郭紹雷 許建蘭 張斌斌 張妤艷 沈志軍 馬瑞娟 俞明亮

摘要：篩選與鑒定參與調(diào)控桃果實(shí)采后貯藏過程衰老軟化相關(guān)代謝物質(zhì)，以深入了解桃果實(shí)采后衰老軟化相關(guān)生理生化機(jī)制。常溫貯藏條件下，萘乙酸處理可加速霞暉8號七成熟桃果實(shí)衰老軟化，采用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，檢測桃果實(shí)貯藏0、3、6 d代謝物質(zhì)的變化，選取差異倍數(shù)值（≥2或≤0.5），采用正交偏最小二乘判別分析模型所獲得的變量重要性投影值（≥1）的代謝物為差異代謝物。結(jié)果表明，在霞暉8號桃果實(shí)5組樣品中共檢測到816種代謝物，可被分為11類，其中檢測到酚酸類物質(zhì)160種，占比最高。通過比較在各分組中代謝物定量信息的差異倍數(shù)變化前10的代謝物，結(jié)合KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析，篩選并鑒定到可能參與桃果實(shí)軟化的各種代謝物29種，其中脂質(zhì)與酚酸類物質(zhì)鑒定到最多，各有7種。

關(guān)鍵詞：桃果實(shí)；衰老軟化；代謝組；差異代謝物

中圖分類號：S662.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0198-08

收稿日期：2023-10-23

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-30）；江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目（編號：JBGS[2021]082）。

作者簡介：郭紹雷（1988—），男，山東郯城人，博士，助理研究員，主要從事桃種質(zhì)資源與新品種選育工作。E-mail：guoshaolei0305@126.com。

通信作者：俞明亮，博士，研究員，主要從事桃種質(zhì)資源與新品種選育工作。E-mail：mly@jaas.ac.cn。

桃[（Prunus persica L.） Batsch]原產(chǎn)于中國，在世界多地廣泛栽種，依據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計（https：//www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL），2021年我國桃栽培面積和產(chǎn)量占全球比重超過50%，均位列世界第一。然而，桃是典型的呼吸躍變型水果。常溫下，成熟桃果實(shí)軟化迅速，不方便采運(yùn)，貨架期較短，果實(shí)易損耗^[1]，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，是制約我國桃產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的因素之一。桃果實(shí)衰老軟化相關(guān)機(jī)理的探究，將為桃果實(shí)采后保鮮技術(shù)的進(jìn)步及耐貯新品種的選育提供理論依據(jù)。

乙烯的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及下游的細(xì)胞壁降解，是存在于果實(shí)衰老軟化中的復(fù)雜生理生化過程^[2-4]。研究表明，乙烯可通過調(diào)控木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶、β-半乳糖苷酶、果膠甲酯酶以及多聚半乳糖醛酸酶等細(xì)胞壁降解相關(guān)酶活性，參與調(diào)控果實(shí)衰老軟化^[5-7]。還有研究表明，包括MADS-box、NAC、ERF等在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控乙烯生物合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響果實(shí)衰老軟化進(jìn)程^[8-9]。在桃果實(shí)中，多聚半乳糖醛酸酶是決定果實(shí)衰老軟化進(jìn)程的主要因素之一，通過外源乙烯處理桃果實(shí)，使多個多聚半乳糖醛酸酶家族基因成員的表達(dá)量，伴隨果實(shí)衰老軟化而顯著升高^[10]。乙烯響應(yīng)因子PpeERF2可與PpePG1啟動子結(jié)合，負(fù)調(diào)控PpePG1的表達(dá)，進(jìn)而影響桃果實(shí)成熟軟化^[11]。β-半乳糖苷酶與果實(shí)衰老軟化密切相關(guān)^[12]，桃β-半乳糖苷酶基因家族成員中PpBGAL2和PpBGAL16在不同肉質(zhì)桃常溫貯藏過程中差異表達(dá)^[13]，且PpBGAL16可能受乙烯誘導(dǎo)參與桃果實(shí)衰老軟化^[14]。Gu等的研究表明，桃PpHB.G7轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控PpACS1和PpACO1編碼酶ACS與ACO活性，影響乙烯生物合成，對桃果實(shí)的成熟軟化起作用^[15]。生長素與乙烯相互作用調(diào)控果實(shí)衰老軟化成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。噴施萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，簡稱NAA）可使硬質(zhì)桃迅速變軟，并提高乙烯生物合成中ACS1、ACS7與ACO3等基因的轉(zhuǎn)錄水平，增加乙烯釋放量^[16]。最近的研究表明，桃生長素響應(yīng)因子PpIAA1可調(diào)控PpACS1的表達(dá)，影響乙烯釋放量，而乙烯響應(yīng)因子PpERF4還可通過與PpACO1和PpIAA1啟動子結(jié)合，影響乙烯合成^[17]。桃生長素響應(yīng)因子PpARF6可結(jié)合PpACS1和PpACO1的啟動子，激活其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)乙烯的生物合成。蛋白水平上，PpARF6抑制PpEBF1/PpEBF2和PpEIL2/PpEIL3之間的相互作用，增強(qiáng)PpEIL2/PpEIL3蛋白穩(wěn)定性，對PpACS1和PpACO1的轉(zhuǎn)錄激活作用增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)乙烯合成^[18]。桃果實(shí)衰老軟化機(jī)制受多種因子調(diào)控，是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前，相關(guān)生理生化機(jī)制的研究大多集中在相關(guān)酶活的變化和關(guān)鍵基因調(diào)控研究。

