趙永才 高炳宏

1 天津體育學(xué)院運(yùn)動健康學(xué)院運(yùn)動生理學(xué)與運(yùn)動醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室（天津 301617）

2 上海體育大學(xué)競技運(yùn)動學(xué)院（上海 200438）

低氧訓(xùn)練能高效提高人體心肺功能和骨骼肌有氧代謝能力，線粒體是能量合成細(xì)胞器，骨骼肌線粒體適應(yīng)變化是低氧訓(xùn)練高效提升有氧能力的部分機(jī)制[1]。運(yùn)動訓(xùn)練引起骨骼肌線粒體生物合成增強(qiáng)，依賴腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）等激酶調(diào)節(jié)[2]，線粒體生物合成增強(qiáng)的同時，還依賴于線粒體自噬及時清理功能損傷的線粒體，維護(hù)骨骼肌線粒體質(zhì)量。

線粒體自噬是損傷的線粒體被特異性包裹進(jìn)自噬體并與溶酶體進(jìn)行融合，最后被降解的過程[3]。經(jīng)典線粒體自噬通路是帕金蛋白（Parkin）調(diào)控的泛素化過程：線粒體損傷后，線粒體定位的PTEN 誘導(dǎo)激酶1（PTEN induced putative kinase 1，Pink1）正常降解過程被抑制，Pink1 在線粒體外膜（OMM）上積累，進(jìn)一步募集Parkin在OMM上定位并對靶蛋白進(jìn)行泛素化。選擇性自噬接頭蛋白P62（Sequestosome 1，P62）含有泛素化結(jié)合域，與泛素化蛋白結(jié)合并在OMM 上積累，吸引自噬體對線粒體進(jìn)行識別吞噬[4]。線粒體外膜上的BCL2/腺病毒E1B19kda 相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B19Kda protein-interacting protein 3，Bnip3）與Bnip3L（Nix）蛋白可直接結(jié)合自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白輕鏈-3（Microtubule-associated protein light chain 3，LC3），直接促進(jìn)自噬體對線粒體的吞噬[4]。

前期研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動訓(xùn)練可增強(qiáng)胰島素抵抗小鼠骨骼肌Pink1/Parkin 線粒體自噬信號[5]；急性運(yùn)動激活小鼠骨骼肌線粒體自噬也依賴Parkin 蛋白的調(diào)節(jié)作用[6]。而低氧環(huán)境和缺血缺氧也能增強(qiáng)骨骼肌和腦組織線粒體自噬信號[4，7]。低氧和運(yùn)動結(jié)合而成的低氧訓(xùn)練是否可以更高效地提高骨骼肌線粒體自噬，報道極少。另外，無論常氧運(yùn)動還是低氧刺激均能增強(qiáng)骨骼肌的血管生成信號[8，9]，低氧訓(xùn)練是否更進(jìn)一步提升骨骼肌血管生長，還不知曉。低氧訓(xùn)練能高效提升有氧代謝能力，分子機(jī)制相對缺乏。線粒體質(zhì)量影響組織細(xì)胞能量代謝水平，與血管生成呈正向關(guān)聯(lián)[10]，骨骼肌線粒體自噬與血管生長信號的適應(yīng)可能是低氧訓(xùn)練提升有氧能力的分子機(jī)制。因此，本研究考察高住低練（live high-train low，LHTL）和低住高練（live lowtrain high，LLTH）兩種低氧訓(xùn)練模式是否能更進(jìn)一步提升骨骼肌線粒體自噬和血管生成信號。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及干預(yù)

1.1.1 實驗對象

6周C57BL/6J雄性小鼠（SPF級），40只，分籠飼養(yǎng)，喂食SPF 級飼料，自由飲食，每日12 h 光照，溫度保持在25℃，環(huán)境濕度保持在50%～60%。1 周熟悉環(huán)境后，隨機(jī)分5 組：對照組（control group，H 組）、低氧暴露組（hypoxic group，H 組）、運(yùn)動訓(xùn)練組（exercise training group，E 組）、高住低練組（live high training low group，LHTL 組）和低住高練組（live low training high group，LLTH 組），8只/組。研究經(jīng)上海體育學(xué)院倫理委員會審核（批準(zhǔn)號：2017036）。

