張士龍,王 鑫,把宗國

中糧糧油工業(yè)(巢湖)有限公司 (巢湖 238000)

二十二碳六烯酸(DHA),作為一種ω-3多不飽和脂肪酸,是人體必需的多不飽和脂肪酸,具有很多重要的生理功能,如調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝、降低血液粘稠度和膽固醇水平、降分,能促進(jìn)嬰幼兒的腦部和視力的機(jī)能發(fā)育,有利于智力、學(xué)習(xí)和記憶能力的提高[1]。DHA目前存在的主要方式有兩大類,一是甘油三酯型(微藻油);二是乙酯型(魚油)。研究顯示,乙酯形式的DHA在人體內(nèi)難以被消化吸收,游離形式易氧化,氣味口感難以被接受,而甘油酯形式的DHA既保持了原有的生物學(xué)活性和生理功能,不易氧化,又易于被人體吸收利用,氣味口感更加溫和。

微藻油與魚油二者DHA含量均較低,可以采用適當(dāng)方法富集以提高DHA的含量。富集方式通常有兩種,即脂肪酶法和傳統(tǒng)的物理化學(xué)法。脂肪酶富集DHA主要通過酶促水解、酯化、酯交換、醇解等方式來實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)物理化學(xué)方法主要有低溫結(jié)晶、金屬沉淀、尿素包合等。

與傳統(tǒng)的低溫結(jié)晶、金屬沉淀、尿素包合等物理化學(xué)富集方法相比,利用脂肪酶法合成富含DHA的甘油酯,具有高效性、選擇性好、產(chǎn)品質(zhì)量高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[2]。因此利用天然的脂肪酶來富集DHA的方法越來越多的被學(xué)者們采用。研究表明,脂肪酶主要來源有兩大類:一是以動植物及真菌為代表的真核生物;二是以細(xì)菌等為代表的原核生物,二者的獲取既可采用組織提取方式又可采用微生物培養(yǎng)方式。脂肪酶即三?；视王；饷?它催化天然底物油脂水解,生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶,可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)等。脂肪酶也是一種活性蛋白質(zhì)。因此,一切對蛋白質(zhì)活性有影響的因素都影響酶的活性。酶與底物作用的活性,受溫度、pH值、脂肪酶濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響。

1 脂肪酶在富集DHA工藝中的應(yīng)用

1.1 脂肪酶促水解

魚油甘油酯分子的三個酯鍵具有空間差異性,ω-3多不飽和脂肪酸大多位于2位上,而大多數(shù)脂肪酶作用在1,3位點(diǎn)。由于不同脂肪酶對于不同脂肪酸具有特異性,因此在脂肪酶的催化下,魚油發(fā)生選擇性水解,從而富集DHA。水解是一種平衡反應(yīng),因此DHA只能濃縮到一定水平。為了提高DHA的含量,可以重復(fù)水解反應(yīng)混合物中分離出的含DHA組分。

朱東奇等[3]研究了重組米根霉脂肪酶(rProROL)的酶學(xué)性質(zhì),并且將其用于催化水解鳀魚油富集DHA,發(fā)現(xiàn)rProROL水解三油酸甘油酯時具有顯著的sn-1,3位置專一性。水解產(chǎn)生的甘油二酯中DHA含量達(dá)到19.7%,單甘酯中DHA含量達(dá)到25.2%,DHA的回收率可以達(dá)到65.6%。

劉國艷等[4]以小黃魚內(nèi)臟精煉魚油為原料,通過脂肪酶選擇性水解法富集DHA和EPA,最終產(chǎn)物EPA和DHA甘油酯總含量為21.65%,高于精煉魚油(12.35%)。

1.2 脂肪酶促酯化

水解純化得到高純度的DHA后,先使DHA與甘油二者在酶存在體系下進(jìn)行酯化反應(yīng),待反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行分離提純。使用該方案能得到較高純度的DHA甘油三酯,但是工作效率較低,成本較高。

