危姍姍，徐逸昕，朱仔燕，陳皓南，阿不都沙拉木·亞力昆，李繼坤

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率分別居全球腫瘤的第三位和第二位[1]。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）是決定腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療效果、預(yù)后的關(guān)鍵因素，TME 主要由腫瘤細(xì)胞、浸潤性免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）、 細(xì)胞 外基 質(zhì)（extracellular matrix, ECM）和脈管系統(tǒng)等構(gòu)成[2-4]。在各種TME 中，CAFs 是最豐富的細(xì)胞類型之一，在影響腫瘤惡性表型方面起著極其重要的作用，并且以CAFs 作為腫瘤治療的靶標(biāo)也逐漸引起了人們的關(guān)注。

人們將TME 中的活化成纖維細(xì)胞定義為CAFs，其經(jīng)典的生物學(xué)標(biāo)志物為α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)。CAFs 是腫瘤基質(zhì)中的主要組成成分，其作用為分泌生長因子、炎癥配體和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)腫瘤增殖和免疫抑制[5]。CAFs 的主要來源有：1）腫瘤激活鄰近的正常成纖維細(xì)胞，獲得肌成纖維細(xì)胞表型[6-8]；2)骨髓源性纖維細(xì)胞的募集[9-10]；3) 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）[11]；4)內(nèi)皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial -to -mesenchymal transition, EndMT）[12]。

近年來，人們除了對(duì)CAFs 在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的作用有了比較深入的認(rèn)識(shí)以外，有關(guān)CAFs 與TME 中其他免疫細(xì)胞之間的相互作用以及對(duì)腫瘤免疫治療的影響也展開了許多研究。本文將就有關(guān)CAFs 對(duì)結(jié)直腸癌TME 中主要細(xì)胞成分的調(diào)節(jié)及影響腫瘤免疫治療的進(jìn)展研究進(jìn)行綜述。

1 TIME 中免疫細(xì)胞浸潤是影響腫瘤進(jìn)展及免疫治療效果的關(guān)鍵因素

腫瘤免疫微環(huán)境 （tumor immune microenvironment,TIME）是近年來新提出的概念，據(jù)報(bào)道其與患者的免疫治療效果和臨床預(yù)后密切相關(guān)[13]。目前，隨著免疫治療的發(fā)展，治療惡性腫瘤的方式逐漸多樣化，但其發(fā)揮效應(yīng)取決于TME 中的免疫應(yīng)答狀態(tài)，包括免疫細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)和相關(guān)基質(zhì)的改變[14-15]。腫瘤實(shí)質(zhì)中缺乏免疫細(xì)胞浸潤是導(dǎo)致患者不能從免疫治療中獲益的關(guān)鍵因素，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的進(jìn)展[16-17]。

2 CAFs 對(duì)結(jié)直腸癌TME 中T 細(xì)胞的影響

在各種類型的免疫療法中，免疫檢查點(diǎn)阻斷是基于單克隆抗體的療法，也是在臨床上應(yīng)用于患者最多的方式之一。臨床上常用的免疫治療有：通過阻斷受體-配體相互作用、增強(qiáng)T 細(xì)胞的活化和功能，例如抗程序性死亡受體1（PD-1）和抗細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）。CAFs 影響結(jié)直腸癌TME 中的免疫狀態(tài)，從而導(dǎo)致抗腫瘤免疫抑制。以下就結(jié)直腸癌中CAFs 對(duì)T 細(xì)胞調(diào)控的具體機(jī)制進(jìn)行闡述。

