余焱霞，張 遠(yuǎn)，王艷玲，蔡亦紅

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫，合肥 230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032；3.安徽醫(yī)科大學(xué)人畜共患病安徽高校省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032）

肝細(xì)胞癌（hepatic carcinoma, HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占原發(fā)感染的90%以上，死亡率第二高，五年生存率約為51%[1]。目前，外科、放療、化學(xué)療法、生物療法和中藥是基本的綜合治療模式。由于肝癌的早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、毒性、耐藥等原因，肝癌的治療至今仍未得到解決。近年來，隨著人們對腫瘤流行病學(xué)、病原學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等諸多領(lǐng)域認(rèn)識的加深，生物治療越來越受到人們的重視。

腫瘤免疫治療可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，重建正常的免疫預(yù)警功能。具有靶向性強(qiáng)、毒性低、副作用小、可產(chǎn)生免疫記憶等優(yōu)點(diǎn)，對于治療腫瘤、防止腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有重要意義。 腫瘤微環(huán)境是一種復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，它包含著決定腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要因素。在腫瘤微環(huán)境中，多種免疫細(xì)胞參與調(diào)節(jié)，巨噬細(xì)胞（Mφ）在腫瘤發(fā)展的各個階段都大量存在，并發(fā)揮著重要作用，被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage, TAMs）。Mφ在多種趨化因子（如CCL2、M-CSF等）的影響下被募集到腫瘤組織中[2]。Mφ具有可塑性[3]，在不同的刺激因子下可以分化為M1和M2。其中，M1是通過經(jīng)典激活途徑得到的。它是由Th1細(xì)胞因子環(huán)境（如干擾素-γ，內(nèi)毒素（endotoxin）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α, TNF-α））誘導(dǎo)而來，M1型巨噬細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex II, MHCII），CD80和CD86的表達(dá)增強(qiáng)，并且具有很高的抗原呈遞能力[4-5]。高水平的促炎細(xì)胞因子（例如IL-12、TNF-α）是通過觸發(fā)呼吸暴發(fā)并釋放一氧化氮（NO）而分泌的，進(jìn)而起到殺死細(xì)胞內(nèi)病原體的作用。M2型是通過替代激活路徑獲得的。它由Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-10和IL-13）、清除劑受體（scavenger receptor）、甘露糖受體（CD206）和半乳糖受體（half Lactose receptor）高度表達(dá)，并合成精氨酸酶1（Arg1）。M2型細(xì)胞主要分泌IL-10和TGF-β1，它具有弱的抗原呈遞能力和腫瘤殺傷能力，并參與負(fù)向免疫調(diào)節(jié)。有研究表明，生物伴隨感染可通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長[6]。其中弓形蟲感染可通過誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答抑制LLC的增殖；感染弓形蟲Ⅱ型（ME49）的小鼠接種腫瘤細(xì)胞后，存活率顯著高于未感染弓形蟲的小鼠，CD8+T細(xì)胞、IFN-γ、血清IgG2a滴度顯著升高，腫瘤血管生成受到抑制[7]。

