郭理想，楊婕妤，龍明秀，馬文雪，岳佳銘，劉 潔，臧 琳，呼天明，何樹斌

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類廣泛分布的土壤微生物，與超過80%的陸生植物根系形成共生關(guān)系[1-2]。AMF能夠增強宿主植物對磷(P)和氮(N)等營養(yǎng)元素的吸收，作為回報宿主植物為AMF提供光合產(chǎn)物碳(C)[3]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是我國栽培面積最大的豆科牧草之一，有“牧草之王”的美譽[4]，在水土流失較為嚴重的黃土高原地區(qū)，紫花苜蓿不但是優(yōu)良的家畜飼料，同時由于發(fā)達的根系和較長的生長期，其生態(tài)功能也尤為突出[5-6]。根瘤菌(rhizobium,R)是紫花苜蓿的天然共生固氮細菌，能夠促進紫花苜蓿的生長，增加土壤肥力[7]。因此，在自然界中，紫花苜蓿同時能夠與AMF和根瘤菌形成共生體[8-10]。AMF與紫花苜蓿的共生能夠增加紫花苜蓿P和N等營養(yǎng)物質(zhì)的含量[9]，增強光合碳(C)同化的能力[10]。研究表明，AMF與豆科植物的共生能夠通過延緩干旱脅迫下根瘤的衰老[11]提高宿主植物滲透調(diào)節(jié)能力[12]和活性氧清除能力[13]等，進而提高宿主植物的抗逆性[14]。值得注意的是，AMF供給宿主植物P和N等營養(yǎng)物質(zhì)的有益促生機制是以菌根消耗光合產(chǎn)物C為前提的，因此，掌握AMF對紫花苜蓿共生體中C、N和P等營養(yǎng)物質(zhì)的影響規(guī)律，有助于進一步闡明共生體內(nèi)C的消耗與N、P營養(yǎng)物質(zhì)的偶聯(lián)關(guān)系。

生態(tài)化學(xué)計量學(xué)(ecological stoichiometry)是一門用于研究有機體和其生態(tài)環(huán)境中多個元素動態(tài)變化、循環(huán)和相互作用的學(xué)科[15]。近年來，生態(tài)化學(xué)計量學(xué)被廣泛應(yīng)用在全球氣候變化[15]、植物種群結(jié)構(gòu)[16]、植物對環(huán)境的響應(yīng)[17]及土壤限制性營養(yǎng)元素判定等[18]研究中。也有研究運用生態(tài)化學(xué)計量學(xué)的方法闡明了AMF共生體內(nèi)的C、N和P的轉(zhuǎn)移和分配機制[19]，評價了AMF侵染植物強于非侵染植物的競爭能力等[20]。但在不同水分條件下，應(yīng)用生態(tài)化學(xué)計量學(xué)的方法闡明AMF與紫花苜蓿體內(nèi)C的同化與N、P營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)移機制的研究還較少。此外，植物的根系和葉片處在完全不同的生境中，因此其理化屬性是完全不一樣的[21]，而紫花苜蓿葉片和根系中C、N和P等營養(yǎng)物質(zhì)對AMF影響是否存在一致性也未見報道。因此，本研究旨在研究AMF在干旱脅迫下對紫花苜蓿C、N和P等營養(yǎng)元素的積累及其生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征的影響規(guī)律，明確葉片和根系對AMF和水分響應(yīng)規(guī)律的異同，同時比較AMF與根瘤菌的雙接種與其單接種效益。本研究的開展將有助于進一步闡明AMF與紫花苜蓿共生體中C、N和P等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和交換機制，為深入挖掘AMF對紫花苜蓿的促生作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與方法

