何俊葉

劉 成

于寵洋

孫朋朋

任圓圓

(長江大學生命科學學院,湖北 荊州 434025)

黃皮,蕓香科黃皮屬喬木植物,主要分布在中國南方和東南亞的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。黃皮果具有獨特的味道和豐富的生物活性物質(zhì),深受消費者歡迎[2]。黃皮的每一個部位都具有極高的藥用價值:種子可治疝氣;果皮可消風腫、去疳積;果肉可健胃消食、順氣鎮(zhèn)咳,有潤肺生津、清熱消暑的功效[3]。Wu等[4]發(fā)現(xiàn)黃皮酸性多糖具有抗氧化能力;Song等[5]研究發(fā)現(xiàn)黃皮果膠具有益生元功能。

植物多糖是自然界來源最廣泛的多糖,無細胞毒性,而且某些多糖已被臨床用于疾病治療和健康改善[6]。據(jù)報道[7-10],植物多糖具有很多生物活性,如抗腫瘤、抗細胞凋亡、抗病毒、抗凝血、抗氧化、降血糖、鎮(zhèn)痛和抗疲勞等。

糖尿病,是一種以高血糖為特征的代謝紊亂疾病,目前尚缺乏治療糖尿病的有效方法,臨床上還是以降糖藥物為主[11]。但是,這些藥物通常有一定的副作用,或者對患者的依從性較差,不能完全滿足患者的需求。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)刺梨多糖有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的能力;趙凱迪等[13]研究表明桔梗多糖對2型糖尿病大鼠有降低血糖作用,但有關(guān)黃皮多糖降血糖活性的研究尚未見報道。研究擬從黃皮果肉、果皮和種子3個部位提取多糖,比較其結(jié)構(gòu)特性和抗氧化性,并重點分析其體外降血糖活性,旨在提高黃皮的利用率,為其抗氧化產(chǎn)品和防治糖尿病藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃皮:市售;

α-淀粉酶(豬胰腺)、α-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、半乳糖醛酸:上海源葉生物科技有限公司;

甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、溴化鉀:上海麥克林生化科技股份有限公司;

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型,上?？粕齼x器有限公司;

離心機:Allegra 25R型,默瑞(上海)生物科技有限公司;

紫外分光光度計:UV-2600型,島津企業(yè)管理(中國)有限公司;

傅里葉變換紅外光譜儀:IR-960型,天津瑞岸科技有限公司;

掃描電鏡:TESCAN VEGA3型,泰思肯(中國)有限公司;

高效液相色譜儀:Waters e2695型,美國沃特斯公司;

高效液相色譜儀:LC1200型,安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃皮不同部位粗多糖提取 取一定量的黃皮果肉、果皮和種子。果肉打漿,加入兩倍體積的無水乙醇脫脂;果皮和種子剪碎,50 ℃烘干,粉碎,加無水乙醇(濕重的4倍)攪拌24 h脫脂,10 000 r/min離心15 min,沉淀干燥后粉碎,待用。

取一定量黃皮果肉、果皮和種子干燥粉末,以料液比(m粉末∶V水)1∶40 (g/mL)熱水浴(80 ℃)連續(xù)提取3次,每次2 h(黃皮種子在第一次熱水提取時加入高溫淀粉酶除淀粉),10 000 r/min離心15 min,合并上清濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮至原體積的1/5。準確量取濃縮液,加入4倍體積的無水乙醇,邊加邊攪拌,4 ℃靜置20 h,10 000 r/min離心15 min,沉淀用少量去離子水復溶,用截留相對分子質(zhì)量100 000的透析袋透析72 h,冷凍干燥得到黃皮果肉、果皮和種子粗多糖,將其分別命名為CWP-F、CWP-P和CWP-S。

