蔣欣芫，吳曉艷，曹 章，趙 靜，張 旭，于天浩，張彥龍

（東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

鵝星狀病毒（goose astrovirus，GAstV）屬于星狀病毒科成員，是一種無囊膜、單股正鏈RNA病毒。雛鵝對GAstV 易感，感染后心包、肝、腎等內(nèi)臟以及關(guān)節(jié)出現(xiàn)尿酸鹽沉積等癥狀，發(fā)病率和病死率均高達50%以上[1]。GAstV 給我國養(yǎng)鵝業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟損失。根據(jù)全序列核苷酸多樣性，GAstV 可分為兩個基因群，即GAstV-Ⅰ和GAstV- Ⅱ， 其中GAstV- Ⅱ發(fā)病率遠高于GAstV-Ⅰ[2]。GAstV 基因組長度約為7.2 kb，包含1個5'非翻譯區(qū)（UTR）、3個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b 和ORF2）、1 個3' UTR 和1 個多聚腺苷酸（Poly A）尾。ORF2 基因編碼的衣殼蛋白由704個氨基酸構(gòu)成，包括4 個功能域：S、P1、P2 和酸性C 末端結(jié)構(gòu)域。其中，第425～665 位氨基酸屬于P2 結(jié)構(gòu)域，其編碼的VP27 蛋白，又稱刺突蛋白，位于病毒結(jié)構(gòu)表面[3]。已有研究[4-5]表明，刺突蛋白參與細(xì)胞表面相關(guān)受體的識別及機體的免疫應(yīng)答，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，是GAstV 的主要保護性抗原蛋白。

自第一例GAstV感染病例在我國被報道以來，該病已傳播至我國各省份，并持續(xù)蔓延[6]。由于目前針對GAstV 各蛋白結(jié)構(gòu)、功能和作用機制的研究有限，并且GAstV 具有傳播速度快、突變率高和容易重組的特點，因此尚未研發(fā)出針對該病毒安全高效的商品化疫苗。本研究通過生物信息學(xué)方法對具有良好免疫原性GAstV-Ⅱ ZYL02 株的VP27蛋白結(jié)構(gòu)與功能進行分析，進一步對其B 細(xì)胞抗原表位進行預(yù)測，以期為GAstV-Ⅱ疫苗研發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 毒株序列

GAstV-Ⅱ ZYL02 株，由東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院分離并保存，經(jīng)測序獲得了其基因組序列（GenBank 登錄號OM811460）。該毒株ORF2 基因編碼704 個氨基酸，其中VP27 蛋白的氨基酸序列位于第425～665 位。ZYL02 株VP27基因開放閱讀框推導(dǎo)的氨基酸序列：QVTPSLVYNFQGERQSTTESCSFLVFGIPQADSRSRYNANITFNVGYRGRTSTSFTLGTHNWWAVMTLSQTGVIFAPPAVGTGVCNTLATAIQHLNPELETAVLRVNTSTTSTGGQITELRNRLNIADGDYVISMGDPQGNRSALYFRNSDQKWVWLWAGDSNPGETFQSFKMPVLINWSVSDSQEQYNARVRMVQYANAQQQTLTDPEEDDDPLSDVTSLFDPTAEDETDFHLAVSLKTS。

1.2 方法

1.2.1 VP27 蛋白主要理化特性分析 利用Expasy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線軟件，分析ZYL02 株VP27 蛋白氨基酸組成、等電點、原子組成及親疏水性等理化性質(zhì)。

