鄺一深 綜述 李祥偉 審校

近年來,石墨烯及其衍生物憑借其獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能被廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)藥載體、腫瘤治療及組織工程等領(lǐng)域。其中,組織工程是利用干細(xì)胞、生長因子和支架修復(fù)組織缺損并恢復(fù)組織生理功能的過程。支架支持干細(xì)胞特異性分化為骨、血管和神經(jīng)等組織,因此,支架在組織工程中具有至關(guān)重要的作用。石墨烯及其衍生物被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。本文對石墨烯及其衍生物的理化性質(zhì)和生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 石墨烯(Gp)的理化性質(zhì)

石墨由蜂窩狀的平面碳原子層層有序排列堆疊而成,而石墨烯是通過機(jī)械分離方法從石墨中分離出來,是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角型平面多環(huán)芳香烴原子晶體[1],也是世界上最薄(只有一個(gè)碳原子厚度)、最堅(jiān)硬的平面薄膜納米材料[2],具有高導(dǎo)熱系數(shù)、高電子遷移率、低電阻率、高機(jī)械強(qiáng)度、高比表面積和低密度等特點(diǎn)[3]。同時(shí),石墨烯具有良好的力學(xué)性能,彈性模量達(dá)到1 TPa,壓縮強(qiáng)度為45 GPa,是理想的高強(qiáng)度材料[4],因此,在電子、航天、光學(xué)、力學(xué)和儲能等領(lǐng)域,石墨烯具有廣闊的應(yīng)用前景。

石墨烯的衍生物有氧化型 (G0)、還原型(rG0)、氟化型和氮化型石墨烯等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,研究和應(yīng)用較多的是氧化石墨烯,因其表面帶有大量親水性含氧官能團(tuán),具有良好的生物相容性和溶液中穩(wěn)定性[5],同時(shí),通過化學(xué)修飾石墨烯,產(chǎn)物具有更多功能而被應(yīng)用于更多領(lǐng)域[6]。石墨烯及其衍生物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注,由于獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì),常被應(yīng)用于基因或藥物載體構(gòu)建、生物檢測、腫瘤治療、抗菌材料研制和組織工程等方面[7-8]。

2 石墨烯及其衍生物的改性修飾和作用

與不同材料結(jié)合后,石墨烯及其衍生物的修飾產(chǎn)物的性質(zhì)會得到進(jìn)一步優(yōu)化,與金屬納米顆?；蛴袡C(jī)材料結(jié)合可增強(qiáng)抑菌、改善物理性質(zhì)和生物相容性等。

2.1 石墨烯及其衍生物與金屬納米顆粒復(fù)合

有研究者利用石墨烯/氧化鋅(GZNC)納米復(fù)合材料構(gòu)建種植體涂層,研究表明,GZNC可有效抑制種植體周圍形成生物膜、降低變形鏈球菌的致齲性和納米復(fù)合材料的毒性,因此,GZNC可成為一種抗菌性種植體涂層材料。如將GZNC應(yīng)用于臨床,還需要明確涂層的穩(wěn)定性[9]。氧化石墨烯-銀(GO-Ag)和 L-半胱氨酸功能化修飾氧化石墨烯(GO-L-cys-Ag)納米復(fù)合材料在非常低的劑量下,對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有較高的抗菌效果。進(jìn)一步研究表明,GO-Ag 和 GO-L-cys-Ag對革蘭氏陰性菌的殺菌機(jī)制是該復(fù)合材料破壞細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的完整性,而對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌作用機(jī)制則是抑制細(xì)菌細(xì)胞的分裂[10]。鈦表面氧化石墨烯攜載鹽酸米諾環(huán)素涂層(M@GO-Ti)表現(xiàn)出緩釋特征,并對需氧菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制作用,對兼性厭氧菌和厭氧菌具有觸殺和釋殺的協(xié)同作用。同時(shí),在體外,可促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞(HGF)增殖,這說明在有金黃色葡萄球菌存在的情況下,人牙齦成纖維細(xì)胞在M@GO-Ti 具有較高的細(xì)胞黏附效率,這對臨床種植修復(fù)具有重要意義[11],有望應(yīng)用該材料促進(jìn)種植體周圍良好的軟組織封閉作用。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)微弧氧化的鈦合金結(jié)合1.0 mg/mL氧化石墨烯復(fù)合物(Ti-MAO-1.0 mg/mL GO)可以顯著增強(qiáng)人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在Ti表面的黏附、增殖和牙源性分化,該復(fù)合材料也具有抗菌活性。微弧氧化(MAO) 涂層具有多層、多孔結(jié)構(gòu), 結(jié)合GO的物理和化學(xué)性質(zhì)有助于封閉牙髓環(huán)境和修復(fù)牙體結(jié)構(gòu),具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[12],可作為封閉牙髓再生環(huán)境和恢復(fù)牙體合面咬合形態(tài)的修復(fù)材料。