剛 地弓形蟲是一種機(jī)會性致病的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲[8]，包括Ⅰ型蟲株（RH株、GT1株等），Ⅱ型蟲株（PRU株、ME49株等）和Ⅲ型蟲株（CTG菌株等）。本實(shí)驗(yàn)室前期從貓和人體內(nèi)分離到51株弓形蟲。基因分型結(jié)果表明，80%分離株為Chinese1（ToxoDB#9）基因型。結(jié)合國內(nèi)其他學(xué)者對動物源菌株的基因分型結(jié)果，確定Chinese1為中國特有的弓形蟲顯性基因型[9-10]。弓形蟲速殖子的頂端有復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分泌細(xì)胞器[11]。弓形蟲速殖子主要有三種類型，它們分泌不同的寄生蟲蛋白，包括微線體蛋白（microneme protein, MIC）、棒狀體蛋白（rhoptry protein, ROP）和致密顆粒蛋白（dense granule protein, GRA）[12-13]。弓形蟲的基因分型和多態(tài)效應(yīng)分子的免疫調(diào)節(jié)是弓形蟲研究的新進(jìn)展，在本研究領(lǐng)域中具有重要意義。在抗弓形蟲感染過程中，細(xì)胞免疫起主導(dǎo)作用，Mφ是主要效應(yīng)細(xì)胞之一。不同基因型的蟲株誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生不同的偏移甚至極化趨勢，其中兩種多態(tài)性效應(yīng)分子起著重要作用：ROPs家族蛋白的成員ROP16和GRAs家族的成員GRA15[12]。與GRA15Ⅰ和GRA15Ⅱ相關(guān)的活性激酶有很多，它們可以直接激活宿主細(xì)胞NF-κB，驅(qū)動Mφ分化為M1，誘導(dǎo)IL-12高表達(dá)，NK細(xì)胞和T細(xì)胞分泌IFN-γ，從而引發(fā)Th1型免疫反應(yīng)。如果改變TAMs的極化方向，使M2型轉(zhuǎn)化為M1型，具有抗原呈遞能力，對抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是非常重要的。在治療方面，它可改善腫瘤患者的預(yù)后，這種方法已經(jīng)被證明是治療腫瘤的有效方法[14]。于是，我們猜測將弓形蟲和探索GRA15Ⅱ復(fù)極化，利用極化趨勢將M2還原為M1，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)并抑制腫瘤的增殖。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，GRA15Ⅱ可誘導(dǎo)M1型偏移，改善包括肝纖維化在內(nèi)的模型小鼠肝臟疾病的M2型顯性發(fā)病機(jī)制[15]。將過表達(dá)GRA15Ⅱ的Mφ注射入荷瘤小鼠后，腫瘤的生長受到了明顯的抑制[16]。在這項(xiàng)研究中，我們通過直接注射LV-gra15Ⅱ進(jìn)一步分析GRA15抑制腫瘤生長的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)蟲株、質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒感染 利用實(shí)時PCR（real time-PCR）法在PRU蟲株的總RNA中擴(kuò)增編碼TgGRA15II（缺失信號肽15 bp，http://ToxoDB.org）的開放閱讀框，獲得重組質(zhì)粒pEGFPgra15II，從而構(gòu)建重組慢病毒（lentivirus, L V）載體（LV-pEGFP-gra15II）[17]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6 購自中國上海科學(xué)院細(xì)胞庫。小鼠細(xì)胞系RAW264.7保存于本實(shí)驗(yàn)室。將200個PRU速殖子注入小鼠腹腔，分別于48、72、96和120 h麻醉處死小鼠。無菌條件下收集腹腔灌洗液，置于9 cm的培養(yǎng)皿中，用加入含有10%～15%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%的青霉素-鏈霉素混合液（penicillin-streptomycin solution）的DMEM（BI）培養(yǎng)基培養(yǎng)。3 h后沖洗掉非貼壁細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞計數(shù)為腹腔巨噬細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。其他細(xì)胞培養(yǎng)條件相同。

1.3 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染GRA15II的巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物（F4/80、CD11c+、CD206）。分別制備四組細(xì)胞（M1 LV-vector、M1 LVgra15II、M2 LV-vector、M2 LV-gra15II）作為單細(xì)胞懸液，用含1%胎牛血清的PBS洗滌，并將濃度調(diào)節(jié)至每100 μL中含1×106個細(xì)胞。所有細(xì)胞4℃避光孵育20 min，PBS洗滌兩次，通過流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)low Jo分析結(jié)果。

1.4 免疫組化分析 在麻醉?xiàng)l件下將腫瘤組織取出，并立即置于10%的中性甲醛緩沖溶液中。首先，在10 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）緩沖液高壓下進(jìn)行抗原回收。將回收樣本與F4/80、IFN-γ、IL-10、TNF-α及VEGF在4℃條件下過夜孵育。最后，加入二抗37℃條件下孵育45 min。拍攝明場并分析。

