金昱，梁麗娜，李佳賢，周維，許凱

如今，中醫(yī)眼科學(xué)的研究不再局限于以經(jīng)典校注、病證結(jié)合、辨證論治和臨床觀察為主的傳統(tǒng)模式，也發(fā)展出了運(yùn)用設(shè)計(jì)良好的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床循證研究相結(jié)合的現(xiàn)代科研體系。中醫(yī)證候動(dòng)物模型在中醫(yī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)有了很大發(fā)展，而動(dòng)物光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）、眼底彩照等活體指標(biāo)的應(yīng)用讓中醫(yī)眼科學(xué)的基礎(chǔ)研究又向前邁進(jìn)一步，其中，視覺電生理檢查是對(duì)眼功能活體指標(biāo)的豐富。臨床常用的視覺電生理檢查項(xiàng)目包括視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）、視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）、多焦視網(wǎng)膜電圖（multifocal electroretinogram，mf ERG）和眼電圖（electro-oculography，EOG），ERG 又可分為閃光ERG 和圖形ERG。ERG 可用于研究各種視網(wǎng)膜疾病及其潛在機(jī)制，如視網(wǎng)膜色素變性、慢性高眼壓[1]、視神經(jīng)病變[2-3]、青光眼[4]等，也可作為評(píng)判藥物及干預(yù)措施療效的重要指標(biāo)、用于研究視網(wǎng)膜的基本生理學(xué)?？蛇M(jìn)行ERG 實(shí)驗(yàn)的物種多樣，包括嚙齒動(dòng)物[5]、貓、狗、家兔[6]和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。但該活體結(jié)果的采集在操作中具有較大難度，電極、麻醉狀態(tài)、刺激強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間等檢測(cè)條件的變化，使得ERG 產(chǎn)生的波形會(huì)出現(xiàn)基線不穩(wěn)、雜波較多等情況，影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)分析造成困擾，故檢測(cè)時(shí)常建議雙眼對(duì)照檢查，如何提高ERG 結(jié)果的穩(wěn)定性這一問(wèn)題亟待解決?；诖耍疚膶?duì)眼科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中影響ERG結(jié)果穩(wěn)定性的因素進(jìn)行綜述，并論述相應(yīng)的解決方案，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 影響ERG穩(wěn)定性的因素及解決方案

1.1 電極

劣質(zhì)電極會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定或有噪聲的波形[7]。YIP YWY等[8]將帶有放大器的定制活性電極與標(biāo)準(zhǔn)惰性ERG 電極記錄下的電圖質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，對(duì)動(dòng)物注射氯胺酮、甲苯噻嗪和乙酰托馬嗪麻醉，在所有超閾值刺激強(qiáng)度下，活性電極的暗適應(yīng)a波、b波振幅較高，但僅在-3.25～-1.00 log cd.s.m-2范圍內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；明適應(yīng)也有相同趨勢(shì)，在-0.75～0.48 log cd.s.m-2范圍內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與惰性電極相比，活性電極的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和重復(fù)系數(shù)（coefficient of repeatability，CR）較低，a 波、b 波參數(shù)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intra-class correlation coefficient，ICC）較高，噪聲顯著降低，可在較低的刺激強(qiáng)度下記錄信號(hào)，即活性電極的重復(fù)性、重現(xiàn)性和可靠性均較好。

