養(yǎng) 4、7 d 后按照活死細胞染色試劑盒使用說明書染色,使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍攝樣品。

1.3.7細胞黏附實驗 將 MC3T3-E1 細胞接種于絲素蛋白膜,4 d 后取出,PBS 溶液洗滌 3 次,用 4% 多聚甲醛固定 40 min 后再次使用 PBS 洗滌,每次 5 min 。使用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水(乙醇溶液的濃度依次為 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 和 100%),每個梯度脫水 10 min 。脫水完畢后用叔丁醇清洗薄膜 3 次,置換出乙醇后使用冷凍干燥機將薄膜樣品凍干,用于掃描電鏡觀察。

1.3.8細胞成骨分化的檢測 將消毒后的絲素蛋白膜浸泡于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi) 24 h,獲得浸提液。將 MC3T3-E1 接種于 12 孔板內(nèi),24 h 后更換為相應(yīng)浸提液培養(yǎng)基,每 3 d換液 1 次, 7 d 后按照 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色劑說明書進行染色以檢測 ALP 活性。

1.3.9溶脹及降解性能測試 溶脹測試:將絲素蛋白膜裁剪成 5 mm×15 mm 的條形樣品,60 ℃ 烘干后稱量原始質(zhì)量,然后將樣品完全浸沒于 DPBS 中,分別于 0.25、0.5、1、1.5、6、12、24、48、72 h 后取出,用濾紙吸去樣品表面的液體后稱重,定量變化表示為相對于初始干重溶脹后重量的百分比。

降解性能測試:將絲素蛋白膜制成規(guī)則的條形樣品,烘干后用分析天平測量樣品干重,絲素蛋白膜(每組n=3)浸沒在含或不含 0.1 U/L蛋白酶 K 的 DPBS 溶液中,在 37 ℃搖床中溫育0.5、1、3、6、12 h,每個時間段更換新鮮降解液,將降解的產(chǎn)物收集后在去離子水中漂洗并真空抽濾,60 ℃下干燥后稱量干重。定量變化表示為相對于初始干重殘留的重量的百分比。

2 結(jié)果

2.1 絲素蛋白膜的結(jié)構(gòu)表征及成分分析掃描電鏡可見絲素蛋白膜表面平整(圖 1A),截面可見其結(jié)構(gòu)致密,厚度約為 90 μm(圖 1B)。如圖 2C 所示,未保濕、熱壓的絲素蛋白膜的紅外吸收峰在 1 637 cm-1、1 514 cm-1處,分別表示隨機卷曲、α-螺旋中氨基酸殘基的 C=O 鍵振動和 β-折疊結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的 N-H 及 C-N 鍵振動。對膜樣品進行高溫高濕、熱壓處理后,新的紅外吸收峰出現(xiàn)在 1 699 cm-1處,表明膜樣品中出現(xiàn)了新的 C=O 鍵振動。同時,原先位于1 637 cm-1的 C=O 鍵振動峰移動至 1 618 cm-1處,并且峰形更加尖銳。以上結(jié)果表明高溫高濕和熱壓處理促進了 β-折疊構(gòu)象的形成。

2.2 濕態(tài)條件下自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜與甲醇交聯(lián)的絲素蛋白膜拉伸強度的比較圖2顯示,在濕態(tài)條件下,自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜與甲醇交聯(lián)的絲素蛋白膜在拉伸彈性模量、拉伸強度方面存在顯著差異。首先,自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜的拉伸彈性模量為(45±8.19)MPa,而甲醇交聯(lián)的絲素蛋白膜的拉伸彈性模量為(3.27±0.47)MPa。表明自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜具有更高的彈性模量,即在受力后能夠更好地恢復(fù)到原始形狀。自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜的拉伸強度為(8.39±0.63)MPa,而甲醇交聯(lián)的絲素蛋白膜的拉伸強度為(1.48±0.151)MPa。表明自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜具有更高的抗拉強度,能夠承受更大的拉伸力。以上結(jié)果表明自蒸發(fā)-熱壓處理的絲素蛋白膜具有更高的彈性模量、拉伸強度。

圖1 絲素蛋白膜的微觀形貌和二級結(jié)構(gòu)成分分析

圖2 絲素蛋白膜的拉伸機械性能測試

圖3 絲素蛋白膜的生物相容性及細胞黏附能力

圖4 絲素蛋白膜的促成骨分化能力檢測

圖5 絲素蛋白膜的溶脹及體外降解性能

2.3 細胞增殖及細胞活力實驗根據(jù) CCK-8 法檢測結(jié)果顯示,培養(yǎng) 1、4、7 d 后,空白組和絲素蛋白組之間的吸光度無明顯差異(圖 3A)。通過倒置熒光顯微鏡觀察活死細胞染色,結(jié)果如圖 3B所示,活細胞呈現(xiàn)綠色熒光(活),死細胞呈現(xiàn)紅色熒光(死)。在共培養(yǎng) 4、7 d 后,空白組和絲素蛋白組表面的活死細胞比例無明顯差異。這些結(jié)果表明絲素蛋白組對細胞的毒性無明顯影響。

