柴文嫻，駱 歡，金 松，王 姣，羅堅(jiān)強(qiáng)，洪雅琴，耿拓宇，崔恒宓，胡序明

（1.常州市動物疫病預(yù)防控制中心，常州 213002；2.揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

巨噬細(xì)胞（macrophage）是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)晚期分化細(xì)胞，由骨髓造血祖細(xì)胞發(fā)育分化釋放進(jìn)入外周血。作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，巨噬細(xì)胞在抵抗病原微生物感染過程中具有關(guān)鍵作用。

近年來，長非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）作為非編碼RNA的重要家族成員在巨噬細(xì)胞天然免疫中的作用也逐漸被認(rèn)識[1-2]。早期研究發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞后引起lncRNA異常表達(dá)，隨后證實(shí)這些lncRNA與小鼠肺部的病毒感染、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活密切相關(guān)[3]。在人和鼠巨噬細(xì)胞中，lncRNA-Cox2和THRIL對調(diào)節(jié)TLR2信號起著關(guān)鍵作用。值得注意的是，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retroviruses, ERVs）也是宿主lncRNAs的重要來源之一。在小鼠巨噬細(xì)胞中鑒定了1278個全長ERVs來源的lncRNAs，其中l(wèi)nc-EPAV已被證明可以增強(qiáng)宿主的抗病毒天然免疫應(yīng)答[4]。因此，源自內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的lncRNAs可能是巨噬細(xì)胞參與抗病毒免疫反應(yīng)的重要組成部分。

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒是遠(yuǎn)古反轉(zhuǎn)錄病毒感染時留下的痕跡，不僅對早期胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞具有重要作用，還可能與宿主免疫應(yīng)答有關(guān)。目前，在雞基因組中已鑒定出多種類型的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒，但其基因組結(jié)構(gòu)都與禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）類似[5]。其中，已鑒定雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1定位于雞1號染色體[6]，且受到DNA甲基化調(diào)控[7]。研究表明，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1衍生的長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1與宿主遺傳抗性有關(guān)[8]，并且能夠在雞胚成纖維細(xì)胞中激活抗病毒天然免疫反應(yīng)[9]。然而，關(guān)于lnc-ALVE1-AS1在雞免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞細(xì)胞中的抗病毒功能及其作用機(jī)制尚不清楚。

為了進(jìn)一步探索lnc-ALVE1-AS1在雞巨噬細(xì)胞中的抗病毒作用及其機(jī)制，本研究通過抗病毒實(shí)驗(yàn)分析了lnc-ALVE1-AS1對巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫和ALV-J病毒增殖能力的影響，并初步探索了lnc-ALVE1-AS1在巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究lnc-ALVE1-AS1在巨噬細(xì)胞中的抗病毒功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和病毒 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；雞巨噬細(xì)胞系（HD11）和J亞群禽白血病病毒（ALV-J）JS09GY3毒株由揚(yáng)州大學(xué)秦愛建教授饋贈。

1.2 主要試劑 RNA-easy Isolation Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)和熒光染料ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent購自美國T hermo Fisher Scientific公司；Amlexanox（TBK1/IKKε inhibitor）購自美國InvivoGen公司；雞TLR3抗體購自美國Novus Biologicals公司；山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?488）購自英國Abcam公司；lncRNA FISH Probe Mix購自廣州銳博生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 所有引物采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)并委托Thermo Fisher Scientific公司合成，引物序列如表1所示。

表1 本研究所使用的qPCR 引物Table 1 The qPCR primers used in this study

1.4 ALV-J感染HD11后lnc-ALVE1-AS1的表達(dá)檢測 雞巨噬細(xì)胞系HD11細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，按照病毒感染復(fù)數(shù)MOI=5感染ALV-J（毒株JS09GY3）。病毒感染細(xì)胞后6、12和24 h分別收集細(xì)胞。然后，按照RNA-easy Isolation Reagent說明書提取總RNA。接下來，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。cDNA產(chǎn)物稀釋后通過Bio-Rad公司CFX ConnectTM實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，SYBR Green Ⅱ 10 μL，上、下游引物各2 μL，無RNA酶水5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環(huán)。檢測基因?yàn)閘nc-ALVE1-AS1，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