BAYER AU 等[9]使用成年C57 BL/6小鼠和Wistar大鼠進(jìn)行ERG 檢測(cè)（Ganzfeld 或頻閃光刺激的暗適應(yīng)及明適應(yīng)），對(duì)便捷程度、角膜上皮損傷程度、參數(shù)的幅度、再現(xiàn)性、雙眼準(zhǔn)確性和可靠性等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。電極選用單極金絲隱形透鏡電極（contact lens electrode，CLE）、棉芯銀-氯化銀電極（cotton-wick silver-silver chloride electrode，CSCE）、DTL 纖維電極（DTL fiber electrode，DTLE）和圓形不銹鋼絲電極（stainless steel wire electrode，SSE），并觀察安裝電極的難易程度，使用熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA）評(píng)估ERG 記錄后動(dòng)物角膜的磨損情況。結(jié)果顯示，CLE 電極具有較大的暗視振幅和振蕩電位，并且在分析測(cè)試-再測(cè)試數(shù)據(jù)時(shí)，顯示出最佳的一致性。然而，安裝CLE 電極所需時(shí)間最長(zhǎng)。使用SSE 電極會(huì)導(dǎo)致小鼠角膜磨損最嚴(yán)重，而CLE 電極則幾乎不會(huì)造成大鼠角膜損傷，并且允許長(zhǎng)時(shí)間操作。因此，使用CLE電極可以獲得較大的振幅和更高的再現(xiàn)性，但正確放置電極在角膜上的位置非常重要。國(guó)際臨床視覺電生理學(xué)會(huì)（international society for clinical electrophysiology of vision，ISCEV）編寫的《ISCEV 全視野臨床視網(wǎng)膜電圖標(biāo)準(zhǔn)（2015年）》[10]建議電極的位置與角膜或附近的球結(jié)膜接觸。研究[11]顯示，振幅隨電極距離角膜頂點(diǎn)的距離增大而減小。1 項(xiàng)臨床試驗(yàn)[12]招募了13 名年齡在13～64 歲之間的正常對(duì)照受試者（視力均為1.0），當(dāng)DTLE放置在結(jié)膜囊深處時(shí)，閃爍光反應(yīng)降低約20%～25%；在角膜上時(shí)，差異范圍為8%～27%；在結(jié)膜穹窿中時(shí)，差異范圍為10%～25%。故研究者認(rèn)為，應(yīng)確保在多次記錄中將電極放置在相同位置，記錄期間盡量保持其穩(wěn)定且不移動(dòng)，而電極本身放置位置對(duì)ERG的診斷準(zhǔn)確性影響較小。

解決方案參考如下，（1）選擇高質(zhì)量的電極：使用定制的活性ERG 電極，其噪聲較少，可以記錄較低刺激強(qiáng)度下的反應(yīng)，產(chǎn)生更大的信號(hào)幅度且具有可重復(fù)性。目前，美國(guó)Diagnosys 公司的ESPION 型視覺電生理檢測(cè)系統(tǒng)已應(yīng)用于臨床[13-14]，可以進(jìn)行多種檢測(cè)，包括VEP、mfERG。其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[15]可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求使用不同的電極，碗狀電極能夠緊貼角膜表面，而且無(wú)需接地線，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程。（2）合理放置電極：在記錄過(guò)程中，要確保電極每次的位置固定并緊密貼合角膜，避免空泡，減少噪聲和不穩(wěn)定性。同時(shí)，要注意保護(hù)角膜，可以使用玻璃酸鈉滴眼液、羧甲基纖維素鈉滴眼，以減輕電極對(duì)角膜損傷并降低干擾。

1.2 介質(zhì)的應(yīng)用

在大鼠ERG 記錄中，常使用玻璃酸鈉滴眼液或0.9%氯化鈉溶液等導(dǎo)電液介質(zhì)來(lái)提高導(dǎo)電性，減少金屬電極對(duì)角膜上皮的損傷。然而，在實(shí)際操作中，過(guò)量使用玻璃酸鈉滴眼液可能會(huì)影響電信號(hào)。戴旭鋒等[16]將大鼠分為干燥組、適量組和過(guò)量組，適量組滴加了少量玻璃酸鈉滴眼液，但保持角膜基本干燥；過(guò)量組滴加了大量玻璃酸鈉滴眼液，使整個(gè)結(jié)膜囊充滿。實(shí)驗(yàn)設(shè)置暗適應(yīng)ERG 的刺激強(qiáng)度為3.0 cd·s·m-2，單次閃光刺激持續(xù)時(shí)間5 ms，刺激之間間隔1 min，通頻帶設(shè)置為1～100 Hz，觀察了b 波峰時(shí)和幅值。結(jié)果顯示，干燥組的電圖基線不穩(wěn)定，適量組和過(guò)量組的基線相對(duì)穩(wěn)定，但過(guò)量組中有2 只大鼠出現(xiàn)波形阻滯情況。b 波峰時(shí)3 組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在幅值方面，干燥組和適量組沒有明顯差異，但過(guò)量組的波幅較另外2 組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