廣泛靶向代謝組學(xué)通過建庫、檢測、分析等流程，完成對代謝物組分的鑒定和相對含量的分析，具有通量高、覆蓋廣、靈敏度與精度高的特點(diǎn)^[19-20]。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于桃^[21-22]、葡萄^[23]、冬棗^[24]、茶^[25]等園藝作物上。桃果實(shí)常溫貯藏過程代謝組學(xué)的研究還鮮有報道，缺乏相關(guān)系統(tǒng)的研究，相關(guān)代謝機(jī)理仍需探究。本研究選取七成熟桃果實(shí)常溫貯藏6 d，通過NAA處理加快果實(shí)軟化，采用基于液質(zhì)聯(lián)用的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，鑒定和比較分析常溫貯藏過程中代謝物組分和相對含量，為桃果實(shí)采后保鮮技術(shù)的發(fā)展及耐貯藏新品種的選育提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

本研究以桃品種霞暉8號果實(shí)為試驗材料，霞暉8號桃果實(shí)樣品取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所桃試驗園，常規(guī)栽培管理。試驗于2021年進(jìn)行，選取七成熟標(biāo)準(zhǔn)（果實(shí)完成膨大，底色未轉(zhuǎn)變）桃果實(shí)進(jìn)行采收，采收后立即運(yùn)回江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗室進(jìn)行貯藏試驗。選取大小均一、無病蟲傷害的完好桃果實(shí)用于常溫貯藏試驗。根據(jù)Tatsuki等的方法^[26]，對桃果實(shí)進(jìn)行NAA噴施處理，NAA噴施濃度為1 mmol/L（含0.01% Tween 20），對照組噴施0.01% Tween 20水溶液，噴施頻次間隔1 d。常溫貯藏試驗，溫度設(shè)為（25±1） ℃，相對濕度為75%～85%，貯藏0、3、6 d各取樣1次，對照組（CK，0、3、6 d），NAA處理組（NT，0、3、6 d），5個桃果實(shí)為1次重復(fù)，所有試驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。桃果實(shí)樣品先去皮，后切成大小均勻塊狀，經(jīng)液氮快速冷凍處理后，置于-80 ℃冰箱。

1.2? 硬度檢測

桃果實(shí)硬度檢測使用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，使用直徑為8 mm的探頭在桃果實(shí)樣品腹縫線兩側(cè)中間部位進(jìn)行檢測，檢測深度是5 mm，速率是 1 mm/s。

1.3? 代謝物提取

桃果實(shí)樣品先通過凍干機(jī)真空冷凍干燥，后將桃果實(shí)樣品磨成粉末。稱量0.100 g桃果實(shí)粉末，置于1.2 mL含70%甲醇的提取液中進(jìn)行溶解。對提取液進(jìn)行渦旋處理6次，頻次按照每30 min渦旋 0.5 min 進(jìn)行。渦旋處理后的提取液放于4 ℃冰箱過夜。離心后，吸取上清液，吸取的上清液使用0.22 μm微孔膜過濾，用于檢測。