1.5 長非編碼RNAlnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞后ALV-J增殖能力的檢測 HD11細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板后感染ALV-J（毒株JS09GY3）（MOI=5）。病毒感染后4 h，根據(jù)Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent說明書分別將pcDNA3.1-lnc-ALVE-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-GFP（2 μg）重組真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細(xì)胞。病毒感染后48 h，收集上清液，按照IDEXX禽白血病抗原檢測試劑盒的操作步驟，ELISA檢測細(xì)胞上清中ALV-J p27蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞上清中的ALV-J效價檢測通過間接免疫熒光分析后計(jì)算出ALV-J的TCID50。同時，收集細(xì)胞并提取總RNA，并按照材料與方法1.4所述步驟檢測lnc-ALVE1-AS1和ALV-J囊膜基因env表達(dá)水平。

1.6 長非編碼RNAlnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞后天然免疫基因表達(dá)的檢測 HD11細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，根據(jù)Lipof ectamine? 3000 Transfection Reagent說明書分別將pcDNA3.1-lnc-ALVE-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-GFP（2 μg）重組真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細(xì)胞。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36 h收集細(xì)胞并提取總RNA，并按照材料與方法1.4所述步驟檢測TLR3、IRF7、IFN-α、IFN-β、MX1、OASL和IFITM3表達(dá)水平。

1.7 長非編碼RNAlnc-ALVE-AS1誘導(dǎo)TLR3信號分析

1.7.1 TLR3干擾后lnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞天然免疫基因表達(dá)的檢測 針對雞TLR3序列（NM_001011691.3），由Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計(jì)合成兩對RNA干擾序列，具體序列如下：TLR3_Stealth_1 S：5'-CCGAGUACAGCAAUCUGAU UUACUU-3'；TLR3_Stealth_1 AS：5'-AAGUAA AUCAGAUUGCUGUACUCGG-3'；TLR3_Stealth_2 S：5'-CAGCAAAUUUAGGAUUGCAGCAACA-3'；TLR3_Stealth_2 AS：5'-UGUUGCUGCAAUCC UAAAUUUGCUG-3'。

H D 1 1 細(xì)胞 接種6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，按照Lipofectamine? RNAiMAX Transfection Reagent說明書進(jìn)行TLR3 siRNA轉(zhuǎn)染。TLR3 siRNA轉(zhuǎn)染后12 h轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1，具體步驟按照Lipofectamine?3000 Transfection Reagent說明書進(jìn)行，lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后36 h收集細(xì)胞并提取總RNA。然后，按照材料與方法1.4所述步驟檢測Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達(dá)水平。

1.7.2 TLR3下游信號抑制后lnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞天然免疫基因表達(dá)的檢測 TLR3下游TBK1/IKKε抑制劑Amlexanox（InvivoGen，處理濃度100 μmol/L）作用HD11細(xì)胞2 h后轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h收集細(xì)胞并提取總RNA。然后，按照材料與方法1.4所述步驟檢測Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達(dá)水平。

1.7.3 lnc-ALVE1-AS1與TLR3共定位分析 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1和TLR3蛋白在HD11細(xì)胞內(nèi)的共定位通過RNA FISH（Fluorescence in situ Hybridization）實(shí)驗(yàn)來確定。靶向lnc-ALVE1-AS1全長序列l(wèi)ncRNA FISH Probe Mix由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。首先，參照RiboTMFluorescent In Situ Hybridization Kit說明書將lnc-ALVE1-AS1探針過夜雜交后分別進(jìn)行雞TLR3抗體（Novus Biologicals，NBP2-24565）和山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?488）孵育。然后，加入DAPI染色液，染色10 min。避光條件下，從孔中小心取出細(xì)胞爬片，用封片劑將其固定于載玻片上，最后，通過Leica SP8共聚焦熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)分 析與作圖 用SPSS軟件（version 19.0）和Excel GraphPad（Prism 5）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以t檢 驗(yàn)比較組間差異并以Mean±SEM表示，*表示差 異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 ALV-J感染HD11后lnc-ALVE1-AS1的表達(dá)檢測結(jié)果 首先分析了lnc-ALVE-AS1在ALV-J感染雞巨噬細(xì)胞系HD11中的表達(dá)規(guī)律。與未感染ALV-J的對照組相比，lnc-ALVE1-AS1在ALV-J感染HD11細(xì)胞12 h和24 h后持續(xù)下調(diào)。并且，在感染后24 h顯著下調(diào)（圖1）。

