賈艷妮 綜述 周慶軍 史偉云 審校

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院(山東省眼科醫(yī)院) 山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 山東第一醫(yī)科大學(xué)眼科學(xué)院,濟(jì)南 250021

Advances in the tissue-engineered corneal endothelial transplantation

JiaYanni,ZhouQingjun,ShiWeiyun

EyeInstituteofShandongFirstMedicalUniversity,EyeHospitalofShandongFirstMedicalUniversity(ShandongEyeHospital),StateKeyLaboratoryCultivationBase,ShandongProvincialKeyLaboratoryofOphthalmology,SchoolofOphthalmology,ShandongFirstMedicalUniversity,Jinan250021,China

Correspondingauthor:ShiWeiyun,Email:weiyunshi@163.com

[Abstract]Due to the serious shortage of corneal donor,the development of penetrating keratoplasty and corneal endothelial transplantation is severely restricted in clinical practice.The root cause is the limited proliferation capacity of healthy corneal endothelial cells.With the continuous development of tissue engineering technology and cell engineering technology,the research of tissue-engineered cornea has made some progress.Invitroculture of corneal endothelial cells with high density and healthy endothelial function for transplantation is a hot topic in current tissue engineering research.The keys of tissue-engineered corneal endothelial technology include seed cells,vector materials and the strategy of cell transplantation.At present,many research teams domestic and abroad have reported that the source of seed cells includes human corneal endothelial cells,stem cells,vascular endothelial cells and human amniotic epithelial cells.Vector materials include amniotic membrane,acellular corneal stroma,posterior elastic layer,anterior capsular membrane and various biomaterials.The cultured cells are transplanted by penetrating keratoplasty,corneal endothelial transplantation or anterior chamber injection.This review summarized the latest progress in the research on the source of corneal endothelial seed cells,the selection of vectors and the methods of corneal endothelial transplantation,and summed up the problems faced in the current research and looked forward to its prospects.

[Key words]Endothelium，corneal；Transplantation；Tissue engineering；Seed cells；Vectors

Fundprogram：National Natural Science Foundation of China (81700811，81900834)；Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2019ZD37，ZR2023MH187)；Taishan Scholar Program (tspd20161059)

DOI:10.3760/cma.j.cn115989-20200911-00642

角膜組織構(gòu)成眼球壁外層的前1/6,是眼球的首道屏障。眼球屈光系統(tǒng)中70%以上的屈光功能由角膜完成。角膜內(nèi)皮細(xì)胞是位于角膜后彈力層與房水之間緊貼于后彈力層后面的一層單層細(xì)胞,其是由神經(jīng)嵴分化產(chǎn)生的單層扁平六邊形細(xì)胞,細(xì)胞間存在縫隙連接,構(gòu)成了角膜基質(zhì)和房水之間的通透屏障。細(xì)胞膜上存在的Na+/K+-ATPase、水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP-1)以及離子通道共同發(fā)揮作用來(lái)維持角膜透明。隨著年齡增長(zhǎng),正常人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞中規(guī)則六邊形細(xì)胞所占比例逐漸下降,同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞密度逐漸降低。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞屬于分化終末期細(xì)胞,細(xì)胞間存在的接觸-抑制以及前房中存在的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用,從而導(dǎo)致細(xì)胞始終停留在G1期,在體內(nèi)增生和再生能力極為有限[1]。外傷、炎癥、白內(nèi)障手術(shù)、急性閉角型青光眼等造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和丟失不能再生,只能依靠周圍細(xì)胞的擴(kuò)大和移行來(lái)填補(bǔ),細(xì)胞功能急劇衰減[2]。當(dāng)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度下降到其生理臨界值(約500個(gè)/mm2)時(shí),會(huì)造成角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能失代償,出現(xiàn)角膜水腫混濁及上皮下水泡,嚴(yán)重者造成視力喪失導(dǎo)致角膜內(nèi)皮盲。目前因角膜內(nèi)皮功能失代償而需要行角膜移植手術(shù)治療的疾病主要包括大泡性角膜病變和Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良等。穿透角膜移植術(shù)由于目前尚無(wú)法克服移植后的免疫排斥反應(yīng)、術(shù)后高度散光、角膜縫線帶來(lái)的新生血管以及感染風(fēng)險(xiǎn)等并發(fā)癥,嚴(yán)重制約了其在臨床上的廣泛開(kāi)展。角膜內(nèi)皮移植術(shù)通過(guò)移植健康有功能的角膜內(nèi)皮細(xì)胞,取代受損或病變的角膜內(nèi)皮細(xì)胞從而恢復(fù)角膜透明度,相對(duì)而言,單純內(nèi)皮細(xì)胞層的移植可以降低術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生率[3]。但角膜內(nèi)皮移植術(shù)目前存在的主要問(wèn)題仍然是移植供體材料嚴(yán)重不足,因此開(kāi)發(fā)組織工程角膜具有極高的應(yīng)用前景。理想的組織工程角膜應(yīng)包括角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮,但從臨床治療和產(chǎn)品研發(fā)的角度考慮,組織工程角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮等組織工程成分角膜研發(fā)的科學(xué)性與可行性更高,且已取得顯著進(jìn)展[4-5]。針對(duì)角膜內(nèi)皮功能失代償,應(yīng)用組織工程技術(shù)體外培養(yǎng)具備規(guī)則六邊形形態(tài)和健康內(nèi)皮功能的高密度角膜內(nèi)皮種子細(xì)胞來(lái)替代供體角膜內(nèi)皮是目前研究的熱點(diǎn)。本文就組織工程角膜內(nèi)皮移植的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 角膜內(nèi)皮種子細(xì)胞的來(lái)源