1.1.2 實驗干預(yù)

C 組自由飼養(yǎng)，不做干預(yù)；H 組白天完成8 小時低氧暴露；E 組于18:00完成一次跑臺運(yùn)動；LHTL 組采取E組和H組的結(jié)合模式，即先進(jìn)行低氧暴露，18:00再進(jìn)行一次跑臺運(yùn)動；LLTH 組每天18:00于低氧環(huán)境下完成一次跑臺運(yùn)動（強(qiáng)度同E組）。持續(xù)6周干預(yù)，每周5天，使用Everest Summit Ⅱ低氧發(fā)生器（Hypoxico Inc公司）設(shè)置低氧環(huán)境，每次運(yùn)動負(fù)荷和低氧濃度見表1。

表1 運(yùn)動強(qiáng)度及低氧濃度安排（跑臺坡度0°）

最后一次干預(yù)24 h 后，動物引頸處死，取腓腸肌于液氮速凍，－80℃保存，用于蛋白表達(dá)測定。4%多聚甲醛固定股四頭肌，用于組織學(xué)處理。取1 mm3腓腸肌，4%戊二醛固定，用于電鏡觀察。

1.2 Western blot蛋白測定

腓腸肌與適量裂解液混合，冷凍環(huán)境研磨，冷凍離心機(jī)12000 g離心10 min，蛋白上清液進(jìn)行濃度測定，100 ℃下煮10 min，完成蛋白變性。每孔蛋白上樣，SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳，濃縮膠保持70 v 電壓，電泳30 min，分離膠保持120 v，電泳30～40 min。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，進(jìn)行60～90 min 轉(zhuǎn)膜。膜置于脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3×5 min。加一抗并4°C孵育過夜。一抗信息：LC3（MBL，M186-3）、Ulk1（CST，8054T）、p-Ulk1（Ser555）（CST，5869T）、Pink1（Proteintech，23274-1-AP）、Parkin（Proteintech，66674-1-Ig）、Bnip3（博士德， BM5039）、Nix（Proteintech，12986-1-AP）及α-Tubulin（Proteintech，11224-1-AP），一抗均按1∶1000 稀釋。孵育完畢后，TBST 洗膜3×5 min，室溫孵育二抗（Proteintech，SA00001-2，1∶3000稀釋）1 h，洗膜3×5 min。添加ECL發(fā)光液顯影，Image J 軟件分析蛋白印跡的灰度值，α-Tubulin 內(nèi)參完成校正。

1.3 免疫組織化學(xué)方法

本次研究受腓腸肌樣本量的限制，取股四頭肌進(jìn)行組織學(xué)切片觀察，評估血管生成適應(yīng)。股四頭肌進(jìn)行梯度酒精脫水和透明處理，石蠟包埋及切片。切片經(jīng)二甲苯和下行梯度酒精復(fù)水，切片放于檸檬酸鹽修復(fù)液，再加熱，冷卻后PBS洗滌。過氧化氫孵育30 min后PBS 洗滌。BSA 常溫下封閉30 min，滴加血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（碧云天，AF0312）或血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（Platelet- endothelial cell adhesion molecule- 1， CD31）（CST，77699S）一抗稀釋液，4°C 孵育6 h。PBS 洗滌后孵育生物素標(biāo)記二抗，30 min 后PBS 洗滌添加SABC液，室溫孵育洗滌后添加DAB顯色液，細(xì)胞核復(fù)染后脫水封片。奧林巴斯BX35 顯微鏡隨機(jī)觀察樣本5 個視野，Image Pro軟件計算光密度積分。