圖1 lnc-ALVE-AS1 在ALV-J 感染HD11 細(xì)胞的表達(dá)檢測結(jié)果Fig.1 Expression detection results of lnc-ALVE-AS1 in ALV-J infected HD11 cells

2.2 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞后ALV-J增殖能力的檢測結(jié)果 既然ALV-J在感染巨噬細(xì)胞過程中抑制lnc-ALVE1-AS1表達(dá)，那么意味著lnc-ALVE1-AS1可能具有抵抗ALV-J增殖的能力。由此，進(jìn)一步觀察lnc-ALVE1-AS1對ALV-J增殖的影響。結(jié)果顯示：與GFP對照組相比，ALV-Jenv基因mRNA表達(dá)水平在lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染后48 h的HD11細(xì)胞顯著下調(diào)（圖2A，2B）。同時，過表達(dá)lnc-ALVE1-AS1也顯著減少細(xì)胞上清液中ALV-J p27蛋白表達(dá)（圖2C）。與此結(jié)果一致的是，與對照組相比，HD11上清中的ALV-J的病毒效價在lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染后48 h明顯減少（圖2D）。這些結(jié)果證實(shí)了過表達(dá)lnc-ALVE1-AS1可以顯著抑制ALV-J在雞巨噬細(xì)胞HD11中增殖。

圖2 長非編碼RNA lnc-ALVE-AS1 轉(zhuǎn)染HD11 細(xì)胞后lnc-ALVE-AS1（A）表達(dá)以及ALV-J 增殖能力的RT-qPCR（B）、ELISA（C）和TCID50（D）檢測結(jié)果Fig.2 Expression detection results of lnc-ALVE-AS1(A) as well as RT-qPCR (B), ELISA (C) and TCID50 (D) for ALV-J proliferation after HD11 cells were transfected with long coding RNA lnc-ALVE-AS1

2.3 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞后天然免疫基因表達(dá)的檢測結(jié)果 既然lnc-ALVE-AS1可以抑制ALV-J在HD11細(xì)胞中增殖，那么過表達(dá)lnc-ALVE1-AS1應(yīng)該可以激活抗病毒天然免疫基因表達(dá)。如圖3所示，過表達(dá)lnc-ALVE1-AS1顯著上調(diào)dsRN A識別受體TLR3和Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）在HD11細(xì)胞中表達(dá)（圖3）。另外，lnc-ALVE1-AS1也誘導(dǎo)其他抗病毒天然免疫基因（IRF7、MX1、OASL和IFITM3）在HD11細(xì)胞中表達(dá)。這說明lnc-ALVE1-AS1可以激活HD11細(xì)胞抗病毒天然免疫。

圖3 長非編碼RNA lnc-ALVE-AS1 轉(zhuǎn)染HD11 細(xì)胞后天然免疫基因表達(dá)的檢測結(jié)果Fig.3 Expression detection results of innate immune genes in HD11 cells transfected with the plasmid pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1