種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的核心要素,也是組織工程角膜內(nèi)皮相關(guān)研究的難點(diǎn),選擇的種子細(xì)胞要能夠形成單層角膜內(nèi)皮細(xì)胞。當(dāng)前研究的種子細(xì)胞的主要來(lái)源包括人原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞等。

1.1 人角膜內(nèi)皮細(xì)胞

人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的再生能力有限[6],雖然人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中難以增生,但其自身的增生能力仍然保留,在離體條件下加入細(xì)胞外基質(zhì)或生長(zhǎng)因子能促進(jìn)其增生。已報(bào)道的生長(zhǎng)因子包括纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子B、白細(xì)胞介素1β及胰島素樣生長(zhǎng)因子1等[7]。Yokoo等[8]通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)對(duì)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),在添加生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成細(xì)胞球,在包含層黏連蛋白及胎牛內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞球繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞球傳代貼壁培養(yǎng)后可以分化為成熟的角膜內(nèi)皮細(xì)胞,與人角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有相似的形態(tài)及功能,因此這些克隆細(xì)胞被命名為“角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞”。Choi等[9]在組織培養(yǎng)板上涂覆膠原Ⅳ、纖維連接蛋白或纖維連接蛋白-膠原復(fù)合涂層混合物來(lái)改善體外培養(yǎng)過(guò)程中角膜內(nèi)皮細(xì)胞的初始附著狀態(tài)。通過(guò)改良細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞培養(yǎng)液可能有利于內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn),在角膜內(nèi)皮損傷模型中角膜后彈力層對(duì)于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的再生有促進(jìn)作用。Peh等[11]和Koizumi等[12]研究證明,ROCK信號(hào)通路的抑制劑Y-27632能夠促進(jìn)細(xì)胞增生、抑制凋亡和增加細(xì)胞黏附。由于“接觸-抑制”人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)的增生能力有限,這一特性阻礙了人角膜內(nèi)皮細(xì)胞用于移植的可能性。Liu等[13]和Zhu等[14]發(fā)現(xiàn),激活LIF-JAK1-STAT3信號(hào)通路或激活p120/Kaiso信號(hào)調(diào)節(jié)ROCK信號(hào)通路能夠解除“接觸-抑制”,從而促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增。