1.4 透射電鏡觀察

腓腸肌約1 mm3體積，用4%戊二醛進(jìn)行固定，4℃一天，在1%鋨酸混合0.1 M 磷酸緩沖液中，室溫2 h，PBS 漂洗3×15 min。上行酒精進(jìn)行脫水。812 包埋劑和丙酮混合液中滲透8 h，使用純812 包埋劑再滲透8 h。于60℃環(huán)境聚合48 h，切片機(jī)完成70 nm切片（Leica UC7）。再完成鈾鉛雙染色，常溫下干燥。Hitach 7700電鏡配合Gatan ccd相機(jī)進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 20.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用雙因素方差分析，整體上具有顯著差異后，使用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD），進(jìn)一步比較各組之間的差異性。 使用Prism GraphPad 7.0進(jìn)行繪圖，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧訓(xùn)練過程體重的變化

如圖1所示，C組小鼠體重在訓(xùn)練周期穩(wěn)定增長；H組6 周末體重也顯著小于C 組（P＜0.05）。E 組小鼠體重增長較慢，干預(yù)周期內(nèi)，E 組小鼠體重顯著小于C 組（P＜0.01）。干預(yù)周期內(nèi)，LHTL 組與LLTH 組小鼠體重低于C組，到6周干預(yù)結(jié)束后，LHTL 組與LLTH 組小鼠體重已顯著低于C 組（P＜0.01）。結(jié)果表明單純低氧暴露、運(yùn)動訓(xùn)練及低氧訓(xùn)練能降低小鼠體重增長速度。

圖1 各類干預(yù)過程中各組小鼠體重的變化

2.2 低氧訓(xùn)練后骨骼肌線粒體自噬的變化

2.2.1 骨骼肌自噬信號的變化

與C組相比，各組P62表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05，圖2A）。對比各組LC3 蛋白（圖2B），LHTL 組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值不但顯著高于C組（P＜0.01，圖2B），還顯著高于H 組和E 組（P＜0.05，圖2B），即LHTL 組骨骼肌LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化最明顯，自噬信號增強(qiáng)最顯著。Unc51 樣自噬激活激酶1（Unc51-like autophagy-activating kinase 1，Ulk1）正向調(diào)控細(xì)胞自噬的進(jìn)程，相比C組，E組與LHTL 組磷酸化Ulk1（p-Ulk1）水平增加（P＜0.05，圖2C）。Ulk1 蛋白變化無顯著性（P＞0.05，圖2D）。結(jié)果提示運(yùn)動訓(xùn)練或LHTL顯著提高Ulk1磷酸化水平。

圖2 各組小鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.2.2 骨骼肌線粒體自噬蛋白表達(dá)的變化

與C 組相比，H、LHTL 和LLTH 組Pink1 表達(dá)均顯著提高（P＜0.05，圖3A）；LHTL 組Pink1 表達(dá)也顯著高于E 組。LHTL 和LLTH 組Parkin 表達(dá)顯著高于C 組和H 組（P＜0.05，P＜0.01，圖3B）。各組Bnip3 表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05，圖3C）。E、LHTL 及LLTH 組Nix 水平顯著高于C 組（P＜0.05，圖3D），LHTL 與LLTH 組Nix 也明顯高于H 組（P＜0.01，圖3D）?？傮w提示兩種低氧訓(xùn)練模式提升Pink1、Parkin 和Nix 蛋白含量較顯著，更有利于肌細(xì)胞線粒體自噬發(fā)生。

圖3 各組小鼠骨骼肌線粒體自噬蛋白的表達(dá)