試驗選用紫花苜蓿(Medicagosativa)阿爾岡金(Algonquin)為供試植物。種子購于北京正道生態(tài)科技有限公司。供試AMF為地表球囊霉(Glomusversiforme)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(BGC)提供，菌根接種體由擴繁植物紫花苜蓿根段、菌絲、孢子和沙土的混合物組成。供試根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)菌株由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。試驗前用巴氏消毒液對溫室、苗床和所用花盆進行消毒處理。所用土壤取自田間耕作層，其主要營養(yǎng)成分如下：C(13.5 g·kg-1)、全N(1.26 g·kg-1)、NO3-(7.52 mg·kg-1)、NH4+(45.67 mg·kg-1)、全P(0.8 g·kg-1)、K(8.29 mg·kg-1)、Ca(92.85 mg·kg-1)、Na(138.39 mg·kg-1)。土壤裝盆前，預(yù)先過篩，在170 ℃的烘箱內(nèi)高溫滅菌48 h。挑選飽滿、均一且健康的紫花苜蓿種子，用濃度為0.1%的NaClO消毒2 min，蒸餾水清洗干凈后放在培養(yǎng)皿中發(fā)芽。在4 ℃的暗環(huán)境中發(fā)芽3～4 d。選取生長均一的幼苗移栽到裝有2 kg土壤方盒內(nèi)(長20 cm，寬15 cm，高7 cm)，每盆移苗8株。移栽后的花盆放在溫度25 ℃/18 ℃(白天/黑夜)，相對濕度為40%，光周期為16 h/8 h(光/暗)的生長環(huán)境中。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)干旱35%±5%田間持水量(D)和正常水分70%±5%田間持水量(N)兩個水分梯度。在每個水分梯度下設(shè)置，單接種AMF(M)或R(R)、雙接種AMF和R(RM)及不接菌(CK)，每個處理有4盆重復(fù)。按照Gao等[22]的方法，移苗前向M和RM處理的土壤中每盆均勻混合AMF的混合物5 g(孢子數(shù)約60個·g-1)。在移栽后的前4周，每周用注射器將15 mL的R接種液(菌數(shù)約1.0×109個·mL-1)分3次注射進幼苗根際土壤中。移栽6周后，通過稱重法每隔2 d用蒸餾水補充植物蒸騰失水，使其處于不同的水分梯度下。處理4周后，測定其葉片和根系中營養(yǎng)物質(zhì)的含量。

1.3 測定項目及方法

從每個處理中隨機選取5株植物，根、莖和葉分離，105 ℃殺青約30 min后，在80 ℃的烘箱中烘干48 h后測定其根系和葉片的生物量。烘干的葉片和根系用球磨儀磨碎后用于測定其營養(yǎng)成分。用K2Cr2O7外加熱法測定植物樣品中有機碳的含量[23]。待測樣品H2SO4-H2O2消煮后，用AA3連續(xù)流動分析儀測定其全N和全K的含量[24]。消煮后的樣品用釩鉬黃比色法測定樣品全P的含量[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel處理，并用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計軟件進行分析，檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性、齊性和獨立性，最小顯著性差異法(LSD)對不同處理進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF和根瘤菌在不同水分條件下對紫花苜蓿生物量的影響

CK處理下，干旱脅迫顯著降低了紫花苜蓿各器官的生物量(P<0.05)。與CK相比，M、R和RM處理均顯著提高了干旱處理下紫花苜蓿莖、葉生物量的積累(P<0.05)，其中RM處理后，紫花苜蓿的生物量最高；而在正常水分條件下，M、R和RM處理均提高根系、莖和葉的干重，其中RM處理下的生物量最大(P<0.05)。在干旱與正常水分下， M、R和RM處理均顯著提高紫花苜蓿的根冠比(P<0.05)(表1)。

2.2 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系有機碳含量的影響

葉片和根系C含量分別為380～450和538～580 g·kg-1(圖1)。CK處理下，干旱脅迫顯著降低了葉片的C含量(P<0.05)，但對根系C含量沒有顯著影響(P>0.05)。與CK相比，M、R和RM處理顯著提高了干旱處理下葉片的C含量(P<0.05)，而在根系中差異不顯著(P>0.05),在正常水分條件下，與CK相比，M和R處理下葉片C含量顯著降低，在根系中R和RM處理顯著降低。

2.3 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系氮含量的影響

紫花苜蓿葉片和根系N含量分別為39.73～48.36和18.53～21.70 g·kg-1(圖2)。CK處理下，干旱脅迫顯著降低了紫花苜蓿葉片和根系的N含量(P<0.05)。M、R和RM處理均較CK提高了干旱處理下葉片的N含量，且依次表現(xiàn)為RM>M>R。但在正常水分下，僅有RM處理顯著提高了其葉片的N含量(P<0.05)。在干旱條件下，與CK相比，M處理的根系N含量顯著降低(P<0.05)。

表1 AMF和根瘤菌對不同水分條件下紫花苜蓿單株生物量的影響Table 1 Effect of AMF and rhizobium on the biomass per plant of alfalfa under different water conditions

同列不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。CK，對照；M，單接種叢枝菌根真菌處理；R，根瘤菌處理；RM，雙接種處理。下同。

Different lowercase letters withni the same column indicate significant differences among treatments and control at the 0.05 level. CK, control; M, plants cultivated AMF; R, rhizobia; RM, plants dual inoculation with AMF and rhizobia. similarly for the following figures.

圖1 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系C含量的影響Fig. 1 Effect of AMF and rhizobium on C contents of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level; similarly for the following figures.