2.4 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1誘導(dǎo)TLR3信號分析結(jié)果 值得注意的是，lnc-ALVE-AS1顯著激活TLR3及其下游Ⅰ型干擾素在HD11細(xì)胞中的表達(dá)，這說明TLR3信號可能是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒天然免疫的一個重要途徑。首先，通過干擾TLR3表達(dá)后再轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1，與對照組相比，干擾TLR3后顯著抑制lnc-ALVE1-AS1誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達(dá)（圖4A）。接下來，通過TLR3信號抑制 劑Amlexanox（TBK1/IKKε inhibitor）阻斷TLR3-TRIF-TBK1/IKKε-TypeⅠinterferons信號通路2 h后，再轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1。結(jié)果顯示：與對照組相比，Amlexanox處理后也顯著抑制了lnc-ALVE1-AS1誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）表達(dá)（圖4B）。最后，通過共定位實(shí)驗(yàn)觀察到lnc-ALVE1-AS1可以與TLR3蛋白直接相互作用（圖4C）。這說明lnc-ALVE1-AS1可能通過TLR3信號激活HD11細(xì)胞抗病毒天然免疫。

圖4 長非編碼RNA lnc-ALVE-AS1 誘導(dǎo)TLR3 信號分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of induction of TLR3 signals by long non-coding RNA lnc-ALVE-AS1

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在雞巨噬細(xì)胞中增殖。在小鼠巨噬細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的長非編碼RNA lnc-EPAV可以增強(qiáng)宿主的抗病毒免疫并抑制病毒增殖[4]。另外，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE衍生的piRNA可能參與抵抗禽白血病病毒[10]。因此，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE衍生的非編碼RNA如lncRNA和piRNA可能是細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要組成部分以增強(qiáng)宿主抵抗外源性病毒感染。

通過激活TLR3信號介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素應(yīng)答可能是lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在巨噬細(xì)胞中增殖的一個重要機(jī)制。過表達(dá)lnc-ALVE1-AS1顯著激活TLR3和Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）等抗病毒天然免疫基因表達(dá)。然而，lnc-ALVE1-AS1這種能力在干擾TLR3或者抑制TLR3信號后顯著減弱。共聚焦定位分析顯示在巨噬細(xì)胞中l(wèi)nc-ALVE1-AS1可以與TLR3蛋白直接結(jié)合。此外，研究也發(fā)現(xiàn)TLR3配體刺激會誘導(dǎo)大量lncRNAs異常表達(dá)[11]，暗示lncRNA可作為TLR3識別信號和天然免疫的調(diào)節(jié)因子[12]。這些結(jié)果說明誘導(dǎo)TLR3信號是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒天然免疫的一個重要機(jī)制。

研究表明，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的RNA能夠被TLR3蛋白識別并激活抗病毒天然免疫。TLR3是一個重要的細(xì)胞內(nèi)雙鏈 RNA（Double stranded RNA,dsRNA）識別受體并參與抗病毒反應(yīng)[13]。在哺乳動物中，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA可以通過識別受體TLR3觸發(fā)信號傳導(dǎo)以增強(qiáng)干擾素應(yīng)答[14-16]。關(guān)鍵的dsRNA識別受體TLR3在lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)，說明dsRNA可能是lnc-ALVE1-AS1發(fā)揮作用的一個重要因素。長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1是一個反義lncRNAs，可能與其序列互補(bǔ)的正義RNA形成dsRNA。另外，lnc-ALVE1-AS1自身結(jié)構(gòu)中可能形成一些短dsRNA片段。這些dsRNA可以被TLR3識別并激活抗病毒天然免疫。這種行為類似于去甲基化抑制劑5-Aza-dC通過激活源自內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒dsRNA來誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答反應(yīng)[14-15]。除了識別dsRNA，TLR3還可以識別病毒衍生的帶有凸起/內(nèi)環(huán)的莖結(jié)構(gòu)的單鏈RNA片段[17-18]。生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)lnc-ALVE1-AS1可以形成許多帶有凸起/內(nèi)環(huán)的莖結(jié)構(gòu)，這些獨(dú)特的RNA結(jié)構(gòu)可能被TLR3識別。然而，關(guān)于lnc-ALVE1-AS1如何調(diào)節(jié)TLR3的機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究揭示了長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1在巨噬細(xì)胞中抗病毒功能及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在巨噬細(xì)胞中的抗病毒功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。