1.2.2 VP27 蛋白亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽分析 利用PSORT II Prediction 在線軟件（http://psort.hgc.jp/form2.html），在線分析VP27 蛋白亞細(xì)胞定位；利用ProtScale 在線軟件（https://web.expasy.org/protscale/），預(yù)測目標(biāo)蛋白的親疏水性；運 用SignalP 4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM 2.0在線軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）， 分別預(yù)測VP27 蛋白是否含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 VP27 蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA 在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html），預(yù)測VP27 蛋白二級結(jié)構(gòu)特征，計算其所含的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲及擴展鏈的數(shù)目與百分比；采用Phyer2 在線軟件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index），建模并預(yù)測VP27 蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 B 細(xì)胞表位預(yù)測及可視化 運用BepiPred-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/BepiPred-2.0/）和ABCpred（http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/）兩個在線軟件綜合預(yù)測潛在B 細(xì)胞抗原表位，其中ABCpred 預(yù)測肽長度選擇20 aa，閾值設(shè)為0.5。將上述預(yù)測得到的潛在B 細(xì)胞抗原表位通過ToxinPred2（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred2/）、VaxiJen v2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）和IEDB（http://tools.iedb.org/main/）等在線軟件分別進行毒性、抗原性、β-轉(zhuǎn)角、表面可及性、靈活性和疏水性分析，以期篩選出優(yōu)勢B 細(xì)胞抗原表位，然后使用PyMOL 軟件可視化優(yōu)勢B 細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP27 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 在線軟件對ZYL02 株VP27蛋白進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示：該蛋白由20種241 個氨基酸組成，其中Thr 占比最高（10.8%），Cys 占比最低（0.8%）；帶正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）共15 個，帶負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）共26 個（表1）。蛋白分子式為C1173H1794N324O382S6，分子質(zhì)量為26.739 45 kDa，理論等電點為4.59，不穩(wěn)定指數(shù)為41.8，脂肪指數(shù)為70.37，平均疏水性（GRAVY）為-0.418。根據(jù)ProtParam 軟件“不穩(wěn)定指數(shù)大于40 為不穩(wěn)定蛋白，小于40 為穩(wěn)定蛋白，GRAVY值在-2～2 范圍內(nèi)屬于親水性蛋白”的規(guī)定，判定VP27 為不穩(wěn)定的親水蛋白。

表1 ZYL02 株VP27 蛋白氨基酸組成

2.2 VP27 蛋白親疏水性、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)及信號肽預(yù)測

利用ProtScale 對ZYL02 株VP27 蛋白親疏水性的預(yù)測結(jié)果（圖1）顯示：該蛋白多肽鏈中第24位氨基酸處疏水值最大，為2.067，第210 位氨基酸處疏水值最小，為-2.767，整條多肽鏈中親水氨基酸殘基數(shù)量多于疏水氨基酸殘基。因此，綜合分析VP27 為親水性蛋白，與2.1 中預(yù)測結(jié)果一致。TMHMM Server v 2.0 和SignalP 4.1 在線軟件預(yù)測結(jié)果（圖2～3）顯示，VP27 蛋白無跨膜區(qū)和信號肽。利用PSORT II Prediction 在線軟件分析VP27蛋白亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示，其定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體以及過氧化物酶體中的可能性分別為69.6%、17.4%、8.7%以及4.3%，即VP27 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的概率最高。

圖3 ZYL02 株VP27 蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

2.3 VP27 蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA 在線軟件對ZYL02 株VP27 蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果（圖4）顯示：VP27 蛋白中101 個氨基酸組成無規(guī)卷曲（random coil，Cc），占總氨基酸的41.91%；70 個氨基酸構(gòu)成延伸鏈（extended strand，Be），約占總氨基酸的29.05%；54 個氨基酸構(gòu)成α 螺旋（alpha helix，Hh），約占總氨基酸的22.41%；16 個氨基酸構(gòu)成β 轉(zhuǎn)角（beta turn，Tt），約占總氨基酸的6.64%。結(jié)果表明，VP27 蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成為無規(guī)卷曲，其次是延伸鏈。進一步通過Pyhre 在線軟件以PDB ID 3ts3 為模板進行VP27 蛋白同源建模，預(yù)測的模型覆蓋率為79%，置信度為100%。使用PyMOL 軟件對該模型進行了可視化，并對α 螺旋、β 折疊和無規(guī)卷曲進行了標(biāo)記，具體結(jié)果見圖5。

圖4 ZYL02 株VP27 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖5 ZYL02 株VP27 蛋白三級結(jié)構(gòu)的可視化模型

2.4 B 細(xì)胞表位預(yù)測與表位的三維空間位置分析

為更好地評價由BepiPred-2.0 和ABCpred 在線軟件預(yù)測獲得的26 條VP27 蛋白B 細(xì)胞表位（表2），利用IEDB 在線軟件從抗原性、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)、表面可及性、柔韌性和親水性5 個方面進行預(yù)測，分別選取得分前10 位的氨基酸序列（表3），再結(jié)合VP27 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，以及ToxinPred2 和VaxiJen v2 在線軟件的預(yù)測結(jié)果綜合分析，共篩選出4 條優(yōu)勢抗原表位（表2），分別位于26～41 aa（FGIPQADSRSRYNANI）、48～57 aa（RGRTSTSFTL）、111～126 aa（TSTGGQITELRNRLNI）、174～189 aa（PVLINWSVSDSQEQYN）。這些表位具有無毒性，抗原性強，處于β-轉(zhuǎn)角，表面可及性大和親水性高等特點。隨后，利用PyMOL 軟件將預(yù)測的4條優(yōu)勢抗原表位在三級結(jié)構(gòu)模型中進行可視化（圖6），從而獲得各優(yōu)勢B 細(xì)胞抗原表位的相對位置。