圖2 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系N含量的影響Fig. 2 Effect of AMF and rhizobium on N contents of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

2.4 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系磷含量的影響

總體來看，紫花苜蓿葉片和根系P含量分別為2.1～3.0 g·kg-1和根系1.0～2.0 g·kg-1(圖3)。干旱脅迫顯著降低了根系P含量(P<0.05)，但對葉片P沒有較為明顯的影響。正常水分下，M處理顯著提高了根系P的含量(P<0.05)，但RM處理顯著降低了根系P含量(P<0.05)；在干旱脅迫下，僅RM處理有提高根系P含量的趨勢。

2.5 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系鉀含量的影響

葉片和根系K含量分別為23.17～27.03和8.5～11.4 g·kg-1(圖4)。CK處理下，干旱脅迫顯著降低了葉片和根系的K含量(P<0.05)，且在根系較為明顯。M、R處理均提高了干旱脅迫下紫花苜蓿葉片K的含量，且在R處理下差異顯著(P<0.05)；而在正常水分條件下，R和RM處理對紫花苜蓿葉片K無顯著影響(P>0.05)。在正常水分條件下，M和RM處理降低了根系K的含量，但在R處理下卻顯著提高了K的含量(P<0.05);而在干旱脅迫下，僅M處理根系K含量顯著低于CK(P<0.05)。

2.6 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系C/N的影響

紫花苜蓿葉片和根系的C/N分別為9.1～10.1和25.4～30.5，葉片C/N波動較根系相對較小(圖5)。CK處理下，干旱脅迫降低了葉片和根系C/N。在正常水分下，M、R和RM處理均降低了葉片C/N；而在干旱脅迫下，M、R和RM處理均提高了葉片C/N，只是差異不顯著(P>0.05)。根系和葉片C/N與對微生物接種和水分的響應(yīng)規(guī)律較為相似。

圖3 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系P含量的影響Fig. 3 Effect of AMF and rhizobium on P contents of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

圖4 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系K含量影響Fig. 4 Effect of AMF and rhizobium on K contents of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

圖5 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系C/N的影響Fig. 5 Effect of AMF and rhizobium on C/N of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

2.7 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系N/P的影響

葉片和根系N/P分別為16.3～18.6和11.6～17.1(圖6)。CK處理下，干旱脅迫顯著降低了葉片N/P(P<0.05)，但對根系N/P沒有顯著影響(P>0.05)。與CK相比，M、R和RM處理均提高了干旱脅迫下葉片的N/P；而在正常水分下，R和RM處理均降低了葉片的N/P。此外，R和RM處理均顯著降低了兩個水分處理下根系的N/P(P<0.05)。

2.8 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系C/P的影響

葉片和根系的C/P為148～180和298～480(圖7)。CK處理下，干旱脅迫顯著降低了葉片的C/P，但顯著提高了根系的C/P(P<0.05)。M、R和RM處理均提高了干旱處理下葉片和根系的C/P，且R>M>RM；而在正常水分下，所有接種處理均降低了根系中的C/P。

圖6 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系N/P的影響Fig. 6 Effect of AMF and rhizobium on N/P of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

圖7 AMF和根瘤菌在不同水分下對紫花苜蓿葉片和根系C/P的影響Fig. 7 Effect of AMF and rhizobium on C/P of alfalfa in leaves and roots under different water conditions

3 討論

干旱脅迫是限制牧草生產(chǎn)的重要因素之一。本研究中干旱脅迫降低了紫花苜蓿生物量及葉片C、N和K的含量。這可能是，一方面干旱脅迫降低了紫花苜蓿葉片的膨壓和氣孔導(dǎo)度，影響了葉片光合作用C的同化[25]；另一方面，干旱脅迫不但降低了土壤養(yǎng)分有效性[22]，而且還限制了生物固N的能力[26]。本研究中干旱脅迫雖然沒有影響紫花苜蓿葉片P的含量，但卻顯著降低了根系中P和K含量。這可能是土壤養(yǎng)分不足的情況下，儲藏在根系中的營養(yǎng)物質(zhì)會被轉(zhuǎn)運到地上[27]及干旱脅迫下營養(yǎng)元素利用效率提高[28]等原因造成的。