1.3.2 化學組成測定

(1) 總糖含量:采用苯酚—硫酸法[14]。

(2) 還原糖含量:采用DNS法[15]。

(3) 蛋白質(zhì)含量:采用考馬斯亮藍法[16]。

1.3.3 相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠滲透色譜法。色譜柱為TSK gel G4000PWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm);柱溫30 ℃;示差折光檢測器(RID)溫度35 ℃;流動相為超純水;流速0.6 mL/min。采用標準葡聚糖(T-10、T-40、T-70、T-110、T-500和T-2000)繪制標準曲線。

1.3.4 單糖組成 分別稱取10 mg CWP-F、CWP-P和CWP-S于樣品瓶中,加入4 mL三氟乙酸(2 mol/L)溶液溶解,110 ℃油浴4 h,分3次加入甲醇溶液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去三氟乙酸。單糖標準品和樣品水解液經(jīng)PMP柱前衍生法進行分析。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為乙腈—0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4—NaOH,pH 6.9)(V乙腈∶V磷酸緩沖液=40∶60),流動相B為乙腈—0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4—NaOH,pH 6.9)(V乙腈∶V磷酸緩沖液=15∶85);梯度洗脫(0～10 min,2%～6% A;10～22 min,6%～12% A;22～26 min,12%～9% A;26～40 min,9%～2% A;40～42 min,2% A);柱溫30 ℃;流速1 mL/min;檢測波長245 nm;進樣體積10 μL。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR) 將樣品與溴化鉀按m樣品∶m溴化鉀為1∶100混勻,充分研磨后壓片,利用傅里葉紅外光譜(FTIR)進行掃描,掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.6 掃描電鏡(SEM) 取適量樣品,用導電膠固定后進行鍍金,掃描電子顯微鏡于20 kV下放大500,2 000倍對樣品的表面形態(tài)進行觀察并拍照。

1.3.7 體外抗氧化性

(1) DPPH自由基清除能力:根據(jù)文獻[17]并修改。將3 mL乙醇—DPPH(0.1 mmol/L)溶液分別加入到2 mL質(zhì)量濃度為0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL的多糖樣品溶液中,混勻,避光30 min,測定517 nm處吸光值。以VC作為陽性對照,按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中:

a——DPPH自由基清除率,%;

A1——樣品組吸光度;

A2——樣品對照組吸光度;

A0——空白組吸光度。

(2) 羥自由基清除能力:參考文獻[18]。

(3) 總還原力:根據(jù)文獻[19]并修改。分別取1 mL質(zhì)量濃度為0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL的多糖樣液,依次加入2 mL PBS(0.2 mol/L,pH 6.6)和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴30 min,冷卻至室溫,加入1 mL 10%三氯乙酸,4 500 r/min離心10 min,取2 mL上清液,加0.1 mL 0.1%三氯化鐵和3 mL去離子水,避光反應20 min,測定700 nm處吸光值。

1.3.8 體外降血糖活性

(1)α-淀粉酶抑制率:根據(jù)文獻[20]。

(2)α-葡萄糖甘酶抑制率:根據(jù)文獻[21]并修改。分別取30 μL不同濃度的樣液于96孔板中,加入30 μLα-葡萄糖苷酶溶液(0.5 U/mL),37 ℃孵育10 min,加入30 μL PNPG溶液(5 mmol/L),37 ℃孵育30 min,加入60 μL Na2CO3溶液(0.2 mmol/L)終止反應,測定405 nm處吸光值,以阿卡波糖為陽性對照。按式(2)計算多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(2)

式中:

b——α-葡萄糖苷酶的抑制率,%;

A1——樣品組吸光度;

A2——樣品對照組吸光度;

A3——空白組吸光度;

A4——空白對照組吸光度。

(3) 抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶動力學分析:根據(jù)文獻[22]并修改。固定α-淀粉酶(5 U/mL)活力,測定不同質(zhì)量濃度CWP-F(0,2,4,6 mg/mL)和CWP-P(0,0.025,0.050,0.100 mg/mL)存在時,對應體系的反應速率隨底物質(zhì)量濃度(1,2,4,8,10 mg/mL)的變化。固定α-葡萄糖苷酶(0.5 U/mL)活力,測定不同質(zhì)量濃度CWP-F(0,2,4,6 mg/mL)和CWP-P(0,0.005,0.010,0.050 mg/mL)存在時,對應體系的反應速率隨底物濃度(1,2,4,8,10 mmol/L)的變化。