1.5 腫瘤模型 為了構(gòu)造皮下腫瘤模型，在小鼠右下腹股溝皮下注射含 3×106個hepa1-6細(xì)胞的生理鹽水。3 d后可捫及腫塊，腫瘤體積50 mm3。所有感染的小鼠都發(fā)現(xiàn)了腫瘤。30只小鼠隨機(jī)分為LVgra15II-Mφ、LV-Mφ和生理鹽水（NS）對照組，每組10只。接種后第3、5 d，第一組、第二組小鼠尾靜脈注射2.5×106個巨噬細(xì)胞，對照小鼠注射等體積的生理鹽水。接種后第3、5、7、10 d，用游標(biāo)卡尺和0.52*腫瘤長徑*腫瘤短徑測量腫瘤大小。10 d后，在對結(jié)果進(jìn)行分析之前，這些動物被實(shí)施安樂死處理。

1.6 RNA提取和實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）用TRIzol試劑提取LV-vector和LV-gra15II組的總RNA，按照Prime Script first Stand cDNA Synthesis Kit說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR預(yù)混ExTaq試劑盒進(jìn)行，qRT-PCR，檢測TNF-α、IL-12、IL-10和Arg1的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)使用的儀器是ABI Prism 7500。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，每個樣本重復(fù)3次，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。最后，通過2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

1.7 免疫印跡 在細(xì)胞中提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離。然后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，4℃孵育一抗（IKKβ、IκBα、p65及其相應(yīng)磷酸化蛋白）過夜，二抗孵育2 h，觀察條帶并分析。

1.8 酶聯(lián)免疫 將LV-gra15II-M1、LV-vector-M1、LV-gra15II-M2和LV-vector-M2分別接種于6孔板（每孔2×106細(xì)胞）中，加2 mL完全培養(yǎng)基，在37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。分別收集四組細(xì)胞上清液，并使用ELISA試劑盒分別測定IL-10、IL-12，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.9 共聚焦免疫熒光 解剖小鼠，獲取腫瘤組織，分離腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞[16]。貼壁6 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次。甲醛固定，透膜，封閉，一抗（p65）4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，封片，共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計方法使用非配對t檢驗(yàn)，統(tǒng)計學(xué)差異值用*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001，統(tǒng)計圖使用Graphpad Prism 6生成。

1.11 動物關(guān)懷和倫理聲明 C57BL/6雌性小鼠（6周齡）購自中國常州加文實(shí)驗(yàn)動物公司（生產(chǎn)許可證編號：scxk2013-003）。相關(guān)動物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目嚴(yán)格按照《中國衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》（1998年）并經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所機(jī)構(gòu)評審委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)證號：中國衛(wèi)生研究院生物醫(yī)學(xué)研究所批準(zhǔn)號：中國衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)號：AMU26-080610 1998年）執(zhí)行。在研究過程中，動物的痛苦被盡可能地減少。

2 結(jié)果

2.1 GRA15Ⅱ通過逆轉(zhuǎn)M2型向M1型變化抑制肝癌生長 實(shí)驗(yàn)策略具體如圖1A所示。在腫瘤微環(huán)境中，我們檢測到GRA15ⅡmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖1B）。結(jié)果顯示，通過比 較腫瘤體積大小，LVgra15Ⅱ處理組腫瘤生長明顯被抑制，且特異性清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞會抑制GRA15Ⅱ發(fā)揮抗腫瘤作用（圖1C），說明GRA15Ⅱ主要通過TAMs發(fā)揮作用，同時，LV-gra15Ⅱ并未顯著增加巨噬細(xì)胞在腫瘤中的駐留（圖1D）。

圖1 GRA15Ⅱ抑制小鼠肝癌生長需要巨噬細(xì)胞存在Fig.1 GRA15Ⅱ inhibited HCC growth requires the presence of macrophages in mice

