蔡鴻明，張 敏，呂麗蕾，姜一峰，高 飛，虞凌雪，童 武，李麗薇，李國新，周艷君，劉長龍，童光志

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院（蜂學學院），福州 350002；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）會可引起豬特別是新生仔豬的嘔吐、腹瀉和食欲下降，發(fā)病率和死亡率高[1]。PEDV感染會導致明顯的腸絨毛萎縮，體內(nèi)腸細胞磷酸酶活性下降，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收受限，腸腔內(nèi)堆積大量液體，小腸組織出血充血呈半透明狀，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大[2-3]。

對于PEDV的研究，有研究人員將仔豬來源的小腸上皮細胞引入人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transciptase, HTERT）基因而獲得永生化的豬小腸上皮傳代細胞系（Intestinal epithelial cells, IECs）[4]。然而，只有一種非轉(zhuǎn)化、非致瘤性豬空腸上皮細胞系IPEC-J2，被用于研究PEDV如何拮抗宿主細胞的抗病毒活性[5]。但是，有研究表明由于IPEC-J2的異質(zhì)性強，PEDV感染該細胞系的效率非常低[6]。2019年，李慧春等[7]將PEDV用于感染豬原代IECs，1 d時間即可見明顯的細胞病變。

腸道類器官可以生成多種腸上皮類型細胞，已經(jīng)廣泛用于包括遺傳性疾病、惡性腫瘤等多種疾病模型研究[8-9]。與傳統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)化細胞株模型不同，腸道類器官接近在活體生物體內(nèi)的生理狀態(tài)，可以更為直觀的展示了宿主與病毒的相互作用，代表了腸道冠狀病毒感染腸上皮的一種新的理想模型[10-12]。但是，類器官作為病毒感染模型應用的研究較少，主要是因為類器官培養(yǎng)方法、感染方法、3D細胞熒光染色成像、基因編輯等技術(shù)還是存在一定難度，限制了類器官感染模型的應用發(fā)展，特別是在獸醫(yī)研究領域應用的更少。

本研究首先分離了PEDV的毒株，命名為PEDV SD株，設計了PCR引物，分6個片段快速擴增，獲得了PEDV SD株的全基因組序列。并且從仔豬小腸成功分離了豬小腸隱窩組織，在體外培養(yǎng)成豬小腸類器官，使用PEDV SD株感染腸道類器官試驗，通過對感染后的3D類器官和2D類器官細胞進行免疫熒光試驗，證明了PEDV可以很好的感染豬小腸類器官，為PEDV致病機制的研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑 試驗病料采自于山東PEDV發(fā)病豬場，病料經(jīng)PEDV檢測為陽性；DMEM細胞培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA、1×PBS、胎牛血清FBS、TrypLETMExpress購自Gibco公司；腸類器官培養(yǎng)基由本實驗室配方自行配制；QIAamp?Viral RNA Mini KIT購自QIAGEN公司；E.Z.N.?Gel Extraction Kit 購自OMEGA公司；Prime Script Ⅱ lst Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeStar GXL、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司；鼠抗PEDV N蛋白單克隆抗體由本實驗室保存；山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488二抗購自Thermo公司；基質(zhì)膠Matrigel購自Corning公司；Vero細胞由本實驗室保存。

1.2 樣品處理、病毒分離培養(yǎng) 將發(fā)病仔豬的腸內(nèi)容物用PBS和雙抗稀釋后離心，用0.22 μm的濾器過濾，放于-80℃冰箱保存。傳代Vero細胞，至細胞長滿時，以一定的劑量接種到Vero細胞培養(yǎng)，并盲傳3代，等細胞出現(xiàn)病變，收取病毒液，凍存于-80℃?zhèn)溆?。利用PEDV N蛋白通過IFA實驗檢測PEDV在Vero細胞上的增殖情況。

1.3 樣品RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA 按照QIAamp?Viral RNA Mini KIT說明書提取樣品中RNA。按照Prime Script Ⅱ lst Strand cDNA Synthesis Kit說明書對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的程序為：42℃水浴1 h，70℃反應15 min，將產(chǎn)物置于-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PEDV SD株全基因組擴增、克隆及序列測定根據(jù)NCBI上PEDV的全基因序列設計擴增引物（表1），擴增病毒全長序列。以1.3步驟反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，使用PrimeStar GXL聚合酶，按說明書對分離病毒全基因進行分段擴增。用膠回收試劑盒回收并純化鑒定正確的目的條帶。將純化產(chǎn)物與T載體連接、轉(zhuǎn)化、涂板、經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色陽性菌落送至上海擎科生物公司進行測序。