Lineweaver-Burk方程:

(3)

混合型抑制:

(4)

(5)

(6)

式中:

v——酶促反應速率,μmol/min;

Vmax——最大酶反應速率,μmol/min;

[S]——淀粉質(zhì)量濃度或?qū)ο趸交?α-D-吡喃葡萄糖苷濃度,mg/mL或mmol/L;

c——CWP-F和CWP-P質(zhì)量濃度,mg/mL;

Km——米氏常數(shù);

Ki——抑制劑與酶結(jié)合的平衡常數(shù);

Kis——抑制劑與酶—底物復合物結(jié)合的平衡常數(shù);

k——斜率;

b——截距。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗均重復3次,利用Origin軟件繪圖,采用SPSS軟件進行差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃皮不同部位多糖的化學組成

由表1可知,從黃皮不同部位提取的粗多糖的化學組成明顯不同(P<0.05),其中果肉部位提取的多糖含量最高,且蛋白質(zhì)含量最低;果皮部位的多糖含量最低,但還原糖含量最高;種子部位的總糖、蛋白質(zhì)含量最高。

表1 黃皮不同部位粗多糖的化學組成?

2.2 相對分子質(zhì)量分布

由圖1可知,CWP-F、CWP-P和CWP-S的峰均不對稱,說明其存在不同相對分子量的黃皮多糖組分。根據(jù)標準曲線lgMw=-0.342 3t+9.421,R2=0.995 6,計算每種多糖第1個峰所對應的相對分子質(zhì)量分別為5 776 600,5 681 800,1 993 300,其中CWP-S的相對分子質(zhì)量顯著低于CWP-F和CWP-P。

圖1 多糖液相色譜圖

2.3 單糖組成

由表2可知,CWP-F、CWP-P和CWP-S 3種多糖均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,但各自比例(摩爾分數(shù))不同。此外,CWP-P還含有鼠李糖,但只占0.06%。CWP-F、CWP-P和CWP-S中占比最大的單糖分別為半乳糖(60.10%)、半乳糖醛酸(35.54%)和葡萄糖(89.77%)。3個樣品的單糖組成及摩爾分數(shù)有所差異,主要是樣品來源部位不同引起的。

表2 CWP-F、CWP-P和CWP-S的單糖組成

2.4 傅里葉變換紅外光譜

由圖2可知,3 407 cm-1處吸收峰是由—OH的伸縮振動引起的,2 932 cm-1附近吸收峰是—CH2基團中C—H的不對稱伸縮振動引起的[23]。CWP-F和CWP-P在1 751 cm-1附近的吸收峰歸屬為被酯化的羧基(—COOR),CWP-F、CWP-P和CWP-S在1 641 cm-1附近的吸收峰歸屬為離子化的羧基(—COO—)[24]。CWP-S在1 549 cm-1處的吸收峰歸屬為N—H彎曲振動[25]。CWP-F和CWP-P在1 447 cm-1以及CWP-S在1 419 cm-1處的吸收峰是由C—H彎曲振動引起的[20]。CWP-F、CWP-P和CWP-S在1 238 cm-1附近的吸收峰歸屬于C—O伸縮振動,在1 146,1 027 cm-1處的吸收峰歸屬于C—O—C拉伸振動[21]。CWP-F和CWP-S在1 081 cm-1以及CWP-P在1 104 cm-1處的吸收峰表示有β-半乳聚糖,在1 027 cm-1處的峰表示有阿拉伯聚糖[26]。CWP-S在935 cm-1處的吸收可能與糖單元之間的β-糖苷鍵有關(guān)[27]。CWP-F、CWP-P和CWP-S在841 cm-1處的峰表明存在α-糖苷鍵;在765,711 cm-1處的吸收峰表明存在呋喃環(huán)[26]。綜上,CWP-F、CWP-P和CWP-S是含有羥基、羧基、α-糖苷鍵和呋喃糖環(huán)的阿拉伯半乳聚糖,而CWP-S還具有β-糖苷鍵構(gòu)型。