前期為了檢測GRA15Ⅱ是否可以將腫瘤中的巨噬細(xì)胞重塑為M1型，我們檢測了LV-gra15Ⅱ處理腫瘤中M1和M2型巨噬細(xì)胞。已經(jīng)得出結(jié)果，LVgra15Ⅱ注射增加了小鼠腫瘤中CD11c + M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，而CD206+M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量則顯著減少。與巨噬細(xì)胞分型的分析一致，本次實(shí)驗(yàn)觀察到LV-gra15Ⅱ處理的F4/80+TAMs類中促炎基因TNF-α和IL-12上調(diào)，Vehicle和LV-vector組IL-12和TNF-α無差異；而Vehicle和LV-vector組的Arg1、IL-10的相對表達(dá)無差異，同時IL-10和Arg1（抗炎基因）下調(diào)（圖2B）。ELISA結(jié)果顯示，Vehicle和LV-vector組分泌差異不顯著，LV-gra15Ⅱ組TAMs分泌較高水平的促炎細(xì)胞因子（IL-12和NO）；而在LV-gra15Ⅱ注射小鼠中觀察到較低水平的IL-10（圖2C）。為了進(jìn)一步將腫瘤中的炎癥表達(dá)分類，我們通過免疫組織化學(xué)染色觀察了IFN-γ、IL-10、TNF-α和VEGF，結(jié)果顯示LV- gra15Ⅱ組的IFN-γ和TNF-α的陽性率顯著高于Vehicle和LV-vector組，而IL-10和VEGF的陽性率顯著低于Vehicle和LV-vector組（圖2D）?？傮w而言，通過GRA15Ⅱ重塑的TAMs在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生中起作用，GRA15Ⅱ可以促進(jìn)TAMs向M1型的復(fù)極化作用。

圖2 GRA15Ⅱ處理導(dǎo)致M2 型復(fù)極化為M1 型Fig.2 Treatment of GRA15Ⅱ results in reprogramming of M2-like TAMs to M1-like phenotype

2.2 GRA15Ⅱ可在體外重塑M2型為M1型 課題組前期研究報道[16]，GRA15Ⅱ可以將Mφ從M0極化到M1型。為了進(jìn)一步研究GRA15Ⅱ?qū)Ψ只腗φ的誘導(dǎo)作用，我們預(yù)先將M0刺激成為M1型或M2型，轉(zhuǎn)染LV-gra15Ⅱ后發(fā)現(xiàn)，GRA15Ⅱ不會影響巨噬細(xì)胞向M1的偏移，但可以誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞向M1偏移（圖3A）。進(jìn)一步驗(yàn)證，M1-LV-vector和M1-LV-gra15Ⅱ組的IL-12和TNF-α的表達(dá)無差異，而LV-gra15Ⅱ會誘 導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的IL-12和TNF-α的表達(dá)顯著升高，Arg1和IL-10的趨勢則相反（圖3B）。ELISA檢測結(jié)果顯示M1-LV-gra15Ⅱ與M1-LV-vector相比，IL-10、IL-12和NO分泌差別無顯著性意義，但是M2-LV-gra15Ⅱ組IL-12和NO分泌上調(diào)，IL-10下調(diào)（圖3C）。綜上，GRA15Ⅱ能夠誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞向M1偏移，但對M1型細(xì)胞無影響。

圖3 GRA15Ⅱ誘導(dǎo)M2 型向M1 型偏移而不影響M1 型巨噬細(xì)胞Fig.3 GRA15Ⅱ induces the repolarization of M2-like Mφ without aff ecting the M1 phenotype

2.3 GRA15Ⅱ可通過TRAF-6激活NF-κB通路 GRA15Ⅱ可以調(diào)節(jié)MEFs中的NF-κB通路，而沒有任何線索說明GRA15Ⅱ活性是NF-κB信號通路的組成部分[18]。接下來，我們試圖確定GRA15Ⅱ調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中NF-κB活化的具體機(jī)制。檢測到過表達(dá)GRA15Ⅱ蛋白作為成功感染的對照，未感染的細(xì)胞（未使用TNF-α刺激或僅使用TNF-α刺激）作為NF-κB活化的對照。我們觀察到在感染的細(xì)胞中，IKKβ、Iκ Bα和p65磷酸化水平均明顯上調(diào)且與LV-gra15Ⅱ、LV-vector或?qū)φ誐φ相比差別顯著。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在先天免疫系統(tǒng)的激活中起著至關(guān)重要的作用。它們通過白介素-1β（IL-1 receptor,IL-1R）、TNF-α等細(xì)胞因子與腫瘤壞死因子受體1（type 1 TNF receptor, TNF-R1）或Toll樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）的結(jié)合而被激活。為了驗(yàn)證GRA15Ⅱ與這些受體復(fù)合物的相互作用，我們研究了NF-κB信號通路中的蛋白質(zhì)。與未感染的細(xì)胞相比，在MyD88-/-、IRAK1-/-和RIP1-/-巨噬細(xì)胞中，GRA15Ⅱ誘導(dǎo)的p65磷酸化分別增加了3.2倍、6.4倍和6.2倍（數(shù)據(jù)未顯示）。但是GRA15Ⅱ在敲除TRAF6的細(xì)胞內(nèi)無法激活NF-κB通路（圖4A）。在荷瘤小鼠體內(nèi)，通過免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證，在腫瘤微環(huán)境中GRA15Ⅱ誘導(dǎo)p65發(fā)生核轉(zhuǎn)移，NF-κB通路被激活（圖4B）。