參與抗腫瘤免疫的細(xì)胞主要是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocytes，CTLs），而其中起最大殺傷作用的是CD8+T 細(xì)胞。CAFs 通過多種方式影響CD8+T 細(xì)胞的生物學(xué)功能。目前，靶向PD-1/程序性死亡配體1（PD-L1）和CTLA-4 的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種惡性腫瘤被應(yīng)用[18-20]。然而，大多數(shù)患者對(duì)于檢查點(diǎn)單藥治療無響應(yīng)[21-23]，耐藥性產(chǎn)生的原因是全球研究者最為關(guān)注的熱點(diǎn)之一。對(duì)多種腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)富含CAFs 的瘤種對(duì)抗PD-1 治療的療效較差。其機(jī)制之一在于CAFs 自身表達(dá)PD-L1 和PD-L2 或者促進(jìn)CRC 細(xì)胞表面的PD-L3 和PD-L1表達(dá)，導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用減弱[24-26]。另外，CAFs 通過限制CD8+T 細(xì)胞向腫瘤中心浸潤來減少免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的攻擊。例如，Kirsty 等[27]在MC38 小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，與低CAFs 的腫瘤相比，富含CAFs 的腫瘤對(duì)抗PD-1 治療的療效較差。他們用多種方法檢測(cè)了免疫細(xì)胞的定位，發(fā)現(xiàn)CAFs顯著改變了CD8+T 細(xì)胞的分布，促使CD8+T 細(xì)胞積聚在腫瘤邊緣而非腫瘤中心。一項(xiàng)針對(duì)CRC 患者的研究表明，CD70 陽性的CAFs 促進(jìn)了調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞募集和遷移，并顯著增加了這些抑制性免疫細(xì)胞對(duì)TME 的浸潤[28]。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CD70 陽性CRC 患者的生存率較低[29]。

眾所周知，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是調(diào)節(jié)CAFs 分化的重要因子，而NOX4 是TGF-β 信號(hào)通路下游的靶點(diǎn)之一，并也參與了CAFs 分化[30]。反之，CAFs 也可促進(jìn)TGF-β 的分泌和活化，從而抑制CD8+T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性[31]。同時(shí)，CAFs 也可以通過PD-L2 和FASL 的表達(dá)誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞凋亡[32]。根據(jù)Kirsty 等[27]的報(bào)道，使用TGF-β 抑制劑能同時(shí)增加對(duì)照組和富含CAFs 組的CD8+T 細(xì)胞浸潤，在體內(nèi)應(yīng)用NOX4 抑制劑后，可以降低腫瘤中CAFs 的水平，腫瘤邊緣的CD8+T 細(xì)胞開始由腫瘤邊緣向腫瘤中心浸潤，從而引起富含CAFs 的MC38小鼠腫瘤的體積減小。NOX4 抑制劑能使CRC 對(duì)抗PD-1 治療再敏感；與抗PD-1 單藥治療相比，用NOX4 抑制劑/PD-1 抗體的組合治療富含CAFs 的MC38 腫瘤，可以增加CD8+T 細(xì)胞的浸潤，縮小腫瘤體積，延長小鼠的存活時(shí)間。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CAFs 分泌的Wnt2 蛋白信號(hào)通路相關(guān)基因在TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)中高度富集，從而加強(qiáng)了CRC 的侵襲和遷移[33]。

FAP 是一種膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶，同時(shí)其也是CAFs 的主要標(biāo)志物[34]。越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)AP 是另外一個(gè)可能導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)阻斷耐藥的因素[35-37]。Chen 等[38]報(bào)道，含有FAP 高表達(dá)CAFs（CAF2）的腫瘤對(duì)抗PD-1 治療的反應(yīng)較差，而FAP 低表達(dá)的CAFs 則不會(huì)誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生抗PD-1 的耐藥性。另外，用FAP 抑制劑治療可顯著消除CAF2 誘導(dǎo)的抗PD-1 耐藥性。在富含CAF2 的腫瘤中，免疫抑制因素，如骨髓來源抑制細(xì)胞(MDSC)浸潤和PD-L1 表達(dá)異常升高。高FAP 表達(dá)的CAFs 通過上調(diào)CCL2分泌、募集髓系細(xì)胞、降低T 細(xì)胞活性等方式促進(jìn)CRC 腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制[38-39]。上述研究表明CCL2 是FAP 高表達(dá)CAFs 誘導(dǎo)的CRC 免疫抑制的主要介質(zhì)，生存分析發(fā)現(xiàn)高FAP 表達(dá)患者的總生存期較短。另有研究提示FAP 高表達(dá)的CAFs分泌的ECM 與CD8+T 細(xì)胞浸潤減少有關(guān)[40-41]。