2.3 低氧訓(xùn)練后骨骼肌血管生成信號變化

CD31是血管內(nèi)皮的標(biāo)志，可呈現(xiàn)線狀（血管縱切）或不規(guī)則圓形（血管橫切）。如圖4，LHTL 與LLTH 組CD31表達(dá)高于C組（P＜0.05，P＜0.01），LHTL組CD31含量也顯著高于H 組（P＜0.01）。VEGF 是促進(jìn)血管生長的關(guān)鍵因子，如圖5，各干預(yù)組VEGF表達(dá)顯著高于C組（P＜0.05，P＜0.01）。低氧暴露、運(yùn)動訓(xùn)練和低氧訓(xùn)練能不同程度提高CD31與VEGF表達(dá)，LHTL與LLTH均促進(jìn)CD31與VEGF表達(dá)，血管生長明顯。

圖4 各組小鼠骨骼肌CD31的表達(dá)（×400倍）

圖5 各組小鼠骨骼肌VEGF的表達(dá)（×200倍）

2.4 低氧訓(xùn)練后骨骼肌透射電鏡觀察

腓腸肌切片放大2000倍（圖6）。各組代表性切片Z 線保持完整，未見斷裂損傷，明帶和暗帶交替呈現(xiàn)較為規(guī)律。各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和Z線交界處的線粒體形態(tài)存在差異，相比C組，E組和LHTL 組線粒體體積更大，且線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更明顯。各組線粒體形態(tài)完整，未見明顯水腫及空泡等病變。結(jié)果提示本次干預(yù)未產(chǎn)生肌原纖維及線粒體結(jié)構(gòu)病變，運(yùn)動訓(xùn)練后線粒體數(shù)量增大且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常，線粒體呈現(xiàn)較好的生理性適應(yīng)。

圖6 各組小鼠骨骼肌線粒體形態(tài)特征（×2000倍）

3 討論

3.1 低氧訓(xùn)練對骨骼肌線粒體自噬的影響

低氧訓(xùn)練使機(jī)體承受低氧和運(yùn)動缺氧雙重負(fù)荷，高效提高血紅蛋白含量，增強(qiáng)心肺功能及肌肉力量[11，12]。前期綜述也發(fā)現(xiàn)，相比常氧訓(xùn)練，低氧訓(xùn)練對骨骼肌的刺激更為強(qiáng)烈，并有效提高人體骨骼肌有氧代謝能力[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，低氧訓(xùn)練能有效提升骨骼肌線粒體去乙?；窼irt3 蛋白表達(dá)，提高線粒體抗氧化功能[1]。提示低氧訓(xùn)練促進(jìn)線粒體功能適應(yīng)可能是機(jī)體有氧代謝能力提升的機(jī)制之一，但低氧訓(xùn)練與骨骼肌線粒體自噬的報道相對較少。

自噬（大自噬）是指細(xì)胞成分，如細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等損傷成分被自噬體識別包裹，與溶酶體融合并被降解的過程，降解成分可循環(huán)利用[14]。隨著自噬加強(qiáng)，P62表達(dá)降低，LC3Ⅱ表達(dá)相對提高。本研究未發(fā)現(xiàn)各組P62 有變化，但高住低練組LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著性升高，而且其LC3Ⅱ/Ⅰ比值也高于單獨(dú)低氧暴露或運(yùn)動訓(xùn)練組，提示高住低練提升骨骼肌自噬信號要強(qiáng)于單獨(dú)運(yùn)動訓(xùn)練或低氧暴露。自噬的啟動程序依賴Ulk1，Ulk1（Ser555）被AMPK磷酸化激活，啟動細(xì)胞自噬級聯(lián)信號反應(yīng)[15]。Ulk1也參與運(yùn)動激活肌肉線粒體自噬的信號，Ulk1（Ser555）磷酸化是運(yùn)動激活肌肉線粒體自噬的關(guān)鍵信號[16]。本研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌Ulk1整體蛋白對各類干預(yù)不敏感，但運(yùn)動訓(xùn)練與高住低練提升了Ulk1（Ser555）磷酸化水平。整體而言，高住低練模式提升骨骼肌自噬信號更明顯，有利于充分利用氨基酸、糖、脂等營養(yǎng)素，維持能量合成效率，應(yīng)對低氧訓(xùn)練下的代謝需要。