本研究中根瘤菌不但促進了兩個水分處理下紫花苜蓿生物量的積累，還提高了葉片N、根系C和K的含量，這進一步說明根瘤菌作為紫花苜蓿的天然共生菌，能夠促進宿主植物的生長[7]。但本研究中紫花苜蓿的葉片和根系在不同水分條件下對根瘤菌的響應(yīng)規(guī)律也不完全一致，這可能是微生物與宿主植物之間的共生效益受到接種量、宿主植物生長期及土壤N和P營養(yǎng)物質(zhì)有效性等因素的影響[29]。大量研究已證實，AMF能夠通過延緩干旱脅迫下根瘤的衰老[11]、提高宿主植物滲透調(diào)節(jié)能力[12]和活性氧清除能力[13]等方式，從而改善干旱脅迫下豆科植物的生長環(huán)境，促進其C、N的代謝[9-10]，這與本研究的結(jié)果AMF促進了干旱脅迫下紫花苜蓿體內(nèi)的C、N含量的增加，提高生物量的結(jié)果是一致的。此外，本研究中AMF均顯著提高了兩個水分處理下紫花苜蓿葉片和根系中P元素的含量。AMF促進植物吸收P的機制已經(jīng)被闡明，即大量AMF的根外菌絲通過增加了根系吸收營養(yǎng)的面積、改變了根圍的微生物組成、增強植物根際土壤中磷酸酶的活性等[30-31]。研究表明，AMF菌絲能夠增加共生植物對Ca和S等穩(wěn)定元素或微量元素的吸收[32-33]，但本研究并沒有發(fā)現(xiàn)AMF提高紫花苜蓿對K元素吸收的證據(jù)，這可能是由于物種及試驗條件的差異所導(dǎo)致。

C、N和P是生物有機體內(nèi)穩(wěn)定存在的最主要的3種元素，C/N/P的變化在一定程度上決定了有機體的功能和特點[34]。本研究中，干旱脅迫有增加紫花苜蓿葉片C/N的趨勢，這可能是干旱脅迫降低土壤N營養(yǎng)物質(zhì)的釋放及在植物根區(qū)的移動[35]，或者增加植物體內(nèi)木質(zhì)素含量等原因?qū)е耓36]。N/P反映了土壤養(yǎng)分有效性與植物對營養(yǎng)物質(zhì)需要之間的動態(tài)平衡[37]。干旱脅迫降低了土壤營養(yǎng)物質(zhì)有效性，限制了植物對的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[22,26]，故在本研究中干旱脅迫總體上提高了紫花苜蓿的N/P。C/P反映了植物在吸收P的同時進行光合C同化的能力[38]。干旱脅迫抑制了地上部分的生長速率，但植物傾向于將更多的資源分配到根系以維持根系的正常生長速率和較高的C/P[39]。因此，在本研究中盡管干旱脅迫降低了葉片的C/P，但增加了根系的C/P。研究表明，植物組織有能力維持相對保守的生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征[40]。因此，在本研究中干旱脅迫調(diào)節(jié)了紫花苜蓿葉片和根系C/N/P的變化，但是在一定的范圍內(nèi)。

本研究，AMF與植物相互作用最終能夠調(diào)節(jié)植物的生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征，本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果[19，41-42]一致，增加了宿主植物P和N含量，提高植物的生長速度是菌根影響其生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征的最主要原因。此外，本研究中，紫花苜蓿葉片和根系生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征對水分和AMF的響應(yīng)規(guī)律是不一致。這可能是由于植物的根系和葉片所處的生長環(huán)境的巨大差異，其資源的獲取，分配、儲藏能力是完全不一樣的[21]，其次，在營養(yǎng)物質(zhì)限制的環(huán)境中，植物營養(yǎng)物質(zhì)在葉片和根系之間能夠相互轉(zhuǎn)移和再分配的[43]。

研究表明，雙接種對宿主植物的促進作用要超過單一接種，這被認為是微生物之間相互兼容發(fā)生了協(xié)同增效作的效益[44-45]。本研究中，AMF對生物量、葉片N、P、K有較為明顯的雙接種協(xié)同增效的效益。盡管深層的原因有待進一步的闡明，但AMF和根瘤菌具有相同的形態(tài)學(xué)特征[46]和基因序列[47]，共生也具有相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等，這些都被認為是發(fā)生協(xié)同增效效益的重要機制之一。但本研究中，雙接種的協(xié)同增效的效益對所有的參數(shù)并不總是一致的，本研究結(jié)果與近期一項對大豆(Glycinemax)的研究結(jié)果是一致的[48]。相關(guān)研究表明，土壤營養(yǎng)物質(zhì)有效性、微生物之間的兼容性和宿主植物的生長期[49-50]等都會影響協(xié)同增效的效果。

4 結(jié)論

干旱脅迫是限制紫花苜蓿生物量、C同化、N和P營養(yǎng)元素吸收的重要的因素之一。AMF與紫花苜蓿的共生改善了宿主植物在干旱脅迫C的積累及N和P等資源的獲取能力，調(diào)節(jié)了宿主植物器官的生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征，從而影響植物與菌根共生體內(nèi)C、N和P等營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)等。由于紫花苜蓿的地上與地下部分所處的生態(tài)環(huán)境具有明顯的差異，所以葉片和根系對水分和AMF的響應(yīng)規(guī)律較為不一致。此外，雙接種僅在一些方面發(fā)揮了協(xié)調(diào)增效的作用，影響其協(xié)同增效的深層次的機制還有待于進一步闡明。

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