2.4 細胞黏附能力MC3T3-E1 接種在絲素蛋白膜表面 4 d 后,掃描電鏡結(jié)果表明細胞可以較好的黏附在絲素蛋白膜表面(圖 3C),且伸出偽足。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察絲素蛋白膜表面 MC3T3-E1 細胞,圖 3D 為細胞核染色圖、細胞骨架染色圖以及二者的融合圖像,可見大量細胞伸展黏附于絲素蛋白膜表面。以上結(jié)果表明 MC3T3-E1 細胞對絲素蛋白膜具有良好的黏附性。

2.5 促成骨分化能力成骨誘導(dǎo) 7 d 后,ALP染色實驗結(jié)果如圖 4,與空白組相比,在絲素蛋白組中MC3T3-E1細胞表面顯示堿性磷酸酶陽性結(jié)果更明顯。這表明絲素蛋白的存在確實有一定促成骨作用。

2.6 溶脹性和可降解性溶脹測試結(jié)果如圖 5,絲素蛋白膜在溶脹初始階段(1 h 內(nèi))溶脹較快,6 h 左右達到溶脹平衡。降解實驗表明,在 0.1 U/L 蛋白酶 K 的存在條件下,12 h 時絲素蛋白膜降解率達 35.3% 左右。表明絲素蛋白膜具有一定的溶脹性和可降解性。

3 討論

GBR 技術(shù)是一種使用屏障膜的外科技術(shù),廣泛應(yīng)用于牙周組織再生領(lǐng)域,它的原理是使用屏障膜來防止軟組織長入骨缺損區(qū)域,并幫助形成新生骨[5]。GBR 膜通?？煞譃榭晌招阅ず筒豢晌招阅?臨床上常用的可降解 GBR 膜通?；诰埘セ蚰z原蛋白。聚酯基膜具有可控的降解速率和足夠的機械強度,有利于骨缺損區(qū)域成骨空間維持,然而,其降解產(chǎn)物可能引發(fā)局部炎癥反應(yīng),不利于骨組織的形成。而膠原基天然膜雖然具有優(yōu)異的生物相容性,但降解較快,且力學(xué)性能較差,可能會導(dǎo)致膜塌陷,影響成骨效果[6]。絲素蛋白是一種常見的天然高分子聚合物,因其免疫原性低、生物相容性優(yōu)異、降解性能可控,廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域[7]。

本實驗結(jié)合自蒸發(fā)技術(shù)和熱壓技術(shù),成功制備了具有優(yōu)異力學(xué)性能的可降解絲素蛋白基 GBR 膜。首先,利用自蒸發(fā)技術(shù)將絲素蛋白溶液制成平整光滑的膜材,并形成部分結(jié)晶。同時引入結(jié)合水來維持絲素蛋白的穩(wěn)定性,水分子與絲素蛋白中的氨基酸殘基通過氫鍵和靜電作用相互作用,有利于后續(xù) β-折疊的形成[8]。這種結(jié)合水的引入可以調(diào)節(jié)絲素蛋白的功能,使其具有一定的彈性和可伸縮性,從而有效提高其力學(xué)性能。其次,熱壓處理可以通過熱能的輸入和壓力的作用,使絲素蛋白中的亮氨酸和甘氨酸殘基之間的氫鍵重新組合,從而促進 β-折疊的形成[9]。同時,熱壓處理還可以改變絲素蛋白的分子排列和結(jié)晶度[10]。通過熱壓處理,絲素蛋白分子可以更加緊密地排列,形成更穩(wěn)定的結(jié)晶態(tài),有利于生成 β-折疊結(jié)構(gòu)。這為制備高模量和高強度的可降解絲素蛋白 GBR 膜提供了理論依據(jù)。

既往研究[11-12]表明,絲素蛋白可以促進骨細胞的增殖和分化。它通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和分泌,以及激活細胞內(nèi)信號通路來促進骨細胞的增殖和分化,從而促進新骨的形成[13]。體外生物相容性實驗結(jié)果顯示,實驗組與空白對照組結(jié)果無明顯差異,絲素蛋白基 GBR 膜在體外環(huán)境中不引起明顯的細胞毒性或不良反應(yīng),顯示出良好的生物相容性。絲素蛋白基 GBR 膜具有表面光滑且致密的結(jié)構(gòu),這種致密的結(jié)構(gòu)為膜提供了優(yōu)良的力學(xué)性能。力學(xué)拉伸實驗結(jié)果表明,在濕態(tài)下,絲素蛋白基 GBR 膜的抗拉強度可達 8.39 MPa,顯著高于市售 Bio-Gide 膠原膜的1.16 MPa[14]。以上實驗結(jié)果表明,絲素蛋白基 GBR 膜具有優(yōu)異的生物安全性,并且本研究所述蒸發(fā)-熱壓法,所得 GBR 膜的機械性能具有顯著優(yōu)勢。

綜上所述,本研究利用自蒸發(fā)技術(shù)和熱壓技術(shù)成功構(gòu)建了絲素蛋白基 GBR 膜,并對其微觀結(jié)構(gòu)、濕態(tài)下的力學(xué)性能、溶脹性能、降解性能、細胞相容性及細胞黏附能力等進行了探究。相關(guān)實驗結(jié)果顯示,所制備的絲素蛋白基 GBR 膜有望作為新型的 GBR 膜在臨床中應(yīng)用。而未來的研究需要進一步的體內(nèi)實驗證據(jù)和長期的生物相容性評估,從而深入探究絲素蛋白基 GBR 膜在骨組織工程中的應(yīng)用潛力,并進行更全面、系統(tǒng)的生物性能評價。