骨骼肌代謝旺盛，擁有豐富的線粒體，其數(shù)量和質(zhì)量對于維持肌肉生理功能至關(guān)重要[17]。運(yùn)動引發(fā)部分線粒體損傷，受損線粒體易釋放ROS，加劇損傷，同時肌細(xì)胞ATP減少激活了AMPK，AMPK通過不同途徑啟動線粒體自噬，清理受損線粒體，維持線粒體質(zhì)量[18]。Pink1/Parkin 泛素化途徑和Bnip3/Nix 受體途徑參與自噬體對線粒體的降解[19]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種低氧訓(xùn)練模式均增強(qiáng)Pink1、Parkin 和Nix 蛋白表達(dá)，運(yùn)動訓(xùn)練或低氧暴露對線粒體自噬信號的影響相對較小，且高住低練組Pink1 表達(dá)顯著高于運(yùn)動訓(xùn)練組。即兩種低氧訓(xùn)練模式，尤其高住低練比低氧暴露或運(yùn)動訓(xùn)練增強(qiáng)骨骼肌線粒體自噬信號更明顯。前期薄海等[20]研究發(fā)現(xiàn)4 周低氧訓(xùn)練或11.3%低氧暴露均可提高大鼠骨骼肌Bnip3、Parkin 及Pink1 蛋白表達(dá)，但低氧訓(xùn)練提高Parkin、Bnip3 蛋白表達(dá)更明顯。本次研究支持其研究結(jié)論，發(fā)現(xiàn)低氧訓(xùn)練增強(qiáng)骨骼肌線粒體自噬信號的效果要好于單純低氧暴露。低氧訓(xùn)練誘發(fā)的雙重負(fù)荷對骨骼肌刺激更強(qiáng)烈，缺氧能通過降低ATP 含量等途徑激活A(yù)MPK，進(jìn)而激活線粒體自噬，提高機(jī)體對缺氧的耐受[21]，這可能是低氧訓(xùn)練更高效提高骨骼肌線粒體自噬的機(jī)制。電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動訓(xùn)練和高住低練組線粒體體積明顯變大，且線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更明顯。說明高住低練能有效提高線粒體容量，這是線粒體生物合成增強(qiáng)的宏觀表現(xiàn)，與線粒體自噬信號增強(qiáng)相對應(yīng)，提示本次高住低練模式高效提升了骨骼肌線粒體的生理適應(yīng)。

低氧訓(xùn)練組的小鼠體重增長相對較慢，這與其線粒體自噬信號較高相對應(yīng)。低氧訓(xùn)練干預(yù)下，骨骼肌能量代謝更加旺盛，以滿足低氧和運(yùn)動雙重刺激的代謝需求，再加上骨骼肌自噬與線粒體自噬信號較高，物質(zhì)分解代謝較強(qiáng)，延緩了小鼠體重的正常增長。

常氧訓(xùn)練結(jié)果方面，本研究與既往相關(guān)研究結(jié)果存在不一致。前人發(fā)現(xiàn)長期游泳提高小鼠骨骼肌各類線粒體自噬蛋白的表達(dá)[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)小鼠長期運(yùn)動訓(xùn)練后，慢肌LC3Ⅱ與Bnip3蛋白表達(dá)提高，P62蛋白減少[23]，提示有氧運(yùn)動訓(xùn)練可增強(qiáng)骨骼肌線粒體自噬。有氧運(yùn)動訓(xùn)練也能促進(jìn)小鼠骨骼肌Parkin蛋白在線粒體膜上的定位[24]。經(jīng)常跑步訓(xùn)練人群骨骼肌Parkin（Ser65）、Pink1（Thr257）磷酸化水平比不訓(xùn)練人群高，提示常氧訓(xùn)練即可提高骨骼肌基礎(chǔ)水平線粒體自噬[25]。近期還有研究發(fā)現(xiàn)常氧下高強(qiáng)度間歇性訓(xùn)練提高大鼠骨骼肌Bnip3蛋白[26]。但本次研究中，常氧訓(xùn)練（運(yùn)動訓(xùn)練組）后小鼠骨骼肌線粒體自噬信號整體變化不明顯。有研究[27]發(fā)現(xiàn)6 周小鼠跑臺訓(xùn)練明顯提高了骨骼肌線粒體態(tài)3 呼吸（氧化磷酸化涉及的ATP 合成能力增強(qiáng)），并提高了Parkin 蛋白表達(dá)，其干預(yù)中后期跑臺速度遠(yuǎn)大于本研究的跑速。與該研究相比，本次研究中，常氧下運(yùn)動訓(xùn)練強(qiáng)度可能偏低，不能有效激活骨骼肌線粒體自噬信號。而在結(jié)合低氧后，雙重生理負(fù)荷才激活了骨骼肌線粒體自噬。另外，受試對象及運(yùn)動模式的差異可能也是研究結(jié)果不一致的原因。