圖4 GRA15Ⅱ可上調(diào)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的 NF-κB 通路Fig.4 GRA15Ⅱ can increase tumor associated macrophage the NF-κB pathway

3 討論

剛地弓形蟲是一種具有全球重要性的胞內(nèi)原生動物寄生蟲，可顯著感染、存活和復(fù)制幾乎所有哺乳動物細(xì)胞。機(jī)體在抗弓形蟲感染過程中，細(xì) 胞免疫起主導(dǎo)作用，Mφ是主要效應(yīng)細(xì)胞之一。作為抗弓形蟲的第一道屏障，Mφ與弓形蟲感染、增殖和播散密切相關(guān)。Jesnsen等[12]發(fā)現(xiàn)，不同基因型的蟲株誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)Mφ向不同的方向偏移（bias），甚至極化（polarization），其中兩種多態(tài)性效應(yīng)分子發(fā)揮重要影響：ROPs家族的蛋白成員ROP16和GRAs家族蛋白成員GRA15，兩者均具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活性，同時具有基因型或蟲株的多態(tài)性。Yamamoto等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型蟲株的ROP16（ROP16II）的a.a503位點(diǎn)為絲氨酸，而Ⅰ/Ⅲ型蟲株的ROP16（ROP16I/III）的a.a503位點(diǎn)為亮氨酸。ROP16II無磷酸化STAT3/6的激酶活性，但ROP16I/III能夠磷酸化STAT3/6，驅(qū)動Mφ向M2極化，抑制IFN-γ表達(dá)，高表達(dá)精氨酸酶1（Arg1），誘導(dǎo)宿主Th2型免疫應(yīng)答。Rosowski[18]研究證明，Ⅰ型蟲株的GRA15（GRA15Ⅰ）基因序列長度為1908 bp，而Ⅱ型蟲株的GRA15（GRA15Ⅱ）序列長度只有1653 bp，GRA15Ⅰ的C末端存在aa290～312的移碼突變和aa312～635的323個氨基酸的大片段缺失，而GRA15Ⅱ在aa519～602位點(diǎn)之間存在84個氨基酸的缺失，除此之外，還存在5個氨基酸多態(tài)性和另外一種單氨基酸的插入缺失[18]。GRA15Ⅰ不具有激酶活性，而GRA15Ⅱ能夠直接激活宿主細(xì)胞的NFκB，驅(qū)動Mφ向M1極化，誘導(dǎo)IL-12高表達(dá)，刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞分泌IFN-γ，發(fā)揮Th1型免疫應(yīng)答。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在體外，LV-gra15Ⅱ轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，同時，向荷瘤小鼠回輸LVgra15Ⅱ轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞，能夠抑制肝細(xì)胞癌的生長[19]。本研究通過注射LV-gra15Ⅱ，觀察其對荷瘤小鼠的直接作用。分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，LV-gra15Ⅱ主要是通過感染巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其向M1偏移，其中IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生顯著增加，以及與腫瘤生長相關(guān)的細(xì)胞因子（如IL-10和VEGF）降低，腫瘤微環(huán)境中Th1免疫應(yīng)答被激活，腫瘤生長被抑制。這不僅與我們前期的研究結(jié)果一致，也促使我們進(jìn)一步探索GRA15Ⅱ通過何種信號通路發(fā)揮激活M1型巨噬細(xì)胞的作用[20]。