表1 PEDV SD 株全基因組測序所用引物Table 1 Primers used for whole genome sequencing of PEDV SD strain

表2 PEDV SD 株全基因組核苷酸同源性比較（%）Table 2 Comparison of genome-wide nucleotide homology in PEDV SD strain (%)

表3 PEDV SD 株S 基因核苷酸同源性比較（%）Table 3 Comparison of the nucleotide homology of the PEDV SD strain S genes (%)

1.5 PEDV SD株全基因、S基因序列比對 利用DNAStar軟件對全基因組測序結(jié)果進行拼接比對。拼接完的全基因組序列、S基因序列與NCBI上國內(nèi)外40株PEDV的參考毒株序列進行遺傳進化分析，構(gòu)建遺傳進化樹。

1.6 豬小腸3D類器官分離及培養(yǎng) 取10日齡仔豬小腸組織剝離腸內(nèi)容物，PBS清洗處理后將腸道組織剪碎并用2.5 mmol/L的EDTA消化1 h，將分離到的小腸隱窩包埋在細胞基質(zhì)Matrigel中，待細胞基質(zhì)凝固后，加入1 mL的類器官培養(yǎng)液[13]。培養(yǎng)至第7 d，類器官中央變大變黑，可以進行傳代。傳代時，棄去培養(yǎng)板中的上清液，用普通培養(yǎng)基吹打下來沉淀，500 ×g離心4 min，棄去上清液。向類器官沉淀中加入1 mL TrypLE消化類器官，消化5～10 min，并用1 mL的槍頭吹打幾次將類器官打散，然后加入培養(yǎng)基稀釋TrypLE，500 ×g離心4 min去上清液，重新用細胞基質(zhì)Matrigel重懸消化過的類器官，鋪至24孔板上，10 min后待細胞基質(zhì)凝固后加適量的類器官培養(yǎng)基。

1.7 2D類器官細胞的培養(yǎng) 3D類器官培養(yǎng)至6 d左右，用TrypLE消化2 min成單細胞后，加入到6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)2～3 d即可見2D形狀的豬腸道類器官細胞。

1.8 病毒感染類器官 收集24孔板中生長狀況良好的3D類器官細胞去除基質(zhì)膠后，添加適量的病毒液。4 h后，重新用基質(zhì)膠將細胞鋪至24孔板中培養(yǎng)24 h。12孔板中生長良好的2D小腸類器官細胞，按照常規(guī)的PEDV接種方法接毒2 h后進行換液并培養(yǎng)24 h。

1.9 3D類器官和2D類器官細胞的熒光成像 3D類器官或2D的類器官細胞感染PEDV后48 h后，分別收集相應的3D類器官和2D類器官細胞，用4%多聚甲醛溶液在4℃下固定3D類器官或2D類器官細胞45 min，Triton X-100通透20 min后，進行一抗、二抗孵育，DAPI染核色5 min，在熒光顯微鏡下拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 PEDV SD株的分離鑒定 用分離的病毒液感染Vero細胞，24 h后，接毒組開始出現(xiàn)多核、皺縮、脫落等病變（圖1）。熒光視野下，與對照組相比，接毒組出現(xiàn)明顯的多核包體、熒光信號強，進一步證實了該分離株為PEDV。將分離株命名為PEDV SD株（圖2）。

圖1 PEDV SD 株感染Vero 細胞病變觀察結(jié)果Fig.1 Observation of PEDV SD strain infection with Vero cells

圖2 Vero 細胞的間接熒光免疫檢測結(jié)果Fig.2 Results of indirect f luorescence immunodetection of Vero cells

2.2 PEDV SD株全基因測序 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以表1序列為引物，成功擴增出PEDV SD株的全基因組DNA片段，鑒定結(jié)果與預期大小相符（圖3）。利用DNAStar對測序結(jié)果進行拼接，獲得PEDV SD株的全基因組序列，并提交至GenBank，登錄號為MZ596343.1。

圖3 PEDV SD 株的全基因組PCR 擴增結(jié)果Fig.3 Results of the genome-wide PCR amplif ication of PEDV SD strain