圖2 多糖紅外光譜圖

2.5 掃描電子顯微鏡

由圖3可知,CWP-F呈連續(xù)的片狀結(jié)構(gòu),表面光滑且有褶皺;CWP-P由許多帶有分支的小片連成,且片與片之間有很大的空隙;CWP-S由許多不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)堆成,有空隙。3個樣品微觀結(jié)構(gòu)差異可能是由于它們的相對分子質(zhì)量和單糖組成不同,從而影響了分子內(nèi)氫鍵與多糖之間的相互作用,形成不同結(jié)構(gòu)[28]。

圖3 多糖掃描電子顯微鏡圖

2.6 體外抗氧化性

2.6.1 DPPH自由基清除率 由圖4(a)可知,CWP-F、CWP-P和CWP-S均具有清除DPPH自由基的能力,且隨質(zhì)量濃度的增大而增大(P<0.05),在1 mg/mL時達到最大值,分別為73.81%,75.62%和41.26%。此外,3種多糖清除DPPH自由基的能力大小依次為CWP-P>CWP-F>CWP-S。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

2.6.2 羥自由基清除率 由圖4(b)可知,3種多糖均具有清除羥自由基的能力,CWP-P的清除力與其質(zhì)量濃度成正比(P<0.05),在1 mg/mL時達到了45.38%,而CWP-F和CWP-S的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加無明顯變化。此外,CWP-F、CWP-P和CWP-S的羥自由基清除率均明顯低于維生素C的,其清除能力大小為CWP-P>CWP-F>CWP-S。

2.6.3 總還原力 由圖4(c)可知,CWP-F和CWP-P具有一定的還原力,且隨質(zhì)量濃度的增加顯著增大(P<0.05),在1 mg/mL時達到了最大值,分別為0.30和0.86。而CWP-S的還原力較弱。

綜上,CWP-P具有最強的抗氧化力,CWP-F的次之,CWP-S的較弱。多糖具有抗氧化能力,可能是其結(jié)構(gòu)中的氫與附近的自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的自由基,從而結(jié)束自由基鏈式反應[29]。此外,Wang等[30]認為半乳糖醛酸的存在會螯合金屬離子,隨后清除DPPH自由基,而CWP-P單糖組成中含量最多的為半乳糖醛酸,這可能是其清除DPPH自由基能力最強的主要原因。

2.7 體外降血糖

2.7.1α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率 由圖5(a)可知,CWP-F和CWP-P有抑制α-淀粉酶的能力,且其抑制率隨質(zhì)量濃度的增加而增大(P<0.05),其中CWP-P的抑制能力最強,略低于阿卡波糖。CWP-F和CWP-P的IC50值分別為13.803 8,0.040 8 mg/mL。而CWP-S無抑制α-淀粉酶的能力。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

腸上皮細胞分泌的α-葡萄糖苷酶是將低聚糖水解為單糖的關(guān)鍵酶,α-葡萄糖苷酶抑制劑可以延緩膳食中碳水化合物的攝入,降低餐后高血糖,因此可以用于治療糖尿病[31]。由圖5(b)可知,CWP-F和CWP-P的抑制率與其濃度呈正相關(guān)(P<0.05),但明顯低于阿卡波糖,其IC50值分別為14.223 300,0.008 649 mg/mL,而CWP-S對α-葡萄糖苷酶無抑制力。