如前所述，弓形蟲發(fā)揮調(diào)控作用的信號通路之一是NF-κB通路，即NF-κB是弓形蟲免疫應(yīng)答的一個重要組成部分，它導(dǎo)致了參與宿主免疫的炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。有研究證明，Ⅱ型弓形蟲比Ⅰ型或Ⅲ型蟲株更能激活NF-κB，甚至，一些研究報道表明，Ⅰ型剛地弓形蟲株的感染在細(xì)胞因子TNF或TLR配體LPS刺激后，可抑制NF-κB的活化，且這種差異是GRA15Ⅱ?qū)е碌慕Y(jié)果。GRA15缺失的Ⅱ型菌株在NF-κB核易位和NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄上均存在嚴(yán)重缺陷。如在感染的HFF中，Ⅰ型蟲株通過減少p65/RelA的磷酸化和向細(xì)胞核易位來限制NF-κB的活化，其也抑制LPS誘導(dǎo)的原發(fā)性中性粒細(xì)胞IL-1β的產(chǎn)生，這種作用與NF-κB信號通路的抑制有關(guān)；在弓形蟲感染的中性粒細(xì)胞中，IκBα降解和p65/RelA磷酸化減少，IL-1β和炎癥小體傳感器NLRP3轉(zhuǎn)錄本也減少；弓形蟲也能抑制感染中性粒細(xì)胞中caspase-1的裂解和激活[21]。前期研究中，我們在微陣列數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)GRA15Ⅱ在荷瘤小鼠中，NF-κB信號通路明顯上調(diào)。NF-κB信號通路的激活主要通過三種途徑：經(jīng)典途徑、旁路途徑和非典型途徑。NF-κB1、RelA、c-Rel均由經(jīng)典通路激活，NFκB2、RelB由旁路激活，此外還可以通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF2/5/6）激活NF-κB等非典型途徑。致密顆 粒蛋白GRA15Ⅱ激活NF-κB通路，該通路在細(xì)胞死亡、先天免疫和炎癥中發(fā)揮重要作用，GRA15Ⅱ中TRAF結(jié)合位點(diǎn)的缺失極大地降低了其激活NF-κB通路的能力。GRA15Ⅱ激活p65的位置不依賴于MyD88或TRIF，這表明GRA15Ⅱ可以作用于這些蛋白的上游或與這些蛋白的復(fù)合體中，這對于TLR信號傳導(dǎo)是必不可少的。GRA15Ⅱ激活NF-κB通路的具體機(jī)制目前還未完全清楚。本研究中我們在巨噬細(xì)胞內(nèi)敲除MyD88、IRAK1、RIP1和TRAF6后發(fā)現(xiàn)GRA15Ⅱ在MyD88，IRAK1和RIP1敲除的細(xì)胞內(nèi)，仍能夠激活NF-κB途徑，但是在敲除TRAF6后，NF-κB途徑被抑制。這進(jìn)一步說明，GRA15Ⅱ激活NF-κB途徑，主要通過TRAF6途徑。下一步我們將通過免疫共沉淀法確認(rèn)GRA15Ⅱ是否能直接和TRAF6結(jié)合發(fā)揮作用。

綜上，GRA15Ⅱ在荷瘤小鼠中主要通過調(diào)控巨噬細(xì)胞TRAF6-NF-κB信號通路，誘導(dǎo)其向M1偏移，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，尚不清楚如何通過對全身免疫的影響來激發(fā)免疫監(jiān)視機(jī)制。需要進(jìn)一步的方法來分選腫瘤組織中的T（T-lymphocyte, T）淋巴細(xì)胞、樹突狀（dendritic cell, DC）細(xì)胞和自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞及其降低腫瘤大小的能力。

本研究發(fā)現(xiàn)GRA15Ⅱ作為弓形蟲的多肽效應(yīng)分子，可以通過調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的TRAF6-NFκB通路，誘導(dǎo)其向M1偏移，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。