2.3 PEDV SD株全基因組序列進化樹分析 利用MEGA 6.0軟件繪制PEDV SD株與國內(nèi)外40株PEDV的全基因組、S基因序列的系統(tǒng)進化樹，分析其與其他毒株的遺傳進化關系（圖4）。LEE等[14]根據(jù)S基因序列，將PEDV分為Gl和G2兩個分支。其中Gl經(jīng)典毒株亞群分為Gla和G1b，G2變異毒株亞群分為G2a和G2b。Gla包括經(jīng)典毒株SM98、CV777等毒株；Glb包括DR13-attenuated、DR13-2003韓國毒株。根據(jù)遺傳進化分析結(jié)果，我們可以看到PEDV SD株屬于經(jīng)典毒株的G1b分支，與同分支參考亞群的同源性高，普遍大于97%，與DR13-2003韓國毒株全基因同源性也有97.4%，與G1a分支經(jīng)典毒株CV777則為96.8%，與G2b分支17-GXCZ-2020同源性只有95.4%?；赟基因序列比對，結(jié)果顯示與全基因序列比對具有一致性，分支內(nèi)同源性高于99%，而與CV777只有96.4%，17-GXCZ-2020為95.3%。

圖4 PEDV SD 株 S 基因和全基因組核苷酸遺傳進化分析Fig.4 PEDV SD strain S gene and genome-wide nucleotide genetic evolution analysis

2.4 腸道3D類器官細胞的培養(yǎng) 3D腸道類器官細胞生長狀況良好。傳代1 d后的類器官細胞已形成圓形結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)第3 d，腸道干細胞增殖并分化為囊狀球狀體結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)至7 d左右的類器官中央變大變黑時可以進行傳代培養(yǎng)（圖5）。

圖5 小腸類器官細胞傳代過程中的形態(tài)學變化Fig.5 Morphological changes in diff erent passage of small intestinal organoids

2.5 PEDV SD株感染類器官細胞 在感染24 h時收集3D和2D類器官、固定、染色。在熒光視野下，可以看到接毒組的類器官細胞有明顯的熒光信號，表明PEDV SD株感染了類器官的細胞（圖6，圖7）。

圖6 2D 類器官細胞的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig.6 Results of indirect immunof luorescence detection of cells from 2D organoids

圖7 3D 類器官細胞的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig.7 Results of indirect immunof luorescence detection of cells from 3D organoids

3 討論

PEDV屬于冠狀病毒屬，基因組全長28 kb，傳統(tǒng)全基因組測序需要設計10～20對引物才能擴增得到病毒的全基因。本研究設計了6對引物并成功擴增得到病毒28 kb基因組序列，完成病毒快速全基因組擴增及測序。從遺傳進化樹結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEDV SD株屬于經(jīng)典毒株的G1b分支，存在與經(jīng)典毒株類似的氨基酸插入、缺失位點，再次證明臨床上仍然存在經(jīng)典PEDV的流行，提示在PEDV的免疫防控上要做到經(jīng)典毒株與變異毒株的兼顧。

本研究分離了豬腸道隱窩干細胞并在體外培養(yǎng)分化成腸類器官，使用PEDV SD株感染類器官，建立了PEDV感染豬小腸類器官試驗模型。3D類器官熒光染色一直較為困難，特別是病毒感染的熒光染色，對染色方法和拍攝顯微鏡有較高的要求，本實驗通過多次試驗成功完成了3D類器官細胞的熒光染色及拍照，并且通過3D熒光成像重現(xiàn)了體內(nèi)豬腸道中PEDV地感染，完善了豬小腸類器官試驗模型中PEDV感染細胞和免疫熒光試驗的方法，為PEDV感染豬腸道的研究提供了良好的體外模型。

本項目基于國內(nèi)外的文獻報道，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來建立可在體外長期傳代培養(yǎng)的豬腸道類器官，為PEDV的研究提供新的研究模型，突破了一直以來制約PEDV體外研究的瓶頸?；趯υ撃Ｐ偷难芯靠赡軙铀僦荚诟纳颇c道健康的獸醫(yī)療法的設計，從而為目前的冠狀病毒疾病的治療防控提供了新的理論指導，也是對現(xiàn)有PEDV機制的進一步生物學認識進行了擴展。