孫兆敏等[5]首先通過技術(shù)手段(氯仿-甲醇混合液)將裂殖壺菌總脂提取出來,然后在反應(yīng)體系中加入特定脂肪酶,將其轉(zhuǎn)化為乙酯型,再借助分子蒸餾技術(shù)手段可將乙酯中的DHA含量由原有的40%提升至80%以上。另外,李道明等[6]使用原料為富含DHA的脂肪酸和甘油,在游離脂肪酶和固定化脂肪酶作用下通過兩階段酯化反應(yīng)合成高含量甘油三酯。其中一階段先用游離脂肪酶催化,反應(yīng)達(dá)到平衡時富含DHA脂肪酸的酯化率達(dá)到67%。二階段再利用固定化脂肪酶下催化上一步反應(yīng)后的油相,結(jié)果顯示脂肪酸的轉(zhuǎn)化率提高到96%以上,甘油三酯的含量也可提高40%以上。

1.3 脂肪酶促酯交換

將DHA或其乙酯加入到含有DHA的甘油三酯中,再輔用酶催化酯交換反應(yīng),可得到更高DHA含量的甘油三酯。根據(jù)國外學(xué)者研究結(jié)果,原料甘油酯中DHA的初始含量和加入的DHA純度二者是脂肪酶促酯交換反應(yīng)得到高純度DHA終產(chǎn)物的主要影響因素。相較于酯化,酯交換對高純度DHA要求較低,但其缺點(diǎn)也很明顯,反應(yīng)速度相對較慢且反應(yīng)不完全[7]。

李金章等[8]通過將乙酯型和甘油酯型相互轉(zhuǎn)換的方式,可以將乙酯型中的EPA、DHA富集到甘油酯型當(dāng)中,得到的甘油三酯其EPA、DHA含量較高。鄭建永等[9]以乙酯型魚油和甘油酯型魚油為原料在米曲霉脂肪酶催化下進(jìn)行酯酯交換反應(yīng)得到高含量EPA/DHA甘油酯,探討了最優(yōu)酶催化反應(yīng)條件。在最優(yōu)的酶催化反應(yīng)條件下反應(yīng)18 h,產(chǎn)物中EPA和DHA含量可達(dá)到接近40%左右。在優(yōu)化條件下重復(fù)使用米曲霉菌絲體,產(chǎn)品中的EPA和DHA含量仍保持穩(wěn)定狀態(tài),變化較小。

1.4 脂肪酶促醇解

醇解產(chǎn)生的脂肪酸乙酯相較于水解產(chǎn)生的游離脂肪酸有易于分離的特點(diǎn),因此被更多學(xué)者采用。脂肪酶在醇解反應(yīng)時對長不飽和脂肪酸不敏感,反應(yīng)效率較低,采用此方法可以將魚油中DHA轉(zhuǎn)化為甘油酯的形式富集。

醇解反應(yīng)主要影響因素有:水分含量、醇的種類。研究者們對比了不同種類醇參與的醇解反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn)月桂醇、乙醇和異丙醇等幾種醇是比較好的反應(yīng)原料。

楊博等[10]對部分醇解魚油進(jìn)行了研究,對油醇比、酶加量的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明在油醇比2∶5、酶加量5%(質(zhì)量比)條件下,魚油中DHA含量由26.1%提高了接近17%。潘志杰等[11]利用填充床酶反應(yīng)器進(jìn)行了脂肪酶催化精煉海洋魚油和乙醇通過連續(xù)式的部分醇解反應(yīng)富集甘油酯型DHA和EPA的研究。

2 脂肪酶法的優(yōu)化

2.1 脂肪酶催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

影響脂肪酶催化反應(yīng)的因素有很多,如反應(yīng)底物配比、反應(yīng)溫度、時間、酶種類、酶添加量等,通過實(shí)驗(yàn)探討這些因素的影響規(guī)律,調(diào)節(jié)最優(yōu)反應(yīng)條件,使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高,可節(jié)省生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)品質(zhì)量。

李麗帆等[12]使用固定化脂肪酶對粗魚油進(jìn)行選擇性水解,分析了加酶量、含水量、溫度、反應(yīng)時間對富集過程的影響規(guī)律,得出最優(yōu)反應(yīng)條件:2 g粗魚油,2.5 g水,221.3 U脂肪酶,30 ℃,反應(yīng)11.7 h,再進(jìn)行二次水解,EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從原始的4.2%和18.9%提高到8.5%和42%。

石紅旗等[13]對脂肪酶水解制備DHA甘油酯產(chǎn)品的工藝條件進(jìn)行了研究,比較了數(shù)種脂肪酶對魚油水解的效果,發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)解脂假絲酵母脂肪酶水解效果最佳。