1.2 胚胎/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和其他成體干細(xì)胞

研究顯示,胚胎干細(xì)胞具有分化多能性的特點(diǎn)和無(wú)限增生的能力,是組織工程角膜內(nèi)皮種子細(xì)胞的理想來(lái)源,然而倫理問(wèn)題、免疫排斥和畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)限制了其在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用。McCabe等[15]在體外將胚胎干細(xì)胞在TGF-β信號(hào)通路抑制劑Noggin和SB431542的作用下誘導(dǎo)分化為神經(jīng)嵴細(xì)胞后,加入Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK2,進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞,誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠表達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物ZO-1及Na+/K+-ATPase,同時(shí)能夠分泌后彈力層的主要膠原蛋白Ⅷα1和Ⅷα2。Zhang等[16]采用角膜基質(zhì)細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞將其誘導(dǎo)分化為眼周間充質(zhì)前體,再分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞,體外檢測(cè)其功能。將誘導(dǎo)的細(xì)胞種植于脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮,該內(nèi)皮植片移植于角膜內(nèi)皮失代償?shù)耐媚Ｐ蛯?shí)驗(yàn)顯示,術(shù)后角膜逐漸恢復(fù)透明,術(shù)后28 d角膜厚度基本恢復(fù)正常。但目前的誘導(dǎo)方案存在誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)、分化效率低、體內(nèi)功能差、移植存活時(shí)間較短或無(wú)法維持穩(wěn)定等不足,仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是通過(guò)導(dǎo)入外源基因使體細(xì)胞去分化形成自體來(lái)源的多能干細(xì)胞,具有分化出多種組織細(xì)胞的潛能。與人胚胎干細(xì)胞相比,具有低免疫原性,從而避免了移植后的免疫排斥問(wèn)題。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)將人多能干細(xì)胞體外改變培養(yǎng)環(huán)境分期誘導(dǎo)分化的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞能夠表達(dá)明顯的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物N-Cadherin和Na+/K+-ATPase,可作為一個(gè)快速體外誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。Menendez等[18]采用GSK3和Smad的抑制劑誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)嵴細(xì)胞分化,考慮GSK3的抑制劑激活了Wnt信號(hào)通路,而Smad的抑制劑抑制了TGF-β信號(hào)通路,從而發(fā)揮了作用。Wagoner等[19]在此基礎(chǔ)上將神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞,表達(dá)緊密連接蛋白(zonula occludens 1,ZO-1)、鈣粘蛋白(N-Cadherin)、AQP-1及Na+/K+-ATPase等內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物?；旌瞎才囵B(yǎng)體系也是誘導(dǎo)細(xì)胞分化的一種常見(jiàn)方法,招志毅等[20]將多能干細(xì)胞與兔原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果顯示其能夠促進(jìn)多能干細(xì)胞在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)上向角膜內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。但由于來(lái)自體細(xì)胞的表觀遺傳記憶﹑生物安全因素和相關(guān)的腫瘤發(fā)生,目前多能干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)應(yīng)用仍十分有限。

Yu等[21]研究發(fā)現(xiàn),成體干細(xì)胞存在于周圍角膜內(nèi)皮與小梁前部的過(guò)渡區(qū)域,將該區(qū)域的細(xì)胞通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志物,具有較強(qiáng)的增生能力。Inagaki等[22]將人角膜基質(zhì)細(xì)胞和人皮膚細(xì)胞體外反向誘導(dǎo)為類神經(jīng)嵴細(xì)胞的前體細(xì)胞,再將其誘導(dǎo)為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞,在兔角膜內(nèi)皮失代償?shù)哪Ｐ腕w內(nèi)可見(jiàn)術(shù)后角膜透明度有所恢復(fù),角膜水腫部分緩解,但術(shù)后觀察時(shí)間較短,長(zhǎng)期療效有待進(jìn)一步研究。角膜內(nèi)皮細(xì)胞前體和角膜基質(zhì)及皮膚前體成球?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)可能成為角膜內(nèi)皮細(xì)胞的潛在來(lái)源。

其他來(lái)源的干細(xì)胞還包括臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞﹑脂肪源性干細(xì)胞﹑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等[23-25]。在眼發(fā)育的早期階段,來(lái)源于神經(jīng)嵴的間充質(zhì)細(xì)胞受到晶狀體上皮產(chǎn)生的胞外信號(hào)的影響發(fā)育分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞,臍帶血中含有原始的間充質(zhì)干細(xì)胞。Joyce等[23]研究證明,臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在模擬晶狀體上皮細(xì)胞條件的培養(yǎng)基中可定向誘導(dǎo)分化為具有人角膜內(nèi)皮表型的細(xì)胞,在體外角膜培養(yǎng)模型中能夠逐漸填補(bǔ)損傷或缺失的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。成年人脂肪組織已經(jīng)被證明是自體干細(xì)胞的理想來(lái)源,具備干細(xì)胞的特性且易于獲得,被稱為“人體脂肪成體干細(xì)胞”,可以分化為多種類型的細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等[26]。Alio等[27]將人脂肪成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞以脫細(xì)胞人角膜基質(zhì)為載體行兔角膜內(nèi)皮移植,術(shù)后觀察3個(gè)月角膜植片仍維持透明。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓內(nèi)的一種未分化細(xì)胞,可多向分化為間葉細(xì)胞(如視網(wǎng)膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等)和其他胚層細(xì)胞。Shao等[25]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞,以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為載體,在貓的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的模型體內(nèi)可見(jiàn)術(shù)后角膜水腫逐漸減輕,角膜恢復(fù)透明并維持穩(wěn)定。