1.4? 色譜質(zhì)譜方法

使用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（色譜儀，SHIMADZU Nexera X2；串聯(lián)質(zhì)譜，Applied Biosystems 4500 QTRAP）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。超高液相色譜使用的色譜柱為安捷倫SB-C₁₈，色譜柱的參數(shù)（1.8 μm，2.1 mm，100 mm）。其他液相色譜采集條件：分為A和B兩相，使用超純水（加入0.1%的甲酸）作為A相，使用乙腈（加入0.1%的甲酸）作為B相。洗脫梯度設(shè)置：開始后，B相占比5%，然后設(shè)置B相于 9 min 內(nèi)占比勻速增至95%，保持1 min，設(shè)置B相11.10 min內(nèi)占比減少至5%，并維持至14 min。液相色譜采集條件中，進(jìn)樣量4 μL，流速保持在 0.35 mL/min，柱溫保持在40 ℃。主要的質(zhì)譜條件：使用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS質(zhì)譜系統(tǒng)，配置電噴霧離子源。設(shè)定電壓5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負(fù)離子模式），源溫度設(shè)定為 550 ℃，簾氣參數(shù)設(shè)定為0.172 4 MPa，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)條件設(shè)定為高。

1.5? 代謝物定性定量分析

代謝物定性分析，以MWDB（Metware database）為數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)分析前需刪除包括含NH⁺₄、Na⁺、K⁺，與其他碎片離子在內(nèi)的各種重復(fù)信號，以及產(chǎn)生的同位素信號。然后依據(jù)獲得的二級譜信息，完成物質(zhì)的定性解析。通過三重四級桿質(zhì)譜儀中的多反應(yīng)監(jiān)測模式，進(jìn)行代謝物定量：目標(biāo)物質(zhì)的前體離子（母離子）最初利用四級桿獲得篩查，后使其經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后形成碎片離子，然后，利用三重四級桿繼續(xù)篩查，獲取1個特征碎片離子。數(shù)據(jù)分析，首先獲取桃樣品檢測到的物質(zhì)質(zhì)譜峰，后對其峰面積進(jìn)行積分。針對試驗中不同桃果實(shí)樣品中的同一個代謝物的質(zhì)譜出峰，進(jìn)行積分校正^[27]。

1.6? 數(shù)據(jù)處理與分析

確定差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)：代謝物的差異倍數(shù)值（Fold change，F(xiàn)C）≥2或≤0.5，采用正交偏最小二乘判別分析模型所獲得的變量重要性投影值（variable importance in projection，簡稱VIP）≥1^[28]。使用KEGG數(shù)據(jù)庫注釋和顯示差異代謝物^[29]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 桃果實(shí)常溫貯藏過程中硬度變化

霞暉8號七成熟桃果實(shí)隨常溫貯藏過程延長，對照組與NAA處理組硬度均下降。NAA處理后使霞暉8號七成熟果實(shí)硬度迅速下降，下降速度快于對照組（圖1）。

2.2? 桃果實(shí)常溫貯藏過程中代謝物種類鑒定

將七成熟桃果實(shí)噴施NAA常溫貯藏0、3、6 d，對照分別命名CK 0 d、CK 3 d、CK 6 d，處理組命名為NT 3 d、NT 6 d。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，在霞暉8號桃果實(shí)5組樣品中共檢測到816種代謝物，可被分為11類（表1）。其中檢測到酚酸類物質(zhì)160種，占比最高。脂質(zhì)、黃酮類、氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸占比較高。

2.3? 桃果實(shí)常溫貯藏過程各分組相對含量變化趨勢

為研究桃果實(shí)差異代謝物不同分組中的相對含量變化趨勢，將分組比較中的差異代謝物的相對含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，隨后進(jìn)行K均值聚類分析。如圖2所示，桃果實(shí)常溫貯藏過程中的代謝物相對含量變化趨勢共分為7組。第3組代謝物相對含量變化趨勢包含的差異代謝物有64種，該組中差異代謝物在對照組與處理組中均有上升趨勢，第5組中差異代謝物相對含量變化在對照組與處理組中均有下降趨勢，包含的差異代謝物有44種。各組所含代謝物數(shù)量有異同，其中第6組所含的差異代謝物也有64種，與第3組相同，第4組所含差異代謝物最少，只有8種。

2.4? 桃果實(shí)常溫貯藏過程中差異代謝物鑒定

比較在各分組中代謝物定量信息的差異倍數(shù)變化，鑒定對照組中的CK 0 d vs. CK 3 d、CK 3 d vs. CK 6 d，處理組中的CK 0 d vs. NT 3 d、NT 3 d vs. NT 6 d的差異代謝物，對上調(diào)前10位差異代謝物和下調(diào)前10位差異代謝物進(jìn)行分析。由圖3可見，在對照組2分組CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d上調(diào)前10位差異代謝物中共鑒定到19種代謝物，其中溶血磷脂酰膽堿18∶4在對照組2分組中均是上調(diào)前10位差異代謝物。對照組2分組中下調(diào)前10位差異代謝物中共鑒定到18種，其中松柏醇、1-甲基腺嘌呤在CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d 2分組中均是下調(diào)前10位差異