多位學(xué)者對脂肪酶反應(yīng)條件進(jìn)行研究探索,酶種類來說國產(chǎn)解脂假絲酵母脂肪酶水解效果較好,其他反應(yīng)條件如溫度、時間、底物濃度比等則需要更進(jìn)一步的研究探索。

2.2 酶催化方法的優(yōu)化

事實(shí)上,僅用脂肪酶催化酯化的方法并不高效,需要在催化反應(yīng)之前對DHA進(jìn)行提純操作。通過提純反應(yīng)產(chǎn)物后,可得到由混甘油三酯的混合物,其中甘二酯含量最高。若使甘油三酯為主要成分的產(chǎn)物,可以通過將該混甘油三酯的混合物和一定量的游離脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng),使混甘油三酯的混合物中甘油三酯含量達(dá)到最高。

另外,還有學(xué)者采用兩階段酶法反應(yīng)制備富含EPA/DHA的甘油酯。其中一階段先用游離脂肪酶催化,反應(yīng)達(dá)到平衡時二階段再利用固定化脂肪酶下催化上一步反應(yīng)后的油相,這樣可以得到以甘油三酯為主的EPA/DHA甘油酯產(chǎn)品。

通過提純以及采用兩階段酶法反應(yīng)等優(yōu)化方法來富集DHA,富集的DHA含量有顯著提升,這些優(yōu)化方法值得被采用推廣。

2.3 與其它技術(shù)的聯(lián)用

2.3.1酶的優(yōu)化

雖然脂肪酶催化活力高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和,但游離酶難以與產(chǎn)物分離,且只能發(fā)生一次反應(yīng),對環(huán)境的耐受性差。為了提高酶的穩(wěn)定性和回收利用率,常對脂肪酶進(jìn)行固定化處理。諸如采用交聯(lián)、吸附、包埋、共價結(jié)合等方法對酶進(jìn)行固定化處理。劉向前等[14]研究利用樹脂對脂肪酶Lipozyme CALB L進(jìn)行固定化,然后將固定化酶用于催化富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯與甘油進(jìn)行酯交換反應(yīng)合成甘油酯。

酶催化反應(yīng)一般在酶反應(yīng)器中進(jìn)行,其是根據(jù)酶的催化特性專門研究開發(fā)的一種設(shè)備,可以帶來的好處有:提高效率、降低成本、降低能耗,產(chǎn)生更好的經(jīng)濟(jì)效益。

2.3.2蒸餾分離

分子蒸餾技術(shù)特別適于高沸點(diǎn)、易氧化、熱敏性物質(zhì)的分離,被廣泛應(yīng)用。具有如下特點(diǎn):壓力低、受熱時間短、避免多不飽和脂肪酸的氧化、高真空、連續(xù)分離操作。

很多學(xué)者利用分子蒸餾技術(shù)分離脂肪酶促酯化和醇解之后的混合產(chǎn)物,從而富集產(chǎn)物中的DHA。另外,蒸餾還是降低魚油中游離膽固醇含量的一種有效途徑。在脂肪酶促反應(yīng)過程中,魚油中的游離膽固醇會形成酯化形式,難以與油相分離。因此可以在脂肪酶催化反應(yīng)之前,利用短程蒸餾去除膽固醇,在酶催化和提純后膽固醇含量仍保持在低水平。

與其他技術(shù)聯(lián)用能更大程度的發(fā)揮脂肪酶催化效果以及商業(yè)化程度,有著更好的經(jīng)濟(jì)效益,為富集DHA提供更好的選擇。

3 結(jié)束語

與日本、歐美等國家相比,我國對于魚油中DHA富集的研究起步較晚,但近年來發(fā)展迅速,且取得一定成效。但還有以下方向可以探索:如活性更高的酶制劑、更好的酶固定化方法、更先進(jìn)的DHA分離提純方法以及更新型的生物反應(yīng)器等,致力于制備高純度高質(zhì)量的DHA產(chǎn)品。隨著人們生活質(zhì)量的提升,保健意識的增強(qiáng),富含DHA的產(chǎn)品等保健產(chǎn)品具有廣闊的商業(yè)前景。