1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞的胚胎期來(lái)源不同,但是具有相似的結(jié)構(gòu)與功能:(1)它們均是位于液體面與實(shí)質(zhì)面之間的單層內(nèi)皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞介于血液與血管基質(zhì)之間,承受血壓;角膜內(nèi)皮細(xì)胞介于房水與角膜基質(zhì)之間,承受眼壓,二者均可阻止過(guò)多水分進(jìn)入實(shí)體組織;(2)二者都具有液泵功能,從液體層中獲取養(yǎng)分和清除代謝產(chǎn)物,并且二者細(xì)胞膜上都具有維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡功能的離子泵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),即Na+/K+-ATPase和1、4型AQP。此外,二者也具有各自的特殊性,人角膜內(nèi)皮細(xì)胞是非再生細(xì)胞,而血管內(nèi)皮細(xì)胞屬于可再生細(xì)胞。吳小莉等[28]取體外培養(yǎng)的第3代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,以處理過(guò)的人羊膜為載體在貓眼內(nèi)皮失代償模型上行細(xì)胞移植,大部分角膜均在移植后3 d內(nèi)逐漸恢復(fù)透明,水腫逐漸消退,1周后完全透明。術(shù)后2周取材植片,可見(jiàn)移植的內(nèi)皮細(xì)胞呈單層連續(xù)排列,羊膜與基質(zhì)貼附緊密,基質(zhì)可見(jiàn)輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)明顯水腫,說(shuō)明移植的內(nèi)皮細(xì)胞在前房?jī)?nèi)發(fā)揮泵水功能和物理屏障作用。此實(shí)驗(yàn)表明,以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞行角膜內(nèi)皮移植具有一定的可行性。

1.4 人羊膜上皮細(xì)胞

人羊膜上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的某些特性,具有多向分化潛能,而且其無(wú)致瘤性、免疫原性低、不引起倫理爭(zhēng)議,可能可以作為角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞[29-30]。

2 載體的來(lái)源

正常的角膜內(nèi)皮為單層細(xì)胞,其易脆性決定了單純移植內(nèi)皮細(xì)胞層手術(shù)操作困難,選擇合適的支架材料作為內(nèi)皮細(xì)胞的載體進(jìn)行移植能夠減少手術(shù)操作的難度。理想的支架材料需滿足以下特性:(1)良好的組織生物相容性;(2)具有與人角膜基質(zhì)相似的理化性能,如透明性、一定的機(jī)械性等;(3)材料的降解/溶解速率與移植的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮功能的速率相匹配。

2.1 羊膜

羊膜基底膜具有透明度好、無(wú)免疫原性的特點(diǎn),其包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、Ⅳ型膠原及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等成分,能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。將角膜內(nèi)皮細(xì)胞種植于羊膜基底膜培養(yǎng),細(xì)胞融合后大部分細(xì)胞呈現(xiàn)大小均勻的六邊形鋪路石樣規(guī)則形態(tài)。羊膜能維持人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能,可以作為載體用于人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的移植[31]。但羊膜基底膜作為載體材料的缺點(diǎn)是韌性差、無(wú)曲率,在板層結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性方面不能替代占角膜主要厚度的基質(zhì)層。