CD73 是一種外核苷酸酶，通過與外核苷-ATP-酶、CD39 等協(xié)同產(chǎn)生細(xì)胞外腺苷（ADO）[42-44]。腺苷是TME 中一種有效的細(xì)胞外免疫抑制信使[45]，通過細(xì)胞外ADO 腺苷能受體（A2a）施加免疫抑制[46-47]。已有研究發(fā)現(xiàn)CD73 在腫瘤中的過表達(dá)通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和抑制抗腫瘤免疫來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而TME 中CD73 的重要來源之一是CAFs。Yu等[48]使用來自人CRC 和小鼠腫瘤模型中分離出來的CAFs 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與TME 中的其他細(xì)胞成分相比，CD73 在CAFs 上的表達(dá)和生物活性更高。在缺氧等應(yīng)激條件下，CD73 與其他外核苷酸酶（如CD39）一起產(chǎn)生高濃度的ADO，通過與其激活的受體A2a 結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的生物途徑，從而影響腫瘤進(jìn)展和免疫抑制[49]。而CRC 中的A2a 受體在T 細(xì)胞上表達(dá)，由ADO 激活后產(chǎn)生腫瘤免疫抑制作用。反之，TME 中ADO 升高還可以通過A2b 受體介導(dǎo)的途徑上調(diào)CAFs 上的CD73，從而刺激ADO-A2b-CD73 回路，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫抑制。人結(jié)直腸癌TME 中高水平的CD73 表達(dá)與CAFs豐度，增強(qiáng)免疫抑制和預(yù)后不良呈正相關(guān)[48]。此外，有研究提示CAFs 可上調(diào)T 細(xì)胞上CD39 的表達(dá)，而T 細(xì)胞反過來上調(diào)CAFs 上CD73 的表達(dá)，由此加重抗腫瘤免疫抑制[50]。

CAFs 還通過分泌大量含膠原蛋白的ECM 來調(diào)節(jié)的免疫細(xì)胞錨定和運(yùn)輸、存活以及通過抑制免疫激活促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[51-53]。在含有密集堆積基質(zhì)纖維的基質(zhì)區(qū)域中，淋巴細(xì)胞位移減少，支持了ECM 沉積可能通過限制T 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)來改變抗腫瘤免疫反應(yīng)的觀點(diǎn)[54]。由于ECM 大量堆積使腫瘤中心含氧量減少從而導(dǎo)致CAFs 激活，產(chǎn)生上述CAFs影響免疫細(xì)胞的機(jī)制，進(jìn)一步促進(jìn)免疫抑制[55-56]?？傊?，CAFs 通過自身表達(dá)和分泌一致性免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子，以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)免疫抑制物來促進(jìn)CRC 免疫逃逸。

3 CAFs 對(duì)巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞及其他細(xì)胞的影響

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor -associated macrophages，TAMs）作為TME 的重要成分在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。TAMs 在腫瘤微環(huán)境中存在兩種表型，分別執(zhí)行不同的功能。M1 巨噬細(xì)胞能通過激活免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生腫瘤壞死因子產(chǎn)生抗腫瘤作用，而M2 巨噬細(xì)胞通過分泌免疫抑制因子發(fā)揮免疫抑制和促進(jìn)腫瘤作用[40,57]。CAFs 通過各種機(jī)制誘導(dǎo)單核細(xì)胞在CRC 中募集并分化為M2巨噬細(xì)胞。首先，CAFs 通過白細(xì)胞介素（IL）-8/CXCR2 途徑吸引單核細(xì)胞浸潤至CRC 中，并通過上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的VCAM-1 表達(dá)和CAFs 的IL-6 分泌來促進(jìn)單核細(xì)胞與CRC 黏附；其次，癌細(xì)胞介導(dǎo)CAFs 分泌IL-6 和GM-CSF 誘導(dǎo)單核細(xì)胞向M2 巨噬細(xì)胞分化，促使CRC 侵襲能力增加，導(dǎo)致CRC 患者的預(yù)后不佳[58-59]。巨噬細(xì)胞與CAFs 協(xié)同抑制自然殺傷（NK）細(xì)胞的功能，保護(hù)CRC 細(xì)胞免受NK 細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷[57]。