解決方案參考如下，玻璃酸鈉滴眼液的使用確實(shí)可以降低干擾，但過(guò)量使用會(huì)影響ERG 振幅大小。因此，在ERG 檢測(cè)過(guò)程中，導(dǎo)電液的使用量以保持球結(jié)膜和瞼結(jié)膜微微濕潤(rùn)為宜。

1.3 電噪聲與次聲

來(lái)自環(huán)境或其他設(shè)備的電噪聲會(huì)干擾電生理檢測(cè)，導(dǎo)致波形不穩(wěn)定或有噪聲，如邱萍等[17]給予實(shí)驗(yàn)組大鼠8 Hz、130 dB 的SPL 的次聲暴露，并在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行電生理檢測(cè)，次聲壓力艙艙內(nèi)各空間點(diǎn)次聲的頻率和聲壓級(jí)水平保持一致，該電激勵(lì)式次聲壓力艙系統(tǒng)為研究者自主研制。對(duì)照組每日置于次聲艙中不接受次聲暴露。結(jié)果顯示，在次聲暴露1 d后電生理改變以a波為主，而在4 d、7 d的電生理檢查中，b 波的下降反超a 波，暴露時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，振蕩電位（oscillatory potentials ，OPs）波的振幅異常成為主要變化，說(shuō)明次聲在不同的暴露階段對(duì)視網(wǎng)膜各層的影響不一。

解決方案參考如下，通過(guò)使用高質(zhì)量的電纜并正確連接設(shè)備，將電噪聲降至最低。檢測(cè)時(shí)應(yīng)無(wú)電噪聲源，如熒光燈等。

1.4 麻醉藥物

麻醉是許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的必要過(guò)程，針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)操作可以選擇不同的麻醉方式。846 合劑又稱速眠新注射液，是鹽酸二氫埃托啡和氟哌啶醇、賽拉唑、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的復(fù)方制劑，有鎮(zhèn)靜、催眠、肌松、鎮(zhèn)痛等綜合作用。侯豹可等[18]對(duì)比觀察了4 種麻醉藥物（速眠新846、烏拉坦、戊巴比妥、氯胺酮）對(duì)大鼠視覺電生理的影響，藥物均能達(dá)到全麻的效果，誘發(fā)出ERG 和VEP 的波形，但麻醉效果和波形存在差異。速眠新組進(jìn)入全麻狀態(tài)時(shí)間短，肌肉松弛作用好，麻醉持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，操作過(guò)程中狀態(tài)較穩(wěn)定，大鼠麻醉后眼球突出明顯，有利于放置角膜電極。烏拉坦、戊巴比妥麻醉起效時(shí)間長(zhǎng)，肌肉松弛作用一般。烏拉坦麻醉后，大鼠眼瞼不能完全張開，眼球不突出，放置角膜電極時(shí)可能存在困難。同時(shí)，該藥對(duì)生理狀態(tài)的影響較大，實(shí)驗(yàn)后2～3 d 大鼠仍處于頻繁昏睡狀態(tài)。使用氯胺酮麻醉效果不佳，肌肉松弛作用差，麻醉持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間檢查時(shí)需補(bǔ)藥。對(duì)于電生理數(shù)據(jù)（暗適應(yīng)ERG 光強(qiáng)為3.5 cd·s·m-2），烏拉坦的b 波潛伏期最長(zhǎng)，氯胺酮最短；速眠新組OPs O2波幅值最高，戊巴比妥組最低；明適應(yīng)ERG 和20 Hz 閃爍反應(yīng)氯胺酮組b 波幅值最高，閃光視覺誘發(fā)電位烏拉坦組大鼠P100潛伏期普遍較長(zhǎng)，氯胺酮組大鼠普遍較短。在小鼠實(shí)驗(yàn)中[19]，當(dāng)注射2.5 mg/kg 或5.0 mg/kg氟哌啶醇時(shí)，ERG 沒有顯著變化，注射量超過(guò)20 mg/kg 時(shí)b 波的振幅會(huì)顯著降低。與該結(jié)果類似的是，GJ?RLOFF K等[20]采用分級(jí)劑量的芬太尼（0.05～4.00 mL/kg）對(duì)家兔進(jìn)行麻醉，推薦誘導(dǎo)全身麻醉的劑量為0.50～1.00 mL/kg，1.00 mL/kg接近致死劑量。另有研究者探究氯胺酮與烏拉坦對(duì)家兔視覺電生理的影響[21]，二者在暗適應(yīng)OPs 波的比較中未見明顯差異，但氯胺酮暗適應(yīng)b 波潛伏期和a 波幅值較低，O2幅值、明適應(yīng)b波幅值和30 Hz閃爍反應(yīng)P2幅值均較高。