3.2 低氧訓(xùn)練對骨骼肌血管生長的影響

骨骼肌對低氧訓(xùn)練的適應(yīng)也涉及血管組織的變化。毛細(xì)血管與肌膜極為接近，肌細(xì)胞線粒體消耗氧及營養(yǎng)素，線粒體變化也影響到血管組織的適應(yīng)。CD31主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是評估毛細(xì)血管生長的有效指標(biāo)[28]。VEGF同樣在血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，運(yùn)動可上調(diào)高血壓大鼠血管VEGF 表達(dá)，有利于降壓[29]。本次研究發(fā)現(xiàn)高住低練與低住高練均明顯提高股四頭肌CD31 表達(dá)，高住低練組CD31 表達(dá)還高于低氧暴露組；另外，運(yùn)動訓(xùn)練、低氧暴露及兩種低氧訓(xùn)練也明顯提高了VEGF 的表達(dá)。本次研究整體表明，低氧訓(xùn)練提升血管生長信號方面，要比低氧暴露更為明顯。前期雖有運(yùn)動增強(qiáng)肌肉血管生長的報道，但缺乏涉及低氧訓(xùn)練與血管生長關(guān)系的研究。Hoppeler 等[30]發(fā)現(xiàn)低住高練提升運(yùn)動員骨骼肌VEGF mRNA，且優(yōu)于常氧訓(xùn)練。Nagahisa等[31]發(fā)現(xiàn)純種馬進(jìn)行長期低氧訓(xùn)練后，肌肉毛細(xì)血管密度及VEGF mRNA 大幅提高，優(yōu)于常氧訓(xùn)練。本研究通過組織學(xué)考察發(fā)現(xiàn)低氧訓(xùn)練和運(yùn)動訓(xùn)練均能提升小鼠骨骼肌VEGF 表達(dá)，并未發(fā)現(xiàn)低氧訓(xùn)練提高VEGF 表達(dá)具有優(yōu)勢，可能與研究對象和評估方法差異有關(guān)。另一方面，低氧訓(xùn)練提高骨骼肌CD31表達(dá)，而運(yùn)動訓(xùn)練影響骨骼肌CD31不明顯，可能CD31敏感性相對較低，只有低氧訓(xùn)練雙重生理負(fù)荷才能有效提升其表達(dá)。總體認(rèn)為，低氧訓(xùn)練提高肌肉血管生長效果更好，分子機(jī)制還有待研究。

4 結(jié)論

6 周高住低練和低住高練提高了小鼠骨骼肌線粒體自噬信號和血管生長信號，其中高住低練模式提升骨骼肌線粒體自噬及血管生成信號最明顯。6 周運(yùn)動訓(xùn)練或低氧暴露也不同程度提高小鼠骨骼肌線粒體自噬和血管生長信號，但高住低練模式在提升骨骼肌線粒體自噬信號方面有更好的表現(xiàn)。