代謝物。處理組2分組中共鑒定到上調(diào)代謝物20種，2分組中上調(diào)前10位的差異代謝物均不相同。處理組2分組中下調(diào)前10位差異代謝物中共鑒定到18種，其中松柏醇、溶血磷脂酰膽堿16∶1（2n異構(gòu)）在處理組CK 0 d vs. NT 3 d與NT 3 d vs. NT 6 d 中均是下調(diào)前10位的差異代謝物。

對照組2分組鑒定到的19種與處理組2分組鑒定到的20種上調(diào)前10位差異代謝物取交集，共鑒定到10種代謝物：香蘭素乙酸酯、溶血磷脂酰膽堿16∶2（2n異構(gòu)）、溶血磷脂酰膽堿16∶2、溶血磷脂酰膽堿18∶4、水飛薊素、溶血磷脂酰膽堿19∶1、4-乙基苯甲醛、7-羥基-4-甲基-8-硝基香豆素、10-羥基癸酸、5-甲氧基水楊酸。對照組2分組（18種）與處理組2分組（18種）下調(diào)前10位差異代謝物取交集，共鑒定到7種代謝物：松柏醇、溶血磷脂酰膽堿16∶1（2n異構(gòu)）、溶血磷脂酰膽堿 18∶1 （2n異構(gòu)）、2-羥基肉桂酸、丁香酸、L-甲硫氨酸、1-甲基腺嘌呤。鑒定到的代謝物信息見表2。

2.5? KEGG信號通路的差異代謝物聚類熱圖分析

KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析是根據(jù)差異代謝物的KEGG注釋信息，選擇至少含有5個差異代謝物的KEGG代謝通路，對所選的KEGG代謝通路中的差異代謝物的相對含量進(jìn)行聚類分析，挖掘重要代謝通路中的代謝物在不同分組中的特性。由KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析（圖4），發(fā)現(xiàn)在對照組2分組CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d中共有上調(diào)代謝物7種，其中吲哚-3-乙酸同時在對照組2分組中上調(diào)。在對照組2分組中下調(diào)的代謝物共鑒定到9種，其中松柏醇在CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d中均為下調(diào)。在處理組2分組中CK 0 d vs. NT 3 d與NT 3 d vs. NT 6 d的KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析中上調(diào)代謝物共鑒定到22種，其中迷迭香酸、腺苷在處理組2個分組中均有上調(diào)趨勢。處理組2分組中下調(diào)代謝物共鑒定到21種，其中松柏醇、2-羥基肉桂酸在處理組2分組CK 0 d vs. NT 3 d與NT 3 d vs. NT 6 d中均下調(diào)。

對照組2分組中的7種與處理組2分組中的22種有上調(diào)趨勢代謝物取交集，共鑒定到5種代謝物：脫落酸、對香豆醇、迷迭香酸、腺苷-5′-單磷酸、尿嘧啶核苷。對照組2分組（9種）與處理組2分組（21種）有下調(diào)趨勢代謝物取交集，共鑒定到8種代

謝物：腐胺、松柏醇、磷酸烯醇式丙酮酸、黃苷、2-羥基肉桂酸、阿魏酸、L-甲硫氨酸、2-（甲酰氨基）苯甲酸。在KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析中篩選得到的代謝物信息見表2。

本研究通過代謝物定量信息的差異倍數(shù)變化和KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析共鑒定到可能參與桃果實(shí)軟化的各種代謝物29種，其中脂質(zhì)類和酚酸類各有7種，核苷酸及其衍生物有5種，有機(jī)酸類3種，生物堿2種，黃酮、木脂素和香豆素、氨基酸及其衍生物各1種，其他類2種（表2）。

3? 討論與結(jié)論

桃是世界上栽培最為廣泛的落葉果樹之一，我國桃產(chǎn)業(yè)在世界占有重要地位，近年來在栽培面積和產(chǎn)量上一直占比超過全球50%。然而，桃作為典型的呼吸躍變型水果，成熟后極易軟化，貨架期較短，運(yùn)輸成本較高，損耗高^[1]，給種植者和銷售者帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。桃果實(shí)衰老軟化的調(diào)控仍是桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要應(yīng)對的問題，與種植者、生產(chǎn)者營收與產(chǎn)業(yè)發(fā)展都息息相關(guān)。開展桃果實(shí)衰老軟化相關(guān)理論的研究能為降低桃果實(shí)采后損耗提供理論基礎(chǔ)，對桃產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展有重要意義。