綜上,CWP-P抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的能力均顯著大于CWP-F,而CWP-S無降血糖的能力。多糖具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用,可能與其高醛酸含量、高酯化程度和高相對分子質(zhì)量有關(guān)[32]。CWP-P具有最好的體外降血糖能力可能是其具有高半乳糖醛酸和高相對分子質(zhì)量。此外,抗糖尿病作用是通過抗氧化活性和保護胰腺組織實現(xiàn)的[33]。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)TFE和TTE(翻白草總黃酮提取物和總?cè)铺崛∥?通過減弱脂質(zhì)過氧化而引起抗氧化特性,從而影響脂質(zhì)特征并負責其抗糖尿病特性。CWP-P的降血糖活性高于CWP-F和CWP-S,可能是因為其抗氧化能力更高。而Chung等[35]認為,多糖具有降血糖作用,其作用機理可能是通過抑制淀粉水解成葡萄糖,延緩葡萄糖的吸收和運輸,從而降低血糖含量。

2.7.2α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制動力學 由圖5可知,CWP-S對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶無抑制能力,因此試驗只分析CWP-F和CWP-P對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

表3～表6和圖6為CWP-F、CWP-P對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型。由表3和圖6(a)可知,隨著CWP-F質(zhì)量濃度的增加,Km和Vmax逐漸減小,各質(zhì)量濃度的酶促反應速率擬合直線互相平行,說明CWP-F對α-淀粉酶為反競爭性抑制作用,即CWP-F不能與游離的α-淀粉酶結(jié)合,只能在酶和底物結(jié)合成復合物后再與酶結(jié)合而抑制酶活性[36]。

圖6 CWP-F和CWP-P的抑制動力學

表3 CWP-F抑制α-淀粉酶的Vmax和Km值

由表4和圖6(b)可知,隨著CWP-P質(zhì)量濃度的增加,Km和Vmax同時減小,各質(zhì)量濃度的酶促反應速率擬合直線相交于第3象限,說明CWP-P對α-淀粉酶為非競爭性和反競爭性的混合型抑制[22]。其中,Ki值為0.107 9,Kis值為0.041 0,說明CWP-P更傾向于與α-淀粉酶—底物復合物結(jié)合。

表4 CWP-P抑制α-淀粉酶的Vmax和Km值

由表5和圖6(c)可知,隨著CWP-F質(zhì)量濃度的增加,Km逐漸增大,Vmax逐漸減小,各質(zhì)量濃度的酶促反應速率擬合直線相交于第2象限,說明CWP-F對α-葡萄糖苷酶為競爭性和非競爭性的混合型抑制。其中,Ki值為10.901 6,Kis值為21.524 8,說明CWP-F更傾向于與游離的α-葡萄糖苷酶結(jié)合。

表5 CWP-F抑制α-葡萄糖苷酶的Vmax和Km值

由表6和圖6(d)可知,隨著CWP-P質(zhì)量濃度的增加,Km不變,Vmax逐漸減小,各質(zhì)量濃度的酶促反應速率擬合直線相交于x軸,說明CWP-P對α-葡萄糖苷酶為非競爭性抑制作用[37]。

表6 CWP-P抑制α-葡萄糖苷酶的Vmax和Km值

3 結(jié)論

從黃皮不同部位提取的果肉多糖(CWP-F)、果皮多糖(CWP-P)和種子多糖(CWP-S)的理化指標、結(jié)構(gòu)和活性存在顯著差異(P<0.05),其中,CWP-F多糖含量最高,相對分子量最大,單糖組成主要為半乳糖,體外抗氧化和降血糖能力居中;CWP-P多糖含量最低,單糖組成主要為半乳糖醛酸,體外抗氧化和降血糖能力最強;CWP-S多糖相對分子質(zhì)量最小,單糖組成主要為葡萄糖,體外抗氧化能力最弱,無降血糖能力;CWP-F和CWP-P對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型不同,表明多糖的結(jié)構(gòu)特征會影響其體外抗氧化和體外降血糖活性,但還需深入探究。此外,CWP-P具有良好的抗氧化和降血糖活性。因此,CWP-P可以作為一種新的抗氧化劑和潛在輔助治療2型糖尿病的功能性食品。