2.2 脫細(xì)胞角膜基質(zhì)片

天然的角膜基質(zhì)層具有生理曲度,異體角膜片作為載體材料是較為理想的來(lái)源,但其缺點(diǎn)是移植的角膜內(nèi)皮細(xì)胞容易被異體角膜片的上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞污染,同時(shí)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)性大大增加。因此不少研究者開(kāi)始應(yīng)用滅活的角膜基質(zhì)片作為細(xì)胞載體進(jìn)行研究,以減少細(xì)胞污染的可能和免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。通過(guò)理想的脫細(xì)胞過(guò)程可徹底清除異種移植材料的細(xì)胞和抗原分子,降低宿主免疫反應(yīng)。脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有生物相容性好、易于神經(jīng)的再生、良好的力學(xué)特性和透光性等優(yōu)點(diǎn)。脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)和牛角膜基質(zhì)片來(lái)源廣泛,可能成為替代人角膜基質(zhì)的載體材料,以豬角膜基質(zhì)為首選。鹿曉燕等[32]采用小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞,種植于磷脂酶A2和碳酸氫鹽溶液脫細(xì)胞法制備的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)角膜內(nèi)皮植片,能夠發(fā)揮角膜內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮泵功能,可考慮作為角膜移植的良好供體。Zhang等[33]采用新鮮豬角膜基質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉溶液處理后獲得脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)作為支架三維構(gòu)建組織工程角膜用于兔穿透角膜移植,術(shù)后角膜透明度逐漸恢復(fù),術(shù)后4周角膜幾乎完全恢復(fù)透明。但此實(shí)驗(yàn)僅觀察了移植后短期內(nèi)的效果,其長(zhǎng)期效果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。本課題組采用一種保護(hù)性脫細(xì)胞策略,在一定膠體滲透壓的保護(hù)介質(zhì)中用去垢劑和內(nèi)皮酶處理角膜制備脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)片,目前已應(yīng)用于臨床需行板層角膜移植患者的手術(shù)治療[34],采用該脫細(xì)胞方式制備的內(nèi)皮載體基質(zhì)片的長(zhǎng)期有效性仍需進(jìn)一步研究。

2.3 后彈力層

后彈力層緊貼角膜內(nèi)皮細(xì)胞,由其分泌形成,含有層粘連蛋白和Ⅳ型膠原,對(duì)病理?yè)p害及化學(xué)物質(zhì)的抵抗力較強(qiáng)。后彈力層是角膜內(nèi)皮細(xì)胞的天然底物,具有過(guò)濾液體和引導(dǎo)細(xì)胞分化的作用。以角膜后彈力層作為載體材料具有術(shù)后散光小的優(yōu)點(diǎn),而且符合角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生理解剖[35]。該載體有望成為培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用于臨床移植的供體材料。但后彈力層相對(duì)較薄,操作困難,對(duì)手術(shù)醫(yī)師操作技巧要求較高,目前臨床移植的廣泛開(kāi)展受到限制。

2.4 晶狀體前囊膜

Yoeruek等[36]將人角膜內(nèi)皮細(xì)胞接種到晶狀體前囊膜進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞在晶狀體前囊膜上呈單層生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)以多邊形為主,細(xì)胞平均密度約為(3 012±109)個(gè)/mm2,免疫組織化學(xué)特性與正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞相似,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有的晶狀體前囊膜保持透明,說(shuō)明人晶狀體前囊膜是體外培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的良好天然載體。目前關(guān)于以晶狀體前囊膜為載體構(gòu)建植片體內(nèi)移植的研究較少,需要進(jìn)一步研究將帶有內(nèi)皮細(xì)胞的晶狀體前囊膜移植到體內(nèi)的情況。

2.5 生物材料

生物材料是用于人體組織和器官的診斷、修復(fù)或增強(qiáng)其功能的一類高技術(shù)材料,可用于取代、修復(fù)活體組織。McLaughlin等[37]將2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿作為細(xì)胞外基質(zhì)的模擬物替代天然角膜基質(zhì),通過(guò)穿透角膜移植的方式將其作為全層移植物植入豚鼠模型,結(jié)果顯示植入物促進(jìn)了角膜細(xì)胞、神經(jīng)和淚膜的再生,同時(shí)保持了光學(xué)清晰度。絲素蛋白具有良好的生物相容性,但力學(xué)性能較差;聚乳酸-己內(nèi)酯具有良好的力學(xué)性能,但生物相容性較差。Chen等[38]將絲素蛋白與聚乳酸-己內(nèi)酯共混制備的支架,既保持了這2種材料的優(yōu)點(diǎn),又克服了其缺點(diǎn)。該支架具有較好的透射率和促進(jìn)細(xì)胞增生的作用,這些特性進(jìn)一步說(shuō)明了該支架在角膜內(nèi)皮移植中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

3 角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植方法

3.1 穿透角膜移植術(shù)