解決方案參考如下，麻醉狀態(tài)不佳會(huì)影響動(dòng)物的自主呼吸節(jié)律，肌肉無(wú)法放松，對(duì)電生理波形穩(wěn)定性非常不利。麻醉方案應(yīng)針對(duì)動(dòng)物物種及個(gè)體進(jìn)行優(yōu)化，在整個(gè)記錄過(guò)程中監(jiān)測(cè)麻醉深度。文獻(xiàn)[18]報(bào)道稱采用速眠新846 全麻狀態(tài)時(shí)間短，肌松作用好，麻醉持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，大鼠麻醉后眼球突出明顯，有利于加裝角膜電極，在進(jìn)行電生理檢查的過(guò)程中較穩(wěn)定。動(dòng)物麻醉加入肌肉松弛劑、鎮(zhèn)靜劑的復(fù)合麻醉劑利于實(shí)驗(yàn)者操作及檢驗(yàn)過(guò)程的平穩(wěn)進(jìn)行。

1.5 刺激光頻率和光強(qiáng)度

在蛙眼及人眼中，去除視桿系統(tǒng)對(duì)視錐系統(tǒng)的抑制，明適應(yīng)閃光ERG 的幅值增高[22]。有研究[23]將大鼠明適應(yīng)10 min 后（背景光強(qiáng)37.00 cd·s·m-2），記錄不同刺激頻率和不同刺激光強(qiáng)下的ERG 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)低頻（≤10 Hz）時(shí)視桿系統(tǒng)的活動(dòng)會(huì)夾雜在電生理反應(yīng)中，隨頻率的升高而減少；但頻率≥25 Hz 時(shí)，波形不再穩(wěn)定且幅值較低。改變刺激光強(qiáng)度，波幅會(huì)有規(guī)律性改變，在低于3.5 cd·s·m-2時(shí)，呈正相關(guān)。因此，該研究者認(rèn)為在明適應(yīng)閃爍ERG 檢查中，應(yīng)用15～20 Hz 光頻率、3.5 cd·s·m-2的刺激光強(qiáng)度分離出的視錐系統(tǒng)功能較好。該研究團(tuán)隊(duì)[24]通過(guò)改變不同通頻帶和不同光強(qiáng)刺激，探討小鼠ERG 的OPs 檢查最適合的通頻帶及閃光強(qiáng)度，先在不同通頻帶下記錄OPs，找出小鼠最適宜指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上，改變光強(qiáng)度，再次記錄OPs。結(jié)果顯示，在通頻帶75～300 Hz時(shí)，OPs幅值和潛伏期最為穩(wěn)定；OPs幅值與光照強(qiáng)度呈正相關(guān)，而O2波的潛伏期呈縮短趨勢(shì)，在2.0 cd·s·m-2（標(biāo)閃）光強(qiáng)條件下相對(duì)穩(wěn)定。

解決方案參考如下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體環(huán)境確定波形最穩(wěn)定的光頻率及光強(qiáng)度，可參考文獻(xiàn)[23]中數(shù)據(jù)：大鼠應(yīng)用15～20 Hz 頻率、3.5 cd·s·m-2強(qiáng)度的刺激光；小鼠視覺電生理檢查時(shí)[24]，其振蕩電位的閃光強(qiáng)度應(yīng)為2.0 cd·s·m-2（標(biāo)閃），通頻帶應(yīng)為75～300 Hz。

1.6 眼球運(yùn)動(dòng)偽影

動(dòng)物的眼球運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致電極移動(dòng)，影響波形穩(wěn)定。猜測(cè)是由于眼球運(yùn)動(dòng)影響角膜電極與角膜貼合緊密度，二者間產(chǎn)生空隙，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)出現(xiàn)波動(dòng)。

解決方案參考如下，為了最大限度地減少眼球運(yùn)動(dòng)造成的影響，檢測(cè)過(guò)程中穩(wěn)定動(dòng)物的頭部和眼睛至關(guān)重要，可以使用定制的頭部固定器或咬桿來(lái)達(dá)到固定目的。