2.2 石墨烯及其衍生物與有機(jī)功能結(jié)構(gòu)的復(fù)合

與羥基磷灰石(hydroxylapatite, HA) 相比,還原型氧化石墨烯/氟羥基磷灰石(rGO/FHA)復(fù)合材料的硬度和斷裂韌性分別提高了86% 和137%。進(jìn)一步研究證實(shí), rGO和F-離子的共同作用可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化。此外,rGO/FHA具有抗菌作用。這為rGO/FHA在臨床中用作種植體的修飾材料奠定了理論基礎(chǔ)[13]。另有研究表明,添加HA和改性GO 可以提高聚乳酸(poly lactic acid, PLA)基納米復(fù)合材料的疏水性,而且,聚乳酸/羥基磷灰石/氧化石墨烯(PLA/HA/GO)復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度隨著GO含量的增加而增強(qiáng),具有優(yōu)異的力學(xué)性能[14]。此外,HA添加GO和碳納米管(carbon nanotubes, CNT)可顯著改善HA的表面潤濕性、硬度和粗糙度[15],因此,氧化石墨烯/碳納米管/羥基磷灰石(GO/CNT/HA)復(fù)合材料可作為骨移植材料的替代品。

3 石墨烯及其衍生物的細(xì)胞學(xué)作用

石墨烯及其衍生物對不同干細(xì)胞具有不同的促分化作用,如可以促進(jìn)成骨分化、神經(jīng)、肌肉、血管分化和礦化等。

3.1 促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化

有研究發(fā)現(xiàn),無論是在沒有添加任何骨誘導(dǎo)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基還是在成骨培養(yǎng)基中,還原型石墨烯羥基磷灰石(rGO-HAp)復(fù)合物均可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)及骨祖細(xì)胞的成骨分化。提示,在沒有炎癥反應(yīng)的情況下, rGO-HAp 復(fù)合物能夠顯著促進(jìn)全層顱骨缺損的新骨形成[16],該材料可作為顱骨缺損的修復(fù)材料。通過聚乙烯亞胺功能化的氧化石墨烯(GO-PEI)可明顯促進(jìn)hMSCs增殖和黏附,并且具有高效誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化和殺菌作用[17-18]。因此, GO-PEI能夠用于制備可生物吸收性修復(fù)材料,應(yīng)用于骨折固定、組織工程和牙齒矯正等。與地塞米松(DEX-Control)和還原型石墨烯-地塞米松(DEX-rGO-Ti)的培養(yǎng)基相比, hBMSCs在氧化型石墨烯-地塞米松鈦表面(DEX-GO-Ti) 的增殖率更高, 而且成骨分化更顯著[19]?？梢?表面負(fù)載DEX-GO的鈦酸鹽涂層賦予了鈦種植體良好的生物學(xué)活性,為鈦種植體的改性修飾提供了理論依據(jù)。另有研究發(fā)現(xiàn), GO可促進(jìn)山羊BMSCs增殖和成骨分化,并具有良好的生物相容性[20], 2D Gp和 3D Gp可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)成骨分化[21],因此,石墨烯可考慮作為骨組織再生的基質(zhì)。與Na-Ti基質(zhì)相比,PDLSCs在GO-Ti基質(zhì)上顯示出更高的增殖率、ALP活性和成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平[22]。因此,GO-Ti在骨組織工程領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

3.2 促進(jìn)細(xì)胞成神經(jīng)、成肌分化

另有研究發(fā)現(xiàn),不同形式的氧化石墨烯、部分還原型石墨烯和完全還原型石墨烯對多巴胺能(dopaminergiccells, DA)神經(jīng)細(xì)胞具有不同的影響和作用,而且,關(guān)于抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)神經(jīng)元分化作用,薄膜狀石墨烯比粉末狀石墨烯作用更顯著。部分還原型氧化石墨烯薄膜(PRGO-film)最適合DA神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),因?yàn)樗軌虼龠M(jìn)小鼠多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞(SN4741)中腦DA表達(dá),而且不影響細(xì)胞代謝或線粒體功能, PRGO-film對DA神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。因此,PRGO-film是一種具有潛在應(yīng)用前景的支架材料,有研究者將該材料應(yīng)用于帕金森病DA神經(jīng)細(xì)胞替代治療的探索研究[23],具有高度褶皺結(jié)構(gòu)的GO薄膜有利于細(xì)胞形成更大的黏附區(qū)和更高水平的成肌分化率。此外,苯丙氨酸和賴氨酸功能化的GO薄膜比單純的GO薄膜顯著提高小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)成肌分化率[24]。