穿透角膜移植術(shù)是通過(guò)移植構(gòu)建的全層組織工程角膜,取代受損或病變角膜來(lái)恢復(fù)角膜透明度的手術(shù)方法,將培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞種植于載體上以達(dá)到治療的目的。Zhang等[33]將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為載體構(gòu)建組織工程角膜行兔穿透角膜移植術(shù),術(shù)后角膜水腫逐漸減輕,術(shù)后4周角膜厚度基本恢復(fù)至正常角膜厚度,但角膜植片部分仍混濁。但穿透角膜移植手術(shù)創(chuàng)傷較大,術(shù)后植片發(fā)生免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)較高,而且載體的穩(wěn)定性、生物安全性及光學(xué)性直接影響手術(shù)后的效果,限制了其在臨床上的應(yīng)用。

3.2 角膜內(nèi)皮移植術(shù)

將培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞種植于載體構(gòu)建內(nèi)皮移植片,行角膜內(nèi)皮移植術(shù)治療角膜內(nèi)皮失代償是目前組織工程角膜內(nèi)皮研究中的主要移植手術(shù)方式。Yoshida等[39]將培養(yǎng)的成體人角膜內(nèi)皮細(xì)胞種植于膠原玻璃凝膠載體上,構(gòu)建了透明且生物相容的可移植的人工內(nèi)皮移植物。Koizumi等[12]將成體猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞于體外培養(yǎng)擴(kuò)增,以帶后彈力層的人后板層薄基質(zhì)片為載體,細(xì)胞在載體后彈力層面貼附生長(zhǎng)良好。將植片移植于猴角膜內(nèi)皮功能失代償?shù)哪Ｐ秃?周角膜恢復(fù)透明,基質(zhì)水腫逐漸消退,觀察8個(gè)月角膜未見(jiàn)明顯排斥反應(yīng)。角膜內(nèi)皮移植術(shù)手術(shù)創(chuàng)傷較穿透角膜移植術(shù)小,術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也明顯降低,但其手術(shù)技巧要求較高,術(shù)中操作不當(dāng)可能造成內(nèi)皮細(xì)胞大面積丟失,而且對(duì)載體的透明度、彈性及韌性也有較高要求。

3.3 細(xì)胞前房注射術(shù)

細(xì)胞前房注射術(shù)是將培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)前房注射的方法移植,移植的受體需刮除自體的內(nèi)皮細(xì)胞,移植的細(xì)胞貼附于角膜后彈力層發(fā)揮內(nèi)皮功能。該手術(shù)方式的關(guān)鍵在于如何使內(nèi)皮細(xì)胞在前房?jī)?nèi)迅速貼附于后彈力層。Mimura等[40]利用鐵離子在磁場(chǎng)中具有良好的控制性能來(lái)定位移植的細(xì)胞貼附于后彈力層,體內(nèi)外研究結(jié)果顯示標(biāo)記鐵離子的內(nèi)皮細(xì)胞很容易整合到受體的后彈力層表面,術(shù)后12個(gè)月角膜透明度保持良好。但這種方法術(shù)后需保持眼球朝下位24 h,其臨床開(kāi)展需進(jìn)一步行試驗(yàn)驗(yàn)證。Patel等[41]利用超順磁性微球來(lái)定位培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞于后彈力層的體外模型,但其體內(nèi)動(dòng)物模型需進(jìn)一步研究。Koizumi等[12]研究發(fā)現(xiàn),Rho激酶抑制劑Y-27632可促進(jìn)培養(yǎng)的猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼壁,具有抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增生的作用,同時(shí)也有利于兔角膜內(nèi)皮創(chuàng)傷的愈合。將培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合Y-27632制作兔眼前房注射模型,術(shù)后保持眼部朝下位3 h促進(jìn)細(xì)胞貼附,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,加入Y-27632能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的貼附并發(fā)揮功能,促進(jìn)角膜水腫消退。后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)角膜內(nèi)皮失代償?shù)暮锬Ｐ头謩e進(jìn)行猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合Y-27632及人角膜內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合Y-27632前房注射,均驗(yàn)證了該手術(shù)方式的可行性[42]。該研究組最新的臨床試驗(yàn)將人角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外擴(kuò)增后以前房注射的方式移植給大泡性角膜病變的患者,結(jié)果顯示術(shù)后24周,角膜厚度基本恢復(fù)至正常水平,術(shù)后視力有不同程度提高[43]。該手術(shù)方式未破壞前房免疫偏離狀態(tài),減少了術(shù)后免疫排斥的發(fā)生。但研究結(jié)果顯示,前房?jī)?nèi)注射的細(xì)胞只有40%～50%貼附于后彈力層,其余的細(xì)胞有可能貼附于虹膜及晶狀體表面,甚至沉積于小梁網(wǎng)處增生造成眼壓升高,需進(jìn)一步研究觀察。該手術(shù)方式具有不需要載體的優(yōu)點(diǎn),但細(xì)胞移植后需要在體內(nèi)重新形成細(xì)胞連接從而發(fā)揮內(nèi)皮功能。本課題組將細(xì)胞前房注射移植的手術(shù)方式進(jìn)行了改良,采用Accutase細(xì)胞消化液將培養(yǎng)的兔內(nèi)皮細(xì)胞離解為主要包含4～10個(gè)細(xì)胞的迷你植片,通過(guò)前房注射的方式移植于刮除角膜內(nèi)皮細(xì)胞的新西蘭大白兔模型。以單細(xì)胞前房注射移植的兔模型作為對(duì)照,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,迷你植片能夠促進(jìn)移植細(xì)胞貼附于后彈力層、形成細(xì)胞連接及發(fā)揮角膜內(nèi)皮泵的功能,迷你植片前房注射的手術(shù)方式結(jié)合了目前傳統(tǒng)角膜內(nèi)皮移植術(shù)與單細(xì)胞前房注射移植的優(yōu)點(diǎn)[44]。同時(shí),本課題組目前研究還發(fā)現(xiàn)在角膜內(nèi)皮細(xì)胞前房注射移植的過(guò)程中加入層粘連蛋白511能夠促進(jìn)移植細(xì)胞貼附及發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞功能[45]。