在所有的脂質(zhì)中，磷脂的種類豐富，也是構(gòu)成細(xì)胞膜最主要的脂類物質(zhì)。本研究7種脂質(zhì)相對含量的變化，可能與桃果實(shí)衰老軟化過程中細(xì)胞膜的分解有關(guān)。酚酸類物質(zhì)是主要的多酚類物質(zhì)之一。植物中的酚類物質(zhì)被認(rèn)為是重要的次生代謝物質(zhì)之一。研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)在植物抗病蟲害、抗逆等多方面發(fā)揮作用^[30]，同時在果實(shí)中也具有重要的抗氧化能力^[31-32]。本研究篩選鑒定的7種酚酸類代謝物種，迷迭香酸隨著桃果實(shí)貯藏軟化過程有上調(diào)趨勢，多數(shù)酚酸類物質(zhì)[松柏醇、2-羥基肉桂酸、丁香酸、阿魏酸、2-（甲酰氨基）苯甲酸]在桃果實(shí)貯藏軟化過程中有下調(diào)趨勢，對香豆醇則無明顯規(guī)律。朱辰暉等的研究表明，酚酸類物質(zhì)能激活桃果實(shí)中多種抗氧化酶，能增強(qiáng)桃果實(shí)的抗氧化能力；使用對羥基肉桂酸，桃果實(shí)多酚對DPPH·和羥自由基清除能力得到加強(qiáng)，桃果實(shí)的成熟衰老得到延緩^[33]。阿魏酸在柑橘抗氧化活性中被鑒定為主要作用物質(zhì)之一^[34]。因而這些酚酸類物質(zhì)含量可能隨著桃果實(shí)衰老軟化進(jìn)程逐漸減少，抗氧化活性減弱。吲哚-3-乙酸是常見的生長素類物質(zhì)，在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。Tatsuki等研究發(fā)現(xiàn)，硬質(zhì)桃在成熟后幾乎不釋放乙烯，且吲哚-3-乙酸含量極低，而普通桃有大量乙烯釋放，吲哚-3-乙酸含量較高，表明乙烯的生物合成可能需要生長素介導(dǎo)^[26]。硬質(zhì)桃中PpACS1的表達(dá)量和乙烯釋放量同時受NAA誘導(dǎo)增加，暗示吲哚-3-乙酸可介導(dǎo)乙烯合成^[35]。腐胺是植物體內(nèi)多胺的主要種類之一。研究表明，外源多胺處理可下調(diào)桃果實(shí)乙烯合成相關(guān)基因表達(dá)，上調(diào)多胺合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)果實(shí)多胺合成并降低乙烯釋放量和呼吸速率，延緩桃果實(shí)成熟衰老^[36]。張海燕等使用外源腐胺處理油桃，促使油桃超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶的活性提高，同時乙烯釋放量和呼吸釋放速率下降，果實(shí)硬度下降延緩^[37]。說明生物堿類物質(zhì)吲哚-3-乙酸與腐胺在桃果實(shí)衰老軟化過程中起到重要調(diào)控作用。研究表明，桃果實(shí)成熟過程中，內(nèi)源脫落酸的積累構(gòu)成了果實(shí)成熟的啟動信號，而脫落酸高峰的出現(xiàn)啟動了果實(shí)的后熟衰老進(jìn)程^[38]，本研究中脫落酸的相對含量變化趨勢符合上述結(jié)果。有研究表明，在桃果實(shí)成熟軟化過程中脫落酸可能也受到乙烯的調(diào)控，如乙烯可通過PpERF3調(diào)節(jié)脫落酸生物合成基因PpNCED2/3的表達(dá)從而促進(jìn)其生物合成^[39]。其他代謝物質(zhì)在桃果實(shí)衰老軟化進(jìn)程中如何發(fā)揮作用還需要更深入的研究。本研究使用廣泛靶向代謝組學(xué)方法分析鑒定了29種代謝物質(zhì)，可能參與桃果實(shí)軟化的進(jìn)程，將為桃果實(shí)衰老軟化過程中的代謝物質(zhì)研究提供參考。

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