3.3 促進(jìn)牙髓再生

低濃度的GO-Cu(<10 mg/mL)可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)的活力、增殖、誘導(dǎo)成牙分化和神經(jīng)血管形成[25]。GO可促進(jìn)DPSCs黏附、增殖并可促進(jìn)礦化相關(guān)基因表達(dá)[5],可見,GO-Cu是一種頗具潛力的牙髓再生材料。另有研究表明,氧化石墨烯量子點(diǎn)(graphene oxide quantum dots, GOQDs)可以促進(jìn)人脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs)黏附、增殖和早期成骨相關(guān)基因表達(dá)[26]。3D石墨烯泡沫和58 s生物活性玻璃復(fù)合(3DGF/58SBG)構(gòu)建的支架具有較大的表面積、良好的生物學(xué)作用和電活性,該支架可通過較強(qiáng)的生物電刺激促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化,進(jìn)而顯著促進(jìn)骨再生[27],說明,石墨烯作為再生載體或支架材料,但需要篩選和明確適宜的濃度。

牙髓位于髓腔內(nèi),被牙本質(zhì)包繞,通過根尖孔、側(cè)支根管及副根管于牙周組織相連。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)由Gronthos等[28]于2000 年首次發(fā)現(xiàn),與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有極其相似的免疫表型和形成礦化結(jié)節(jié)能力,細(xì)胞形態(tài)呈梭形,可自我更新和多向分化,具有較強(qiáng)的克隆能力,存在于牙髓核心和細(xì)胞富集區(qū)。研究表明,DPSCs具有分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞等潛能,是牙髓再生常用的種子細(xì)胞[29]。組織工程涉及干細(xì)胞、支架和生長因子三大部分。石墨烯及其衍生物可促進(jìn)DPSCs黏附、增殖和分化。體外實(shí)驗(yàn)中,檢測DPSCs黏附能力的方法主要有通過掃描電鏡來觀察細(xì)胞特征,通過RT-PCR或是檢測細(xì)胞黏附相關(guān)的整合素β1的表達(dá)情況[30]。

石墨烯及其衍生物可促進(jìn)DPSCs黏附不同基底黏附,若欲將DPSCs作為牙髓再生的種子細(xì)胞,在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞學(xué)作用時(shí),需將其接種于牙本質(zhì)表面或相關(guān)支架材料上,通過觀察DPSCs的成骨、成血管和成神經(jīng)分化等效果,以判斷DPSCs的自我更新和多向分化能力,DPSCs黏附牙本質(zhì)片或相關(guān)支架材料的效果將決定牙髓再生的效果[5,25-27]。若將DPSCs直接置入離體牙根管內(nèi)進(jìn)行牙髓再生,到達(dá)根管的DPSCs數(shù)量有限,而且其在根管內(nèi)分布不均勻,因此很難再生完整的牙髓組織[31]。所以,探索可輔助細(xì)胞黏附根管壁進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞黏附和分化的措施一直被研究者們的努力方向。石墨烯及其衍生物是否能夠改善DPSCs黏附牙本質(zhì),進(jìn)而使DPSCs均勻分布于根管內(nèi)壁表面,這有待進(jìn)一步研究。

4 展 望

石墨烯及其衍生物在牙科種植體、骨缺損的修復(fù)和再生領(lǐng)域已有較多基礎(chǔ)研究和臨床運(yùn)用研究?；诓煌男揎椃绞?、應(yīng)用形式、材料濃度,石墨烯及其衍生物具有不同的細(xì)胞學(xué)作用和細(xì)胞毒性,其適當(dāng)應(yīng)用可優(yōu)化基底表面性質(zhì),增強(qiáng)抑菌作用、促進(jìn)干細(xì)胞黏附、增殖和分化,而關(guān)于石墨烯及其衍生物在牙髓再生中黏附效果有待進(jìn)一步研究和探討。