NK 是浸潤到TME 中的免疫細(xì)胞之一，對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用[60-61]。CAFs 分泌的TGF-β 可以抑制NK 細(xì)胞的活化和細(xì)胞毒性[62-63]，CAFs 還可產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子PGE2，并且通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞的功能[64-66]。Li 等[67]從結(jié)直腸癌標(biāo)本中提取CAFs 細(xì)胞，并與NK 細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CAFs產(chǎn)生高水平的PGE2，可以通過多種方式影響NK細(xì)胞的功能，從而產(chǎn)生免疫抑制，包括NK 受體活化，細(xì)胞毒性活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生。CAFs 誘導(dǎo)的M2 巨噬細(xì)胞可抑制NK 細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷功能，說明TAMs 和CAFs 在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮協(xié)同作用，CAFs 可以通過其他免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞的功能[59]。另有研究表示，在CRC 中使用表皮生長因子受體（EGFR）抗體可以抵消CAFs 對(duì)NK 細(xì)胞的抑制作用[68]。

中性粒細(xì)胞最初是在炎癥和損傷修復(fù)中發(fā)現(xiàn)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor associated neutrophils, TANs）亦是TME 的重要組成成分，并促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[69-70]。TANs 參與先天性和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)，并受環(huán)境影響可分化為2 種不同表型，即N1 抗腫瘤亞型和N2 促腫瘤亞型中性粒細(xì)胞[71-72]。N1 和N2 之間的可塑性通過TGF-β 和干擾素-β 信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)，如CAFs 通過分泌TGF-β 來誘導(dǎo)N2 極化，抑制TGF-β 后N1 則表達(dá)免疫激活因子和趨化因子[73]。在CRC 中，通過PGE2/EP 信號(hào)傳導(dǎo)能促進(jìn)CAFs 和TANs 的活性，從而對(duì)抗腫瘤免疫產(chǎn)生影響[74]。

4 小結(jié)

綜上所述，CRC 中的CAFs 主要通過以下方式影響抗腫瘤免疫：1）分泌大量ECM 限制CD8+T 細(xì)胞的移動(dòng)；2）通過TGF-β 通路下游的靶點(diǎn)NOX4使腫瘤對(duì)抗PD-1 耐藥，具有FAP 高表達(dá)的CAFs的腫瘤對(duì)抗PD-1 耐藥，CAFs 分泌的CCL2 是其中的主要介質(zhì)；3）CAFs 自身表達(dá)CD73 產(chǎn)生ADO 作用于T 細(xì)胞上的A2a 受體產(chǎn)生免疫抑制；4）CAFs可以通過上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的VCAM-1 表達(dá)以及分泌IL-6 來促進(jìn)單核細(xì)胞與CRC 腫瘤細(xì)胞的黏附，并誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞的極化。CAFs 和M2 協(xié)同抑制NK 細(xì)胞的功能。以上內(nèi)容表明，CAFs 不僅可通過分泌多種細(xì)胞因子或代謝產(chǎn)物抑制免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)還可以塑造腫瘤外基質(zhì)，阻止藥物及免疫細(xì)胞向腫瘤組織的深層滲透，從而降低抗腫瘤的治療效果。未來在臨床有望可以通過對(duì)CAFs 的干預(yù)聯(lián)合免疫治療，為結(jié)腸癌患者的治療帶來新思路。