1.7 信號(hào)放大不足

該因素屬于系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置問(wèn)題，如果信號(hào)放大不足，則記錄的波形可能過(guò)于微弱或嘈雜，無(wú)法進(jìn)行分析。

解決方案參考如下，可以通過(guò)調(diào)整設(shè)備上的參數(shù)來(lái)優(yōu)化放大信號(hào)，可能需要增加信號(hào)處理軟件中的放大倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)環(huán)境調(diào)整具體參數(shù)，建立自身的最適宜、最穩(wěn)定的參數(shù)指標(biāo)。

1.8 時(shí)間節(jié)律

由于嚙齒類動(dòng)物存在特殊的時(shí)間節(jié)律，有研究[25]選取昆明小鼠、BABL/C 小鼠和C57BL/6J小鼠，測(cè)量小鼠在6個(gè)時(shí)間區(qū)間（4:00～8:00、8:00～12:00、12:00～16:00、16:00～20:00、20:00～24:00、24:00～4:00）的ERG 數(shù)據(jù)，按照《ISCEV 全視野臨床視網(wǎng)膜電圖標(biāo)準(zhǔn)（2022 年）》[26]中的方案，記錄暗適應(yīng)ERG、最大混合反應(yīng)、明適應(yīng)的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，小鼠在夜間活動(dòng)頻繁，進(jìn)入麻醉狀態(tài)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)；ERG 也表現(xiàn)出較為規(guī)律的節(jié)律性，其中b 波幅值在20:00～24:00 達(dá)到最高，4:00～8:00 開始下降，在12:00～16:00 幅值最低。但明適應(yīng)b 波和暗適應(yīng)b波節(jié)律性相反。這可能與小鼠這一物種的活動(dòng)規(guī)律有關(guān)，可見時(shí)間節(jié)律能影響小鼠視覺電生理檢查的穩(wěn)定性。

解決方案參考如下，為了便于實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的對(duì)比，小鼠電生理檢查時(shí)應(yīng)考慮時(shí)間節(jié)律對(duì)視覺電生理的影響，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量保證在同一時(shí)間段檢測(cè)ERG。

1.9 患視網(wǎng)膜疾病的動(dòng)物

視網(wǎng)膜變性動(dòng)物的視網(wǎng)膜細(xì)胞可能無(wú)法產(chǎn)生穩(wěn)定的電信號(hào)，從而導(dǎo)致波形不穩(wěn)定[27]。

解決方案參考如下，在患有視網(wǎng)膜疾病的動(dòng)物模型[28]中，可能需要使用不同的記錄技術(shù)或調(diào)整記錄參數(shù)以獲得可靠的記錄。

2 小結(jié)

為提高數(shù)據(jù)的可靠性，在動(dòng)物ERG 檢測(cè)的過(guò)程中，首先應(yīng)確保周圍環(huán)境安靜，減少環(huán)境噪聲及電噪聲；麻醉藥物應(yīng)在安全的同時(shí)保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉松弛，呼吸有節(jié)律，麻醉時(shí)間保證能夠完成ERG 檢測(cè)全過(guò)程。其次，連接設(shè)備時(shí)應(yīng)確保電極與動(dòng)物角膜緊密貼合，并盡量保證每次電極放置位置相同，導(dǎo)電液以角膜結(jié)膜濕潤(rùn)為宜。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類不同及具體實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，摸索最適宜的通頻帶、光照頻率及強(qiáng)度，分析相關(guān)的軟件參數(shù)，最大可能保證在同一時(shí)間段對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行ERG 檢測(cè)。通過(guò)以上措施，可以提高動(dòng)物視網(wǎng)膜電生理結(jié)果的質(zhì)量和可靠性。此外，仔細(xì)分析和解釋記錄也顯得尤為重要。應(yīng)結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用合理的分析方法得出結(jié)論。未來(lái)在中醫(yī)眼科學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，研究者們要充分利用OCT、FFA、ERG 等活體指標(biāo)來(lái)檢測(cè)視網(wǎng)膜功能，完善實(shí)驗(yàn)操作步驟獲取最穩(wěn)定可靠的結(jié)果，豐富基礎(chǔ)理論研究，推動(dòng)中醫(yī)眼科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。