圖6 ZYL02 株VP27 蛋白優(yōu)勢抗原表位空間結(jié)構(gòu)

表3 ZYL02 株VP27 蛋白IEDB 預(yù)測結(jié)果

3 討論

自2017 年Zhang 等[7]首次分離到GAstV 以來，我國各養(yǎng)鵝地區(qū)均有關(guān)于該病毒的報道。因GAstV毒株具有突變率高、容易重組等特點，其感染防控工作面臨較大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)階段，人們對GAstV 主要抗原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其與宿主的作用機制認(rèn)識有限[7]。本研究利用生物信息學(xué)軟件解析了ZYL02 株VP27 蛋白，旨在探究VP27 蛋白中可作為潛在疫苗的肽段，不僅節(jié)省了試驗時間和成本，更為制備安全高效的疫苗打下了堅實基礎(chǔ)[8-9]。

VP27 蛋白是構(gòu)成星狀病毒刺突的部分，具有誘導(dǎo)中和抗體的功能[10]，且本實驗室保存毒株ZYL02 具有良好的免疫原性[11]。GAstV-Ⅱ ZYL02株VP27 蛋白分析結(jié)果顯示，該蛋白由241 個氨基酸組成，理論等電點為4.59，不穩(wěn)定系數(shù)為41.8，GRAVY 值為-0.418，因此推測VP27 是不穩(wěn)定的親水蛋白，這可為病毒蛋白的分離純化試驗提供先驗信息。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，推測其可能為非分泌型蛋白，提示真核細(xì)胞、大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒等多種表達系統(tǒng)都可用于該蛋白的高效表達。二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，無規(guī)卷曲占比最高（41.91%）。因無規(guī)卷曲相對松散且易發(fā)生扭曲盤旋，多突出在蛋白質(zhì)表面，有利于與抗體結(jié)合，所以該結(jié)構(gòu)特點提示VP27 蛋白產(chǎn)生抗原決定簇區(qū)域的概率較高[12]。Phyer2 在線軟件以PDB ID 3ts3 為模板構(gòu)建VP27 蛋白模型，預(yù)測的模型覆蓋率為75%，置信度達100%，說明構(gòu)建的模型質(zhì)量較好，結(jié)構(gòu)合理可靠。建模結(jié)果顯示，該蛋白是由β 鏈緊密堆積形成的疏水核和α-螺旋及無規(guī)卷曲圍繞在外側(cè)構(gòu)成，與其他禽星狀病毒結(jié)構(gòu)相似[13]，為后文B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測提供了支撐。B 細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，具有識別多種抗原的作用，因此對B 細(xì)胞抗原表位的預(yù)測極其重要[14]。在對B 細(xì)胞抗原表位的預(yù)測中，通過BepiPred-2.0 和ABCpred 在線軟件共預(yù)測出26 條抗原表位。本研究根據(jù)不同分析方法，將二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的區(qū)域，與抗原性強、無毒性和表面可及性大的區(qū)域結(jié)合分析，綜合得分高的重疊肽段作為篩選抗原表位的優(yōu)先選項，最終篩選出4 條優(yōu)勢B 細(xì)胞抗原表位，分別位于48～57 aa（RGRTSTSFTL）、26～41 aa（FGIPQADSRSRYNANI）、111～126 aa（TSTGGQITELRNRLNI）、174～189 aa（PVLINWSVSDSQEQYN），優(yōu)勢B 細(xì)胞抗原表位具有更高誘導(dǎo)機體相關(guān)免疫應(yīng)答的概率，可供疫苗設(shè)計與研究。已有研究[15]表明，B 淋巴細(xì)胞受體（BCR）能識別構(gòu)象表位和線性表位，且識別位置通常處于抗原分子表面。在三維結(jié)構(gòu)中，利用PyMOL 軟件對篩選出的4 條優(yōu)勢表位進行定位，發(fā)現(xiàn)4 條優(yōu)勢表位均處于VP27 蛋白的頂端表面突出部分，進一步證實了預(yù)測的準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)軟件對GAstV-II ZYL02 株VP27 蛋白的特性、結(jié)構(gòu)進行了較為全面系統(tǒng)的分析，并且篩選出4 條基于潛在表位之上的優(yōu)勢抗原表位，為了解VP27 蛋白的生物學(xué)功能以及對GAstV 潛在免疫靶點的研究提供了理論及數(shù)據(jù)依據(jù)，也為研制優(yōu)質(zhì)高效的GAstV 疫苗奠定了基礎(chǔ)。