目前,組織工程角膜內(nèi)皮的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究成為研究熱點(diǎn),角膜內(nèi)皮重建與移植研究發(fā)展迅速,其相關(guān)研究成果若成功應(yīng)用于臨床,將解決目前存在的角膜供體來(lái)源不足、供體角膜老齡化等若干問(wèn)題,為角膜盲患者帶來(lái)希望。但其臨床應(yīng)用還存在著許多問(wèn)題亟待解決,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床研究。組織工程角膜內(nèi)皮移植目前多處于實(shí)驗(yàn)階段,真正應(yīng)用于臨床尚需時(shí)間,主要原因有很多,如合理選擇種子細(xì)胞、高效率地培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞、正確選擇載體及手術(shù)技術(shù)的改良等。篩選來(lái)源廣泛、易于誘導(dǎo)為能夠發(fā)揮功能的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞,又能降低免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生和避免致瘤性的種子細(xì)胞,也是組織工程角膜內(nèi)皮研究的重點(diǎn)。在載體的研究上,需要考慮材料的降解及溶解性、免疫原性以及在人體內(nèi)的長(zhǎng)期效應(yīng),選擇的載體能最大程度模擬體內(nèi)環(huán)境,同時(shí)要求載體在體內(nèi)微環(huán)境中能保持性狀穩(wěn)定。角膜內(nèi)皮細(xì)胞種植后密度達(dá)不到臨床治療的要求,細(xì)胞種植后在載體上增生緩慢,需借助其他措施,如改善培養(yǎng)條件和環(huán)境來(lái)增加角膜內(nèi)皮細(xì)胞的貼附力、提高種植密度、增加種植次數(shù)、盡量降低角膜內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源供體年齡、利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)促進(jìn)細(xì)胞的增生和貼附等,相關(guān)問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。另外,需深入研究如何在不損害材料的結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性的同時(shí)降低載體材料的免疫原性。材料降解過(guò)早可能會(huì)導(dǎo)致移植細(xì)胞貼附不良甚至脫落死亡,而降解過(guò)晚則可能誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。也需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)調(diào)控材料的降解速率。前房注射細(xì)胞法進(jìn)行角膜內(nèi)皮移植是組織工程內(nèi)皮移植手術(shù)的巨大變革,該手術(shù)方式的改進(jìn)可能將組織工程角膜的研究從種子細(xì)胞和載體2個(gè)方面轉(zhuǎn)向于只考慮種子細(xì)胞的研究,加速了相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)程。未來(lái)通過(guò)國(guó)內(nèi)外研究者的不斷努力,這些問(wèn)題會(huì)逐步解決,具有正常角膜功能的組織工程角膜在臨床治療中的應(yīng)用,將使角膜內(nèi)皮功能失代償患者能夠重見(jiàn)光明。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突